Praticas De Microbiologia 2 Curso Biologia Sp

10,190
-1

Published on

Published in: Technology, Business
0 Comments
4 Likes
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

No Downloads
Views
Total Views
10,190
On Slideshare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
0
Actions
Shares
0
Downloads
267
Comments
0
Likes
4
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

Praticas De Microbiologia 2 Curso Biologia Sp

  1. 1. Prácticas de Microbiología 2º Curso Biología Departamento de Microbiología y Genética Universidad de Salamanca
  2. 2. PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA INTRODUCCIÓN GENERAL. TÉCNICAS DE MICROBIOLOGÍA BÁSICA OBTENCION Y MANTENIMIENTO DE CULTIVOS PUROS El trabajo con microorganismos no se realiza con células aisladas, sino con poblaciones extensas y homogéneas del microorganismo a estudiar, por lo que el microbiólogo utiliza técnicas que permiten obtener un cultivo puro, y luego cultivar a gran escala dicho microorganismo. Para obtener cultivos puros el microbiólogo ha de utilizar instrumentos estériles, es decir libres de otros microorganismos no deseados (contaminantes). La esterilidad se consigue por diferentes métodos: 1 . Calor seco. Para el material de vidrio y de metal. Estos objetos se someten a una temperatura de 170°C durante al menos 90', envueltos en papel o aluminio. 2 . Calor húmedo. Se utiliza para soluciones acuosas y plásticos. Este material se somete a una temperatura de 120°C durante 20' en una atmósfera de vapor de agua a elevada presión, que evita la ebullición. Se consigue en el autoclave. 3 . Filtración. Para esterilizar soluciones termolábiles, a las que se hace pasar a través de un filtro con un tamaño de poro que permite el paso de la solución, pero no de los microorganismos. 4 . Esterilización química. para esterilizar material (generalmente algunos tipos de plástico) que son termolábiles. Se utilizan sustancias como el óxido de etileno, que se eliminan una vez finalizado el proceso de esterilización. 5 . Radiación. La radiación UV o las radiaciones α o γ pueden utilizarse para esterilizar habitaciones o algunos plásticos. Para poder estudiar los microorganismos en el laboratorio el microbiólogo también debe contar con medios de cultivo que posean los nutrientes necesarios para el crecimiento de los mismos. Si los nutrientes están en forma de solución acuosa hablamos de medios de cultivo líquidos, mientras que si añaden solidificantes, como la gelatina o el agar (2-3%), obtenemos medios de cultivo sólidos. A veces se utilizan medios de cultivo semisólidos, si la concentración de agar es 0,6-1,5%. Los medios de cultivo se esterilizan mediante calor húmedo. Para aislar un microorganismo de una mezcla de varios y obtener un cultivo puro del mismo, la técnica más utilizada es la de siembra por estría en placa Petri, con medio de cultivo sólido, que permite obtener colonias separadas de individuos que proceden por división de una única célula. Estas colonias nos sirven para iniciar un cultivo a gran escala. Otra técnica consiste en obtener una suspensión de la mezcla de microorganismos y hacer diluciones seriadas que se vierten en una placa Petri hasta conseguir colonias aisladas. Una vez que se ha obtenido un cultivo puro, se puede mantener haciendo resiembras en tubos de agar inclinado o bien congelando las células en glicerol (10-30%) a -70°C, en Nitrógeno líquido a -173°C, o mediante liofilización. - 1 -
  3. 3. PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA EL MICROSCOPIO El microscopio es el instrumento más necesario para un microbiólogo, ya que permite la observación de organismos que no pueden ser apreciados en detalle a simple vista, es decir de los microorganismos. Existe una gran variedad de microscopios que, según la fuente de iluminación utilizada, se agrupan en: • Microscopios ópticos: La fuente de iluminación es la luz. a. De campo claro. Permiten la observación de preparaciones, en su color natural o contrastadas mediante tinciones, resaltadas sobre un fondo más brillante. b. De campo oscuro. Permiten la observación de formas celulares que destacan brillantes sobre un fondo oscuro. Este efecto se consigue utilizando diafragmas especiales. c . De contraste de fases. Gracias a la utilización de diafragmas y objetivos especiales, que consiguen aumentar las diferencias en el índice de refracción de las células y el medio que las rodea, permiten la