การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน   Exon 11   และ  17  ของยีน  AE1   โดยการตรวจ   Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs...
ที่มาและความสำคัญ โรคไตผิดปกติในการขับกรด ( D istal Renal Tubular Acidosis  )  เป็นโรคที่พบได้บ่อยและเป็นปัญหาสาธารณสุขของ...
ที่มาและความสำคัญ สาเหตุของโรคนี้มี  2   หลักใหญ่คือ สิ่งแวดล้อมและพันธุกรรม -   สาเหตุจากสิ่งแวดล้อมที่มีการกล่าวถึง คือ ...
การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน  Exon 11   และ  17  ของยีน  AE1   โดยการตรวจ   Single Nucleotide Polymorphisms  ( SNP...
แผนการดำเนินงาน แผนการดำเนินงาน การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน  Exon 11   และ  17  ของยีน  AE1   โดยการตรวจ   Single...
ผลที่คาดว่าจะได้รับ <ul><li>ได้เรียนรู้การมิวเตชั่นในแต่ละจุดที่ถูกเลือกขึ้นมาศึกษา ของยีน  AE1 </li></ul><ul><li>ได้รู้ลำ...
Single Nucleotide Polymorphism (SNPs) http :// www . scq . ubc . ca / wp - content / uploads / 2006/07 / dna1 . gif http :...
ประเภทของ  Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) 1) SNP  ในส่วนที่มีการถอดรหัส  ( coding SNP ) 2) SNP  ในส่วนที่ไม่ถูกถอด...
SNPs Haplotype การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน  Exon 11   และ  17  ของยีน  AE1   โดยการตรวจ   Single Nucleotide Polym...
Polymerase Chain Reaction  หรือ  PCR Polymerase Chain Reaction  หรือ  PCR   เป็นเทคนิคสำหรับเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอโดยอาศัยหลั...
สารตั้งต้นที่ใช้ใน  PCR <ul><li>Deoxynucleotides  ( dNTPs )  เป็นนิวคลีโอไทด์ ซึ่งเป็นหน่วยย่อยสำหรับนำไปสังเคราะห์ดีเอ็นเ...
ขั้นตอน  PCR  ใน   1  รอบ http :// users . ugent . be / ~avierstr / principles / pcrsteps . gif การศึกษาและเปรียบเทียบการม...
http :// www . mun . ca / biology / scarr / PCR_sketch_3 . gif
http :// users . ugent . be / ~avierstr / principles / pcrcopies . gif การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน  Exon 11   และ...
การตรวจสอบมิวเตชั่นด้วย  PCR การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน  Exon 11   และ  17  ของยีน  AE1   โดยการตรวจ   Single Nu...
<ul><li>โครงงานex11-17_s1-s5(2). bmp </li></ul>การตรวจสอบมิวเตชั่นด้วย  RFLP การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน  Exon 11...
การตรวจสอบมิวเตชั่นด้วย วิธี  ASA อาศัยความจำเพาะของไพรเมอร์ในการทำ  PCR  โดยจะแบ่งไพรเมอร์เป็น  2   แบบ คือ   Normal Prim...
วัตถุประสงค์ของโครงงาน <ul><li>ศึกษาการมิวเตชั่นของยีนใน   Exon 11  และ  17  ของยีน  AE1 </li></ul><ul><li>ศึกษาและเปรียบเ...
วิธีการดำเนินงาน สกัด  DNA เก็บ  Stock DNA ตรวจสอบมิวเตชั่นโดย เทคนิค  PCR   ตรวจสอบมิวเตชั่นโดย เทคนิค  ASA   หาความเข้มข...
สกัด  DNA การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน  Exon 11   และ  17  ของยีน  AE1   โดยการตรวจ   Single Nucleotide Polymorphi...
สกัด  DNA Plasma Buffy coat RBC การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน  Exon 11   และ  17  ของยีน  AE1   โดยการตรวจ   Single...