observación de células vivas, ya que no es necesario realizar ninguna tinción de las mismas. d. De interferencia. Permiten observar células vivas sin teñir, obteniéndose una imagen en relieve de las mismas. e . De fluorescencia. La fuente de iluminación proporciona luz ultravioleta que excita ciertas moléculas presentes en las células (bien de forma natural o añadidas a la preparación) que emiten fluorescencia en el espectro visible. • Microscopios electrónicos: La fuente de iluminación es un chorro de electrones y las lentes son electroimanes. a. De transmisión. Permiten la observación de muestras teñidas con sustancias que son resistentes al paso de electrones y cortadas dando lugar a láminas finas, denominadas cortes finos. Los electrones no son visibles directamente por lo que éstos se envían a una pantalla que emite fluorescencia más o menos intensa según el número de electrones que inciden en ella. Las estructuras celulares que se tiñan más intensamente impedirán el paso de electrones y por lo tanto no permitirán la emisión de fluorescencia, por lo que estas estructuras aparecerán oscuras en un fondo más brillante. Se consiguen entre 10.000 y 100.000 aumentos. b. De barrido. Permiten la observación de células enteras, sin necesidad de cortes finos, de modo que aparecen los relieves originales y las superficies externas. Alcanzan entre 1.000 y 10.000 aumentos. Durante las prácticas se empleará el microscopio óptico de campo claro, cuyos componentes fundamentales (mecánicos, de iluminación y ópticos) se muestran en la Figura 1. La capacidad de un microscopio para observar diferentes estructuras se refleja en el número de aumentos y en el límite de resolución (LR). El número de aumentos de un microscopio resulta de multiplicar los aumentos que proporciona cada una de las lentes presentes entre la fuente de iluminación y el ojo. El límite de resolución (LR) se define como la distancia mínima a la que se deben encontrar dos puntos para que puedan observarse como distintos. El microscopio es mejor cuanto menor sea el LR del mismo. El LR viene definido por la fórmula: LR = / 2nsen : Longitud de onda de la fuente de iluminación. 2nsen : Este valor se denomina apertura numérica y viene definido por dos valores: 2sen es un número que viene determinado por la construcción del microscopio y no se puede variar. n es el índice de refracción del medio. - 2 -
  4. 4. PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA Por lo tanto si queremos mejorar la capacidad de observación de un microscopio dado debemos incrementar el número de aumentos y disminuir el límite de resolución (LR). Para conseguir lo primero, casi todos los microscopios disponen de varias lentes que se pueden cambiar según el tamaño de la muestra a observar. Para disminuir el LR podemos utilizar una fuente con menor longitud de onda (el caso extremo es el de los microscopios electrónicos) o bien aumentar n, para lo que podemos intercalar entre la preparación y el objetivo un medio más denso que el aire. Normalmente se utiliza aceite de inmersion. Es importante recordar que no todos los objetivos son impermeables al aceite, sólo si lo son puede utilizarse este producto. En los microscopios que se utilizarán en las prácticas, ¡¡sólo puede utilizarse el aceite de inmersión con el objetivo de 100 aumentos!!. Figura 1. ESQUEMA DEL MICROSCOPIO Oculares Objetivos Pletina móvil Condensador Diafragma Filtros Tornillos de enfoque Fuente de iluminación Soporte - 3 -
  5. 5. PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA OBSERVACION MICROSCOPICA Para observar una muestra al microscopio óptico podemos recurrirá a: a. Preparación húmeda. Se realiza colocando una gota de la suspensión de microorganismos entre un porta y un cubreobjetos. Se observa directamente. b. Preparación fijada. Se coloca una suspensión homogénea de microorganismos en una gota de agua sobre el portaobjetos y se fija (mediante calor o agentes químicos) y después se tiñen mediante diferentes técnicas. Estas preparaciones se observan sin cubreobjetos y, habitualmente, con objetivos de inmersión. TINCIONES Son técnicas que permiten observar microorganismos en función de la capacidad de los mismos para retener (o no) determinadas sustancias colorantes, lo que depende de la carga de la célula y del colorante. Estos colorantes pueden ser de distintos tipos: a. Catiónicos. Son sustancias que tienen carga positiva. Penetran en el interior de las células y las tiñen. Ejemplos: Azul de metileno, Cristal violeta, Safranina. b. Aniónicos. Con carga negativa. No penetran en el interior celular, de modo que no tiñen las células, sino el entorno. En este caso se habla de tinción negativa. Ejemplos: Eosina, Nigrosina. c . Liposolubles. Se mezclan con los lípidos celulares y los tiñen. Ejemplo: Negro sudán. Por otro lado las tinciones pueden realizarse siguiendo distintos métodos. • S i m p l e s . Utilizan un solo colorante. Se basan en el hecho de que las células tienen una composición química diferente a la de su entorno, de modo que ambos se comportan de forma diferente frente a un colorante. El colorante tiñe las células (Azul de metileno, Safranina) o no (Nigrosina). • Diferenciales. Se basan en el hecho de que distintos tipos de células tienen distinta composición química, y por lo tanto reaccionan de forma diferente frente a una tinción, lo que permite clasificar los microorganismos en diferentes grupos, según su capacidad de tinción. En este apartado están dos tinciones de importancia taxonómica y médica: la tinción de Gram y la de ácido-alcohol resistencia (de Ziehl-Neelsen). Estas tinciones utilizan más de un colorante. • Selectivas. Se basan en el hecho de que distintas estructuras celulares tienen distinta composición química, de modo que se tiñen selectivamente con ciertos colorantes. Ej; tinción de esporas, de flagelos, de paredes celulares, de corpúsculos metacromáticos. Pueden utilizarse uno o más colorantes. - 4 -
  6. 6. PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA Práctica 1. AISLAMIENTO Y RESIEMBRA DE MICROORGANISMOS. MANEJO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO. TINCIONES. INTRODUCCIÓN En esta práctica se va a proceder al aislamiento de microorganismos mediante estría en medio sólido y a la resiembra de diversos microorganismos en tubos de agar inclinado. Por otro lado se aprenderá a manejar el microscopio óptico de campo claro y se realizarán preparaciones húmedas de suspensiones de microorganismos y tinciones que nos permitirán observar la forma y tamaño de distintos microorganismos, así como algunas estructuras especiales (esporas en Bacillus y corpúsculos metacromáticos en Lactobacillus). También realizaremos tinciones diferenciales que nos permitirán clasificar microorganismos en distintos grupos (tinción de Gram y de ácido-alcohol resistencia). MATERIALES Asa de siembra, placas de medio sólido y tubos de agar inclinado (Agar Común: 0,8% Peptona, 0,3% Extracto de carne, 2% Agar, pH 7,2), mechero de alcohol. Microscopio óptico, portaobjetos, cubreobjetos, colorantes. Suspensiones de microorganismos. Resiembras de microorganismos: Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Micrococcus luteus, Serratia marcescens. Suspensión de yogourt con Lactobacillus. Resiembra de Mycobacterium phlei. 1.AISLAMIENTO. A partir de una suspensión de microorganismos se realizarán estrías sucesivas en placas de medio sólido. Las placas se incuban luego a 30ºC durante 24 horas. 2.RESIEMBRA. Mediante el asa de siembra se transfieren microorganismos desde unos tubos de agar inclinados con la muestra a otros estériles. Luego se incuban a 30ºC durante 24 horas. 3.PREPARACION HUMEDA. Con una pipeta Pasteur se coloca una gota de la suspensión de microorganismos en un portaobjetos. Se coloca un cubreobjetos encima y se observa con el objetivo 40 aumentos. 4.TINCIONES Tinciones simples • Azul de metileno (Tinción positiva). Permite teñir el interior celular. Tiñe microorganismos procarióticos (vivos o muertos). Los eucarióticos sólo se tiñen si están muertos. Algunas estructuras, como los corpúsculos metacromáticos, se tiñen más intensamente con este colorante que el resto de la célula. - 5 -
  7. 7. PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA Procedimiento 1 . Extensión: poner una gota de agua en el portaobjetos y extender en ella la muestra (Escherichia y Bacillus ) utilizando el asa de siembra. 2 . Fijación: pasar el portaobjetos varias veces por encima de la llama del mechero de alcohol, sin permitir que llegue a hervir, hasta que se seque. 3 . Añadir Azul de metileno y esperar 2'. 4 . Lavar con agua 5 . Secar. 6 . Observar primero con el objetivo x40; luego se añade aceite de inmersión y se observa con el objetivo x100. • Nigrosina (Tinción negativa).Se trata de un colorante aniónico, que no penetra en el interior celular. Proporciona una visión de la forma y el tamaño celulares al observarse los microorganismos brillantes sobre un fondo oscuro. Procedimiento 1 . Colocar una gota de Nigrosina sobre uno de los extremos del portaobjetos. 