สกัด  DNA การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน  Exon 11   และ  17  ของยีน  AE1   โดยการตรวจ   Single Nucleotide Polymorphi...
สกัด  DNA สกัด  DNA  โดยใช้  Phenol - Chloroform Method <ul><li>เจาะเลือด นำเลือดใส่หลอดทดลอง เติมสาร  Anticoagulant (EDTA...
สกัด  DNA <ul><li>เติม  RBC lysis buffer  1  เท่าของที่มีอยู่หรือจนเต็มหลอดทดลอง  ( เป็นสาร  Hypertonic solution   ซึ่งจะท...
สกัด  DNA <ul><li>เทสารข้างบนทิ้งให้หมดให้เหลือแต่  WBC   </li></ul><ul><li>เติม  RBC lysis buffer  ให้มีปรมาตรทั้งหมดเท่า...
สกัด  DNA <ul><li>ทำตามขั้นตอนที่  15-17   ซ้ำอีก  1-2   รอบ </li></ul><ul><li>เติม   TE 20-5  ปริมาณ  4   ml   ลงในหลอดที...
สกัด  DNA <ul><li>เติม  Phenol(saturate   โดยการเติม  Tris-HCl buffer)+Antioxidance (8 Hydroxy Methyl Quinolene)  และ  Chl...
สกัด  DNA 27.   เติม  Chloroform+Isoamyl alcohol  ในอัตราส่วน  24:1   ให้มีปริมาตรเป็น  1   เท่า ของที่มีอยู่ 28.  เขย่า  ...
สกัด  DNA <ul><li>นำไปปั่นเหวี่ยงด้วยเครื่อง   Centrifuge (2500 rpm 4 ˚ C  10   นาที ) </li></ul><ul><li>เท  Absolute Etha...
เก็บ  Stock DNA นำหลอด  DNA  ที่ละลายใน  TE  แล้ว ไป  Centrifuge  ด้วยระบบ  Quick run  โดยการกดปุ่ม  Quick run  ค้างไว้ DN...
หาความเข้มข้นของ  DNA Dilute DNA 25   เท่า ปริมาณ  1000 µl น้ำที่  sterile  แล้ว  960   µl   DNA  จาก   Stock 40  µl Mix  ...
ตรวจสอบมิวเตชั่นโดย เทคนิค  PCR   Dilute DNA  ให้มีความเข้มข้น   25   ng/µl   ปริมาณ  500 µl เพิ่มปริมาณ   DNA  ณ บริเวณ  ...
ตรวจสอบมิวเตชั่นโดย เทคนิค  RFLP Dilute DNA  ให้มีความเข้มข้น   25   ng/µl   ปริมาณ  500 µl เพิ่มปริมาณ   DNA  ณ บริเวณ  E...
ตรวจสอบมิวเตชั่นโดย เทคนิค  ASA   Dilute DNA  ให้มีความเข้มข้น   25   ng/µl   ปริมาณ  500 µl เพิ่มปริมาณ   DNA  ด้วยเครื่อ...
ผลการทดลอง ภาพที่  1   แสดงการรันเจล   Exon 11   ของยีน  AE1 การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน  Exon 11   และ  17  ของย...
ผลการทดลอง ภาพที่  2   แสดงการรันเจล   Exon 11  และ  17  ที่ถูกตัดด้วย  Hpa  II   แล้ว การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใ...
ผลการทดลอง ภาพที่  3   แสดงการรันเจล   Exon 17  ของยีน  AE1  ที่ถูกตัดด้วย  Hpa  II   แล้ว การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตช...
ภาพที่  4   แสดงการรันเจล   Exon 17  ตัวอย่างที่  4-19  ของยีน  AE1  ที่ถูกตัดด้วย   Hpa  II   แล้ว ผลการทดลอง การศึกษาและ...
สรุปและวิเคราะห์ผลการทดลอง จากผลการทดลอง มีผู้ที่เป็นโรคไตผิดปกติในการขับกรดทั้งหมด  3   คน ซึ่งในจำนวนนี้ เป็นผู้ที่มีควา...