2 . Extender la muestra (Escherichia y Bacillus) en la gota con el asa de siembra. 3 . Realizar un frotis: con un segundo portaobjetos se extiende la muestra de modo que cubra toda la superficie del primero. 4 . Secar al aire. 5 . Observar (primero x40 y luego x100 con aceite de inmersión). Tinciones selectivas • Tinción de corpúsculos metacromáticos. Vamos a observar los corpúsculos metacromáticos en células de Lactobacillus, para lo que se toma una muestra de un yogourt con el asa de siembra y se coloca en un portaobjetos (no es necesario poner agua) y se realiza una tinción con azul de metileno como se ha descrito anteriormente. En esta preparación se observan dos microorganismos: Lactobacillus, con los corpúsculos metacromáticos en su interior, y Streptococcus, cuyas células forman cadenas en forma de rosario. • Tinción de endosporas. Las bacterias de los géneros Bacillus y Clostridium se caracterizan porque forman endosporas. Las endosporas son formas de resistencia que garantizan la supervivencia de la especie ante situaciones adversas (agotamiento de nutrientes, cambios de temperatura, acumulación de metabolitos tóxicos...). Estas estructuras, que contienen una copia completa del genoma, se desarrollan en el interior de la célula bacteriana, pudiendo alcanzar un diámetro considerablemente mayor que el de la célula. La célula acaba por lisarse y morir dejando libre a la espora. Las endosporas germinarán cuando las condiciones ambientales vuelvan a ser favorables. Algunas enfermedades muy conocidas son producidas por especies de los géneros Clostridium: y Bacillus: C. tetani (tétanos), C. perfringens (gangrena gaseosa), C. botulinum (botulismo), B. anthracis (antrax). - 6 -
  8. 8. PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA Procedimiento 1 . Extensión (Bacillus). 2 . Fijación. 3 . Colocar un papel de filtro sobre la muestra y sujetarlo con una pinza. Empapar el papel con Verde malaquita y pasarlo por encima de la llama del mechero para que haya emisión de vapores. Cuando dejen de salir vapores volver a pasar la muestra por encima de la llama, volviendo a empapar el papel con colorante si es necesario. Repetir hasta 5 minutos. 4 . Retirar el papel y lavar con agua. 5 . Safranina 1 minuto. 6 . Lavar con agua. 7 . Secar. 8 . Observar (x40, x100). Tinciones diferenciales • Tinción de Gram. De gran importancia en Microbiología porque permite hacer diferenciaciones taxonómicas, separando dos grandes grupos de bacterias (Gram+ y Gram-), según se comporten ante esta tinción. El fundamento radica en la diferente estructura de la pared celular de ambos grupos: las bacterias Gram+ tienen una gruesa capa de peptidoglicano en su pared, mientras que las bacterias Gram- tienen una capa de peptidoglicano más fina y una capa lipopolisacarídica externa. Tras la tinción con el primer colorante (Cristal violeta) se efectúa un lavado con etanol que arrastrará al colorante sólo en las Gram (-), mientras que en las Gram (+) el colorante queda retenido y las células permanecerán azules. Las células Gram (-) se teñirán después con un colorante de contraste (safranina) para que puedan observarse. Procedimiento 1 . Extensión de la muestra (Escherichia y Bacillus). 2 . Fijación. 3 . Cristal violeta 1-2 minutos. 4 . Tirar el exceso de colorante (¡NO lavar con agua!). 5 . Añadir lugol, esperar 1 minuto. 6 . Decolorar con etanol (20 segundos) 7 . Lavar con agua. 8 . Añadir Safranina (colorante de contraste), esperar 1 minuto. 9 . Lavar con agua. 1 0 . Secar. 1 1 . Observar (x40, x100). - 7 -
  9. 9. PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA • Tinción de ácido-alcohol resistencia (Ziehl-Neelsen). Se basa en que ciertos microorganismos no son desteñidos por una mezcla de ácido y alcohol si han sido previamente teñidos con fucsina fenicada. Se dice que son microorganismos ácido-alcohol resistentes. Una vez realizada la decoloración con esta mezcla se utiliza un colorante de contraste (el Azul de metileno) para poder observar las células sensibles a la decoloración por ácido-alcohol. Son microorganismos ácido-alcohol resistentes las micobacterias, por la específica composición de su pared celular, y algunos actinomicetos, como Nocardia. Algunos microorganismos patógenos son ácido-alcohol resistentes: Mycobacterimum tuberculosis (tuberculosis), M. leprae (lepra). Procedimiento 1 . Extensión (Mycobacterium phlei y Micrococcus luteus). 2 . Fijación. 3 . Fucsina fenicada (con emisión de vapores durante 5 minutos). 4 . Quitar el papel de filtro y lavar abundantemente con agua. 5 . Añadir ácido-alcohol y esperar 30 segundos. 6 . Lavar con agua. 7 . Añadir Azul de metileno (colorante de contraste) y esperar 1-2 minutos. 8 . Lavar con agua. 9 . Secar. 1 0 . Observar (x40, x100). Gram(+) Gram(-) Peptidoglicano Peptidoglicano Membrana Plasmática Membrana Espacio periplásmico Plasmática Lipopolisacárido y Proteína - 8 -
  10. 10. PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA Proteína asociada Gram (+) Acidos a la pared Teicoicos Acidos Lipoteicoicos Peptidoglicano Membrana Plasmática Gram (-) Exterior Polisacárido O Lipopolisacárido Membrana Núcleo Polisacarídico Lípido A (LPS) externa Proteína Gram(-) Porina 8 nm Fosfolípido Lipoproteína Espacio Peptidoglicano Periplásmico Membrana Plasmática Interior - 9 -
  11. 11. PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA Práctica 2. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DEL AGUA INTRODUCCIÓN En el agua pueden encontrarse una gran variedad de microorganismos, los cuales afectan en mayor o menor medida a la potabilidad del agua y a sus características organolépticas. Además de la flora normal (Bacillus, Pseudomonas, etc.), en el agua pueden existir microorganismos contaminantes. Una de las fuentes principales de contaminación son las aguas residuales que contienen heces que pueden ser vehículo de transmisión de patógenos. Aparte del problema de transmisión de enfermedades, la contaminación del agua también acarrea otras consecuencias. Por ejemplo, la degradación biológica por los microorganismos de grandes cantidades de residuos orgánicos vertidos al agua hace disminuir rápidamente el oxígeno existente, creando un ambiente desprovisto de toda forma de vida que no sea anaeróbica: mueren los peces, disminuye la vida vegetal y se produce el hedor característico debido a las actividades de los microorganismos anaerobios. OBJETIVO El objetivo más importante de estos análisis es determinar si el agua está contaminada por heces humanas o de otros animales. ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO La calidad del agua se determina principalmente por análisis bacteriológicos. Las pruebas que se realizan son: 1 . Recuento de aerobios totales 2 . Colimetría 3 . Estreptometría 4 . Clostridiometría Estos ensayos siguen en líneas generales la normativa vigente (BOE 20 de Septiembre de 1.990). MATERIALES Muestra de agua ( unos 100 ml). Medios de cultivo: Placas de YED (4), tubos de medio Caldo Lactobiliado (3 EC concentrado y 6 EC simple), tubos de medio Caldo Azida de Rothe (3 AR concentrado, 6 AR simple), medio Wilson Blair (1 tubo de agar WB fundido), placa de medio Eosina Azul de Metileno (EMB). Tubos con 1 ml de agua estéril para diluciones. 1 tubo de vidrio estéril. Pipetas estériles (de 1 y 10 ml). Parafilm™. Baño @80o C. Baño @60o C. Estufa incubadora @37 o C. Tabla estadística de “Número Más Probable” (NMP). Asa de vidrio, mechero - 10 -
  12. 12. PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA de alcohol, alcohol de quemar. 1.Bacterias aerobias totales Las bacterias que vamos a identificar en este ensayo son bacterias heterótrofas, aerobias y anaerobias facultativas, mesófilas, capaces de crecer en un medio rico (YED). El ensayo se basa en contar el nº de colonias capaces de crecer en una placa de medio rico, en la que se ha sembrado un volumen de agua conocido, transcurrido un determinado tiempo de incubación a 37 °C. Este ensayo sólo nos indica la cantidad de microorganismos de este tipo que hay en la muestra de agua, pero NO IDENTIFICA microorganismos concretos. Al incubar a 37°C se seleccionan bacterias de origen fecal (adaptadas a vivir en el interior del cuerpo de los animales). Si se hiciera el mismo ensayo a 22 °C nos daría una idea de la flora autóctona. Procedimiento 1 . Sembrar 0,2 ml de la muestra original y 0,2 ml de las siguientes diluciones: 1/2, 1/4 y 1/8, en placas de YED. 2 . Incubar las placas a 37 °C durante 24 horas. Resultados: Contar el número de colonias existentes en cada placa, seleccionar la placa que contenga entre 30 y 300 colonias para la realización de los cálculos. El resultado se expresa como microorganismos por ml de agua. ¡Hay que tener en cuenta las diluciones!. 