สรุปและวิเคราะห์ผลการทดลอง ความผิดปกติของยีนที่เกิดขึ้นบริเวณ  Exon 11  เป็นการมิวเตชั่นแบบ  Deletion  คือมีการขาดหายไปของ...
ข้อเสนอแนะ 1.  ในการเลือก  Exon  ควรเลือก  Exon  ที่มีการกลายพันธ์ที่หลากหลายกว่านี้ 2.  ควรเพิ่ม  Exon  ที่จะศึกษา เพื่อน...
เอกสารอ้างอิง สมาคมพันธุศาสตร์แห่งประเทศไทย .  2548.   สาระน่ารู้อณูพันธุศาสตร์ .     เท็กซ์ แอนด์ เจอร์นัล พับลิเคชั่น . ...
Upcoming SlideShare
Loading in...5
×

Oral Presentation

2,351

Published on

Published in: Technology, Design
0 Comments
0 Likes
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

  • Be the first to like this

No Downloads
Views
Total Views
2,351
On Slideshare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
0
Actions
Shares
0
Downloads
24
Comments
0
Likes
0
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

Oral Presentation

  1. 1. การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) นักเรียนผู้ทำโครงงาน นายอานนท์ แซ่เล้า รหัสประจำตัว 04689 นักเรียนชั้นมัธยมศึกษาปีที่ 6/8
  2. 2. ที่มาและความสำคัญ โรคไตผิดปกติในการขับกรด ( D istal Renal Tubular Acidosis ) เป็นโรคที่พบได้บ่อยและเป็นปัญหาสาธารณสุขของคนไทย ผู้ป่วยโรคนี้มีความผิดปกติที่ท่อส่วนปลายของเนฟรอน (distal nephron) ทำให้ไม่สามารถขับกรดออกทางปัสสาวะ มีกรดคั่งในร่างกาย การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs ) http :// mednote . co . kr / images / DiurecticNephron . gif
  3. 3. ที่มาและความสำคัญ สาเหตุของโรคนี้มี 2 หลักใหญ่คือ สิ่งแวดล้อมและพันธุกรรม - สาเหตุจากสิ่งแวดล้อมที่มีการกล่าวถึง คือ ภาวะขาดโปแตสเซียม และการมีสารแวนนาเดียม (vanadium) สูงในร่างกาย - สาเหตุจากพันธุกรรม คือ การมิวเตชั่นของยีน AE1 ที่มา : http :// en . wikipedia . org / wiki / Portal : Medicine / Selected_Article_Archive_ ( 2007 ) การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs ) AE1
  4. 4. การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs ) - AE 1 มีทั้งหมด 20 Exon ที่เกิดการมิวเตชั่นส่วนใหญ่คือ Exon 11, 13, 14, 15, 17 และ 18
  5. 5. แผนการดำเนินงาน แผนการดำเนินงาน การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs ) ตุลาคม อภิปรายและสรุปผล สร้าง Haplotype ดำเนินการวิเคราะห์ SNPs รวบรวมตัวอย่างเลือด ศึกษาวิธีการทำ วางแผนการดำเนินงาน พฤศจิกายน กันยายน สิงหาคม กรกฎาคม เดือน
  6. 6. ผลที่คาดว่าจะได้รับ <ul><li>ได้เรียนรู้การมิวเตชั่นในแต่ละจุดที่ถูกเลือกขึ้นมาศึกษา ของยีน AE1 </li></ul><ul><li>ได้รู้ลำดับ SNPs ของตัวเอง และรู้ว่าเรามีอาการผิดปกติที่เกิดจากการมิวเตชั่นหรือเปล่า </li></ul><ul><li>ได้สร้าง Haplotype โดยใช้โปรแกรม Cyrillic และนำข้อมูลมาวิเคราะห์ ( ยังไม่แน่นอนเพราะโปรแกรมยังไม่ดีเท่าที่ควร ) </li></ul><ul><li>ได้รู้และเข้าใจในความแตกต่างของลำดับเบสและ SNPs ของผู้ที่เป็นโรคและคนปกติ </li></ul><ul><li>ได้รับข้อมูล ประสบการณ์ ความรู้ และเทคนิควิธีการ เพื่อมาประยุกต์ใช้ต่อไป </li></ul>การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )
  7. 7. Single Nucleotide Polymorphism (SNPs) http :// www . scq . ubc . ca / wp - content / uploads / 2006/07 / dna1 . gif http :// igridext . cryst . bbk . ac . uk / WWW / PhD_thesis_files / image018 . jpg การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )
  8. 8. ประเภทของ Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) 1) SNP ในส่วนที่มีการถอดรหัส ( coding SNP ) 2) SNP ในส่วนที่ไม่ถูกถอดรหัส http :// home . biotec . or . th / NewsCenter / my_documents / my_pictures / 38137_col2 . JPG การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )
  9. 9. SNPs Haplotype การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )
  10. 10. Polymerase Chain Reaction หรือ PCR Polymerase Chain Reaction หรือ PCR เป็นเทคนิคสำหรับเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอโดยอาศัยหลักการ DNA Replication ซึ่งเป็นการสังเคราะห์สายดี เอ็น เอ สายใหม่ จาก ดีเอ็นเอต้นแบบในหลอดทดลองภายในระยะเวลาอันสั้นและได้ดีเอ็นเอสายใหม่เกิดขึ้นเป็นล้านเท่า http :// www . ucl . ac . uk / ~ucbhjow / bmsi / lec5_images / pcr . gif การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )
  11. 11. สารตั้งต้นที่ใช้ใน PCR <ul><li>Deoxynucleotides ( dNTPs ) เป็นนิวคลีโอไทด์ ซึ่งเป็นหน่วยย่อยสำหรับนำไปสังเคราะห์ดีเอ็นเอสายใหม่ </li></ul><ul><li>  DNA polymerase เป็นเอนไซม์สำหรับสังเคราะห์ดีเอ็นเอให้ช่วยเร่งปฏิกิริยาเชื่อมต่อนิวคลีโอไทด์ใหม่เข้ากับไพรเมอร์ </li></ul><ul><li>  Primer เป็นดีเอ็นเอเริ่มต้นสายสั้น ๆ ที่มีลำดับเบสเป็นคู่สมกับดีเอ็นเอที่เป็นต้นแบบของการสังเคราะห์ ในการทำ PCR จึงต้องทราบลำดับเบสของดีเอ็นเอที่ต้องการจะเพิ่มจำนวน เพื่อใช้ในการสร้างไพเมอร์จำเพาะ </li></ul><ul><li>  PCR buffer เป็นสารละลายที่ควบคุมสภาวะของการทำปฏิกิริยาให้เหมาะสม เช่น pH และเกลือต่าง ๆ ซึ่งจะต้องมีอนุมูลแมกนีเซียม ( Mg ++ ) อยู่ด้วย </li></ul><ul><li>  Template คือดีเอ็นเอต้นแบบหรือยีนส่วนที่ต้องการเพิ่มปริมาณ หรือเป็นตัวอย่างดีเอ็นเอ ที่ต้องการนำมาตรวจหาดีเอ็นเอจำเพาะ </li></ul>การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )
  12. 12. ขั้นตอน PCR ใน 1 รอบ http :// users . ugent . be / ~avierstr / principles / pcrsteps . gif การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )
  13. 13. http :// www . mun . ca / biology / scarr / PCR_sketch_3 . gif