2.Bacterias coliformes (Colimetría) Son bacterias de morfología bacilar, Gram (-), aerobias o anaerobias facultativas, oxidasa negativas, no esporógenas y capaces de fermentar la lactosa con producción de ácido y gas a 37 °C en un tiempo máximo de 48 horas. Las bacterias coliformes de origen fecal se incluyen dentro de las bacterias entéricas o "enterobacterias" y se caracterizan por habitar el tracto gastrointestinal del hombre y otros animales. Este grupo incluye los géneros: Escherichia, Citrobacter, Klebsiella y Enterobacter. Las heces pueden ser vehículos de transmisión de otras bacterias coliformes que son patógenas como Salmonella y Shigella, algunas de cuyas especies causan infecciones intestinales como la fiebre tifoidea y la disentería bacilar. Ya que los microorganismos patógenos son muy sensibles y se encuentran en bajas concentraciones se toma como indicador de contaminación fecal la presencia en las aguas de los géneros arriba indicados y principalmente de Escherichia coli. Se realizan dos pruebas, presuntiva y confirmativa; el ensayo se considera positivo si dan positivas ambas pruebas. Prueba presuntiva: El agua problema se siembra en el medio denominado caldo lactobiliado (EC), que permite el enriquecimiento e identificación de bacterias coliformes. La lactosa existente es fermentada produciendo ácido y gas que se detecta en la campana de Durham. La bilis inhibe el crecimiento de cocos Gram + y bacilos formadores de endosporas y no inhibe a los bacilos entéricos Gram(-). Es un medio de enriquecimiento y selectivo. - 11 -
  13. 13. PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA Procedimiento 1 . Sembrar 10 ml de la muestra en 3 tubos con 10 ml de caldo lactobiliado concentrado (ECC) con campana de Durham. 2 . Sembrar 1 ml de la muestra en 3 tubos con 10 ml de caldo lactobiliado simple (EC) con campana de Durham. 3 . Sembrar 0,1 ml de la muestra en 3 tubos con 10 ml de caldo lactobiliado simple (EC) con campana de Durham. 4 . Incubar a 37°C durante 22-26 horas. Resultados: se consideran "tubos gas +" aquellos en los que aparece enturbiamiento y acumulación de gas en la campana. Los "tubos gas -" se incuban otras 24 h. La interpretación se realiza según la tabla de “número más probable” (NMP) adjunta. Esta tabla indica el número más probable de microorganismos presentes en 100 ml de agua (NMP), teniendo en cuenta los tubos en que hay crecimiento así como las diluciones y aplicando métodos estadísticos. Prueba confirmativa: Procedimiento 1 . Siembra en estría en placas de EMB (medio selectivo y diferencial para coliformes) a partir de "tubos gas+". 2 . Incubar a 37°C durante 24 h. Resultados: En este medio los microorganismos fermentadores de lactosa forman colonias características opacas y pigmentadas en rosa, azul o violeta con o sin brillo metálico (por ejemplo, E. coli forma colonias de color verde-violeta oscuro metálico características sobre este medio). La prueba es + si aparecen este tipo de colonias fermentadoras de lactosa. Una prueba confirmativa de la presencia de E. coli es sembrar los microorganismos que han crecido en caldo lactobiliado a 37°C en este mismo medio pero incubando a 44°C. E. coli es capaz de fermentar la lactosa en estas condiciones. 3.Estreptococos fecales (Estreptometría) Son cocos Gram (+), anaerobios aerotolerantes, catalasa negativos y fermentadores de glucosa con producción de ácido láctico a 37°C en un tiempo máximo de 48 h. Este grupo comprende especies como Streptococcus faecalis, S. faecium, S. bovis y S. equinus. Los estreptococos fecales son residentes normales del intestino del hombre y animales y reciben la denominación general de enterococos. El ensayo incluye prueba presuntiva y confirmativa y se considera positivo si ambas pruebas son positivas. Prueba presuntiva: El ensayo se basa en saber si existen microorganismos capaces de crecer a 37 °C en un medio líquido glucosado con agentes inhibidores selectivos. El medio utilizado, denominado caldo azida de - 12 -