  14. 14. http :// users . ugent . be / ~avierstr / principles / pcrcopies . gif การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )
  15. 15. การตรวจสอบมิวเตชั่นด้วย PCR การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )
  16. 16. <ul><li>โครงงานex11-17_s1-s5(2). bmp </li></ul>การตรวจสอบมิวเตชั่นด้วย RFLP การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )
  17. 17. การตรวจสอบมิวเตชั่นด้วย วิธี ASA อาศัยความจำเพาะของไพรเมอร์ในการทำ PCR โดยจะแบ่งไพรเมอร์เป็น 2 แบบ คือ Normal Primer และ Mutant Primer หลักการคือ DNA ปกติ จะเกิดผลิตภัณฑ์ ได้กับ ไพรเมอร์ปกติ ส่วน DNA ที่ Mutant จะเกิด Product ได้กับไพรเมอร์ที่ Mutant Normal Heterozygote Mutant N M N M N M ASA Control การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )
  18. 18. วัตถุประสงค์ของโครงงาน <ul><li>ศึกษาการมิวเตชั่นของยีนใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 </li></ul><ul><li>ศึกษาและเปรียบเทียบความแตกต่างของลำดับเบสและ SNPs ของผู้ที่เป็นโรคและคนปกติ </li></ul>การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )
  19. 19. วิธีการดำเนินงาน สกัด DNA เก็บ Stock DNA ตรวจสอบมิวเตชั่นโดย เทคนิค PCR ตรวจสอบมิวเตชั่นโดย เทคนิค ASA หาความเข้มข้นของ DNA ตรวจสอบมิวเตชั่นโดย เทคนิค RFLP สรุปผลการตรวจสอบ สร้าง Haplotype Block การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )
  20. 20. สกัด DNA การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )
  21. 21. สกัด DNA Plasma Buffy coat RBC การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs ) ตั้งทิ้งไว้ 10 นาที
  22. 22. สกัด DNA การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )
  23. 23. สกัด DNA สกัด DNA โดยใช้ Phenol - Chloroform Method <ul><li>เจาะเลือด นำเลือดใส่หลอดทดลอง เติมสาร Anticoagulant (EDTA : สารที่ทำให้เลือดไม่แข็งตัว ) </li></ul><ul><li>เติมสาร 1X PBS ลงไป 1 เท่าของที่มีทั้งหมดในหลอดทดลอง ( ไม่จำเป็นต้องเติมก็ได้ ) </li></ul><ul><li>นำไปปั่นเหวี่ยงด้วยเครื่อง Centrifuge (2500 rpm 4 ˚ C 10 นาที ) </li></ul><ul><li>จะได้สารออกมาสามชั้น อันได้แก่ Plasma, Buffy coat และ RBC ให้ดูดชั้น plasma ออก โดยให้เหลือสูงจากชั้น Buffy coat เล็กน้อยเพื่อป้องกันไม่ให้ดูดติดชั้น Buffy coat ซึ่งเป็นชั้นที่เราต้องการ </li></ul><ul><li>เติม 1X PBS ลงไป 1 เท่าของที่มีทั้งหมดในหลอดทดลอง เพื่อล้างเซลล์ และเอา plasma ที่เหลือออก ( ไม่จำเป็นต้องเติมก็ได้ ) </li></ul>การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )
  24. 24. สกัด DNA <ul><li>เติม RBC lysis buffer 1 เท่าของที่มีอยู่หรือจนเต็มหลอดทดลอง ( เป็นสาร Hypertonic solution ซึ่งจะทำให้เม็ดเลือดแดงแตก ) </li></ul><ul><li>ตั้งทิ้งไว้ 10 นาที ( ขณะตั้งทิ้งไว้จะต้องคอยเขย่าตลอดเวลา ) จะได้สารละลายสีแดงขุ่น = lysis เม็ดเลือดแดงแล้ว </li></ul><ul><li>นำไปปั่นเหวี่ยงด้วยเครื่อง Centrifuge (2500 rpm 4 ˚ C 10 นาที ) </li></ul><ul><li>จะได้สายละลายขุ้นคล้ายเดิม อาจใสขึ้นเล็กน้อย ให้ดูดสารชั้นบนทิ้งเล็กน้อยตามความเหมาะสมและการพิจารณา </li></ul><ul><li>ทำตามขั้นตอนที่ 6-9 ซ้ำ จนได้สารละลายที่แยกเป็นสามชั้น เมื่อส่องดูด้วยแสงไฟ </li></ul>การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )
  25. 25. สกัด DNA <ul><li>เทสารข้างบนทิ้งให้หมดให้เหลือแต่ WBC </li></ul><ul><li>เติม RBC lysis buffer ให้มีปรมาตรทั้งหมดเท่ากับ 10 cm 3 แล้วเขย่าให้ WBC แตกกระจาย </li></ul><ul><li>นำไปปั่นเหวี่ยงด้วยเครื่อง Centrifuge (2500 rpm 4 ˚ C 10 นาที ) </li></ul><ul><li>เทสารใสข้างบนทิ้ง ให้เหลือแต่ตะกอนเม็ดเลือดขาว </li></ul><ul><li>ล้างเม็ดเลือดขาวด้วย 1X PBS โดยการเติม 1X PBS ลงไป ให้ได้ปริมาตร 7 ml ผสมโดยการเขย่าจนได้สารละลายสีขาวขุ่น </li></ul><ul><li>นำไปปั่นเหวี่ยงด้วยเครื่อง Centrifuge (2500 rpm 4 ˚ C 10 นาที ) </li></ul><ul><li>เทสารละลายใสด้านบนทิ้งให้เหลือแต่ ตะกอนเม็ดเลือดขาวด้านล่าง </li></ul>การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )
  26. 26. สกัด DNA <ul><li>ทำตามขั้นตอนที่ 15-17 ซ้ำอีก 1-2 รอบ </li></ul><ul><li>เติม TE 20-5 ปริมาณ 4 ml ลงในหลอดที่มีตะกอนเม็ดเลือดขาว เพื่อทำให้เม็ดเลือดขาวแตกเป็น Single cell โดยห้ามใช้ความรุนแรง แนะนำให้ใช้ปิเปตบีบเป่าให้แตกกระจาย </li></ul><ul><li>เมื่อกลุ่มเซลล์เม็ดเลือดขาวแตกกระจายหมดแล้ว ให้เติม 10 % SDS 200 µl + Proteinase K ( ความเข้มข้น 2 mg/ml ) ปริมาณ 200µl เพื่อทำให้เซลล์แตก แล้ว mix ให้เข้ากัน ( จะได้สารข้นเหนียว ) </li></ul><ul><li>Incubate 1 คืน ที่อุณหภูมิ 37 o </li></ul>การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )
  27. 27. สกัด DNA <ul><li>เติม Phenol(saturate โดยการเติม Tris-HCl buffer)+Antioxidance (8 Hydroxy Methyl Quinolene) และ Chloroform+Isoamyl alcohol ในอัตราส่วน 24:1 โดยเติมทั้งสองอย่างให้เท่ากันเสมอ และรวมแล้วมีปริมาตรเป็น 1 เท่า ของที่มีอยู่ </li></ul><ul><li>เขย่า 100 ที แล้วนำไปปั่นเหวี่ยงด้วยเครื่อง Centrifuge (2500 rpm 4 ˚ C 10 นาที ) </li></ul><ul><li>จะได้สารละลายที่แบ่งเป็น 2 ชั้น คือ organic phase และ aqua phase </li></ul><ul><li>ดูดชั้น organic phase ทิ้งโดยพยายามไม่ให้ดูดชั้นขาวขุ่นทิ้ง </li></ul><ul><li>ทำตามขั้นตอนที่ 22-23 อีก 1 รอบ </li></ul>การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )
  28. 28. สกัด DNA 27. เติม Chloroform+Isoamyl alcohol ในอัตราส่วน 24:1 ให้มีปริมาตรเป็น 1 เท่า ของที่มีอยู่ 28. เขย่า 100 ที แล้วนำไปปั่นเหวี่ยงด้วยเครื่อง Centrifuge (2500 rpm 4 ˚ C 10 นาที ) 29. ดูดชั้น organic phase ( ชั้น Chloroform ) ทิ้งโดยพยายามไม่ให้ดูดชั้นขาวขุ่นทิ้ง ( ชั้นตรงกลาง ) 30. ทำตามขั้นตอนที่ 27-29 ซ้ำ 1-2 ครั้ง 31. สารละลายใส ให้เติม 4M NaCl ปริมาณ 1/10 ของที่มีอยู่ 32. เติม Absolute Ethanol ที่เย็น ( เพื่อตก DNA ) ปริมาณ 2 เท่าของที่มีอยู่ 33. จะปรากฏใย DNA การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )
  29. 29. สกัด DNA <ul><li>นำไปปั่นเหวี่ยงด้วยเครื่อง Centrifuge (2500 rpm 4 ˚ C 10 นาที ) </li></ul><ul><li>เท Absolute Ethanol ทิ้งให้หมด </li></ul><ul><li>เติม 70 % Ethanol แล้วนำไปปั่นเหวี่ยงด้วยเครื่อง Centrifuge (2500 rpm 4 ˚ C 10 นาที ) </li></ul><ul><li>เท 70 % Ethanol ทิ้ง แล้วคว่ำให้ DNA แห้ง แต่อย่าให้แห้งมากจนเกินไป </li></ul><ul><li>เติม TE 10-1 ปริมาณ 500µl รอให้ DNA ละลายหมด ( อาจเขย่าช่วย ) </li></ul>การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )
  30. 30. เก็บ Stock DNA นำหลอด DNA ที่ละลายใน TE แล้ว ไป Centrifuge ด้วยระบบ Quick run โดยการกดปุ่ม Quick run ค้างไว้ DNA ที่ละลายใน TE Transfer DNA ลงในหลอด Efpendrop เก็บรักษาในตู้ Freeze ที่อุณหภูมิ -25 o C ใช้ระบบ Quick run Eppendrop ขนาด 1.6 ml การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )
  31. 31. หาความเข้มข้นของ DNA Dilute DNA 25 เท่า ปริมาณ 1000 µl น้ำที่ sterile แล้ว 960 µl DNA จาก Stock 40 µl Mix ให้เข้ากันดี แปลค่า OD 260nm เป็นค่าความเข้มข้น [OD 260nm = 1 = 50 ng/ µl ] หาค่า OD ด้วยเครื่อง Spectrophotometer โดยใช้ความยาวคลื่น 260 nm และ 280 nm การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )
  32. 32. ตรวจสอบมิวเตชั่นโดย เทคนิค PCR Dilute DNA ให้มีความเข้มข้น 25 ng/µl ปริมาณ 500 µl เพิ่มปริมาณ DNA ณ บริเวณ Exon 11 ด้วย Primer Exon 11 ตรวจสอบและแยกขนาด DNA ด้วยเครื่อง Horizontal Gel Electrophoresis การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )
  33. 33. ตรวจสอบมิวเตชั่นโดย เทคนิค RFLP Dilute DNA ให้มีความเข้มข้น 25 ng/µl ปริมาณ 500 µl เพิ่มปริมาณ DNA ณ บริเวณ Exon 17 ด้วย primer exon 17 ตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ Hpa II ตรวจสอบและแยกขนาด DNA ที่ตัดแล้ว ด้วยเครื่อง Horizontal Gel Electrophoresis ตรวจสอบและแยกขนาด DNA ด้วยเครื่อง Horizontal Gel Electrophoresis การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )
  34. 34. ตรวจสอบมิวเตชั่นโดย เทคนิค ASA Dilute DNA ให้มีความเข้มข้น 25 ng/µl ปริมาณ 500 µl เพิ่มปริมาณ DNA ด้วยเครื่อง PCR โดยใช้เทคนิค ASA รัน DNA ที่ PCR แล้วด้วยเครื่อง Horizontal Gel Electrophoresis การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )
  35. 35. ผลการทดลอง ภาพที่ 1 แสดงการรันเจล Exon 11 ของยีน AE1 การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )
  36. 36. ผลการทดลอง ภาพที่ 2 แสดงการรันเจล Exon 11 และ 17 ที่ถูกตัดด้วย Hpa II แล้ว การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )
  37. 37. ผลการทดลอง ภาพที่ 3 แสดงการรันเจล Exon 17 ของยีน AE1 ที่ถูกตัดด้วย Hpa II แล้ว การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )
  38. 38. ภาพที่ 4 แสดงการรันเจล Exon 17 ตัวอย่างที่ 4-19 ของยีน AE1 ที่ถูกตัดด้วย Hpa II แล้ว ผลการทดลอง การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )
  39. 39. สรุปและวิเคราะห์ผลการทดลอง จากผลการทดลอง มีผู้ที่เป็นโรคไตผิดปกติในการขับกรดทั้งหมด 3 คน ซึ่งในจำนวนนี้ เป็นผู้ที่มีความผิดปกติที่ Exon 11 จำนวน 2 คน คือตัวอย่างที่ 16 และ 18 และ เป็นผู้ที่มีความผิดปกติที่ Exon 17 อีก 1 คนคือหมายเลข 19 ซึ่งเป็นแบบ Homozygote ทำให้เกิดโรคได้ทันที แต่ตัวอย่างที่ 17 ที่มีความผิดปกติที่ Exon 17 เป็นความผิดปกติของยีนแบบ Heterozygote จึงไม่เป็นโรค นอกจากนี้ยังมีอีก 1 คน ( หมายเลข 18 ) ที่เป็นโรคนี้โดยที่มีการมิวเตชั่นทั้ง Exon 11 และ 17 เรียกว่า Compound Heterozygote การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )
  40. 40. สรุปและวิเคราะห์ผลการทดลอง ความผิดปกติของยีนที่เกิดขึ้นบริเวณ Exon 11 เป็นการมิวเตชั่นแบบ Deletion คือมีการขาดหายไปของลำดับเบส ทำให้กรดอะมิโนขาดหายไป ส่วนความผิดปกติที่ Exon 17 นั้นเกิดจาก SNPs ที่เปลี่ยนแปลงจาก G เป็น A หรือ T ซึ่งเป็นผลให้เอนไซม์ไม่สามารถตัดได้ ภาพที่ 5 บริเวณที่ถูกตัดด้วย Hpa II T C C G G C T T A G G C C G A A SNPs การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )
  41. 41. ข้อเสนอแนะ 1. ในการเลือก Exon ควรเลือก Exon ที่มีการกลายพันธ์ที่หลากหลายกว่านี้ 2. ควรเพิ่ม Exon ที่จะศึกษา เพื่อนำไปสร้าง Haplotype block แล้วค่อยนำมา ศึกษา 3. ควรรวบรวมตัวอย่างเลือดเป็นครอบครัว เพื่อศึกษาการถ่ายถอดของยีนด้วย การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs )
  42. 42. เอกสารอ้างอิง สมาคมพันธุศาสตร์แห่งประเทศไทย . 2548. สาระน่ารู้อณูพันธุศาสตร์ . เท็กซ์ แอนด์ เจอร์นัล พับลิเคชั่น . ไทย . Sambrook and Russell. 2001 . Molecular Cloning : A Laboratory Manual Volume 2 . 3 rd ed. . Cold Spring Harbor Laboratory Press. การศึกษาและเปรียบเทียบการมิวเตชั่นใน Exon 11 และ 17 ของยีน AE1 โดยการตรวจ Single Nucleotide Polymorphisms ( SNPs ) Sambrook and Russell. 2001 . Molecular Cloning : A Laboratory Manual Volume 1 . 3 rd ed. . Cold Spring Harbor Laboratory Press.
  1. A particular slide catching your eye?

    Clipping is a handy way to collect important slides you want to go back to later.

×