  14. 14. PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA Rothe (AR) es un medio selectivo que contiene azida que inhibe la cadena de transporte de electrones del metabolismo respiratorio de los microorganismos. Los estreptococos y otros microorganismos poseen un metabolismo fermentativo y carecen de cadena de transporte de electrones por lo que no se ven afectados por la azida. Procedimiento 1 . Sembrar de la misma forma que en bacterias coliformes en medio selectivo para estreptococos, caldo azida de Rothe (3 tubos ARC, 6 tubos AR). 2 . Incubar a 37°C durante 24 h. Resultados: Se consideran "tubos +" aquellos en que existe enturbiamiento y/o sedimento. Interpretación según la tabla NMP (microorganismos/100 ml de agua) Prueba confirmativa: Se trata de realizar una tinción de Gram del sedimento presente en los tubos con objeto de reconocer al microscopio los estreptococos, que se observarán como cadenas de cocos Gram (+). 4.Clostridios sulfito-reductores (Clostridiometría) Son bacterias de morfología bacilar, Gram(+), anaerobios estrictos, capaces de formar esporas y con actividad sulfito reductora. Algunas especies de Clostridium habitan en el tracto intestinal de animales, otras en el suelo, etc. El ensayo consiste en contar el número de bacterias anaerobias formadoras de endosporas con capacidad sulfito reductora en un medio que contiene sulfito sódico y una sal de hierro, denominado medio Wilson Blair (WB). Estas colonias aparecen de color negro debido a la formación de sulfuro ferroso por reducción del sulfito. Procedimiento 1 . Fundir previamente el medio Wilson-Blair (WB) y mantener en baño a 60 °C. 2 . Calentar la muestra de agua (10 ml que se echan en un tubo estéril) durante 10 minutos a 80 °C, para matar formas vegetativas e inducir la esporulación. Enfriar en el grifo. 3 . Tapar bien el tubo con Parafilm™. Mezclar suavemente. 4 . Incubar a 37°C durante 24-48 horas. Resultados: Contar el nº de colonias negras existentes en la totalidad del tubo (sin tener en cuenta las colonias puntiformes). El resultado se expresa como nº de clostridios existentes en el volumen de agua sembrada. (Ver normas vigentes). INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS El agua se considera potable si los valores obtenidos en los ensayos están dentro de los límites establecidos por la ley. Las normas legales vigentes exigen: • Aerobios totales: No existe límite legal pero los valores máximos recomendados son: Aerobios a 37°C: 10 /ml. Aerobios a 22°C: 100 por ml. • Coliformes: Coliformes totales: < 1 / 100ml. Coliformes fecales: < 1 / 100ml. - 13 -
  15. 15. PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA • Estreptococos fecales: < 1 / 100ml. • Clostridios sulfito reductores: < 1 / 20 ml. Colimetría Estreptometría Aerobios Clostridiometría Conclusión Totales Presuntiva Confirmativa Presuntiva Confirmativa Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4 Control Control COMPOSICIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO EMPLEADOS Caldo lactobiliado (EC) Medio rico (YED) Biotona 20,0 g/l Extracto de levadura 10 g/l Lactosa 5,0 g/l Glucosa 20 g/l Fosfato de potasio 5,5 g/l Agar 20 g/l Cloruro de sodio 5,0 g/l Sales biliares 1,5 g/l Caldo azida de Rothe (AR) Medio eosina-azul de metileno (EMB) Peptocomplex 15,0 g/l Eosina 0,4 g/l Extracto de carne 4,5 g/l Azul de metileno 0,065 g/l Glucosa 7,5 g/l Lactosa 5,0 g/l Cloruro de sodio 7,5 g/l Peptona 10,0 g/l Azida sódica 0,2 g/l Fosfato de potasio 2,0 g/l Sacarosa 5,0 g/l Medio Wilson Blair (WB) Agar 13,5 g/l Peptona 10,0 g/l Sulfito sódico 0,5 g/l Citrato férrico 0,5 g/l Agar 15,0 g/l - 14 -
  16. 16. PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA - 15 -
  17. 17. PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA Práctica 3. DETERMINACIÓN DE ENTEROBACTERIAS INTRODUCCIÓN En esta práctica tratamos de simular un aislamiento de microorganismos a partir de una muestra (heces, agua o alimentos contaminados...), para identificarlos posteriormente mediante un conjunto de pruebas. Concretamente, vamos a realizar la determinación de bacterias pertenecientes al grupo de bacilos Gram (-) anaerobios facultativos, en el que se incluyen las enterobacterias. Muchas de ellas forman parte de la flora normal del tracto digestivo del hombre pudiendo producir enfermedades en determinadas circunstancias. Otros como Salmonella o Vibrio pueden causar enfermedades por la ingestión de alimentos o agua contaminados. De ahí la necesidad de desarrollar pruebas que permitan aislar e identificar rápidamente estos microorganismos. IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS La correcta detección e identificación de los microorganismos presentes en muestras clínicas o de otros orígenes es imprescindible para determinar el origen de las infecciones, seguir el curso de las enfermedades y decidir los tratamientos a aplicar. Todos los puntos del proceso son importantes, desde la forma de tomar y mantener las muestras hasta su manipulación en el laboratorio. Se puede decir que en el proceso de identificación de microorganismos se ponen en juego todos los conocimientos acumulados en Microbiología. La identificación de bacterias puede basarse en muchos caracteres: morfológicos, fisiológicos, bioquímicos, de tipo serológico y de patogenicidad. Morfológía celular: • Forma (bacilos, cocos) y agrupamiento (diplococos, racimos, rosarios). • Tinción (Gram, ácido-alcohol resistentes...) • Estructuras especiales: flagelos, endosporas Morfológía de las colonias: • Forma, color, consistencia, borde, sección... Fisiología: • Aerobios, anaerobios, anaerobios facultativos • Temperatura óptima de crecimiento • Movilidad Bioquímica: • Presencia o ausencia de una enzima o de toda una ruta metabólica. • Fermentación de carbohidratos • Utilización de citratos como única fuente de carbono - 16 -
  18. 18. PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA Actualmente existen kits que agrupan muchas pruebas fisiológicas y bioquímicas en un formato sencillo y que produce resultados rápidos. No obstante, todavía muchas pruebas requieren el empleo de métodos de cultivo tradicionales, selectivos, diferenciales y de enriquecimiento. GRUPO DE BACTERIAS GRAM (-) ANAEROBIAS FACULTATIVAS Son bacilos o cocobacilos, pueden crecer en presencia o en ausencia de O2 son pues anaerobios facultativos. En anaerobiosis obtienen la energía por fermentación. En este grupo se incluyen las familias Enterobacteriaceae y Vibrionaceae. FAMILIA Enterobacteriaceae • Forma: bacilos, cocobacilos • Movilidad: inmóviles o móviles por flagelos peritricos • Catalasa (+) • Oxidasa (-) La mayoría de enterobacteriáceas pueden fermentar glucosa y otros azúcares. La capacidad o no para fermentar algunos sustratos se utiliza para la identificación de las distintas especies. Por ejemplo, Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacter fermentan la lactosa, mientras que Salmonella, Shigella, Proteus no fermentan la lactosa. FAMILIA Vibrionaceae • Forma: bacilos ligeramente curvados. • Movilidad: móviles por flagelos polares • Catalasa (+) • Oxidasa (+) Las vibrionáceas crecen bien en medio alcalino. La mayoría son inofensivas y se encuentran en ambientes acuáticos. Algunos son patógenos, como Vibrio cholerae que es el agente causal del cólera. PROCESO EXPERIMENTAL La práctica consistirá en la simulación del aislamiento e identificación de enterobacterias a partir de una muestra. 1. AISLAMIENTO Para el aislamiento se utilizan medios que son selectivos para determinadas bacterias, donde podremos ver la morfología, color y otras características de los distintos tipos de microorganismos presentes en la muestra. Cada grupo de alumnos tiene una suspensión que contiene una mezcla de microorganismos (mezcla A o B). Se llevarán a cabo inoculaciones en placas de medios sólidos (YED, Verde Brillante, EMB, TCBS) y en medio líquido (Peptona alcalina), empleando las mezclas A o B. - 17 -
  19. 19. PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA Procedimiento 1.1.- Cultivos en placas • Tomar una muestra de la suspensión microbiana con un asa de siembra estéril y sembrar por estría los siguientes medios, con el fin de obtener colonias bien aisladas: 1 placa de YED, 1 placa de Verde Brillante, 1 placa de EMB, 1 placa de TCBS. • Incubar a 24 h a 37 °C. Observar la morfología de las colonias y determinar cuantos microorganismos distintos hay en cada mezcla. 1.2.- Cultivos en medio líquido • Añadir con una pipeta Pasteur estéril varias gotas de la suspensión bacteriana en un tubo de peptona alcalina. • Incubar a 37 °C y observar la presencia o no de crecimiento bacteriano. Características de los medios empleados • Medio YED. Es un medio complejo que lleva: Extracto de levadura 10g/l Glucosa 20 g/l No es un medio selectivo, por lo tanto permite el crecimiento de muchos microorganismos. • Medio EMB (Eosina-azul de metileno). Es un medio complejo que lleva: Lactosa 5 g/l Sacarosa 5 g/l Peptona 10 g/l Difosfato potásico 2 g/l Eosina (indicador de pH, cambia de incoloro a negro a pH ácido) 0,4 g/l Azul de metileno (inhibe el crecimiento de bacterias Gram +) 0,065 g/l pH 7,2. Es un medio selectivo de enterobacterias. También es un medio diferencial ya que nos permite saber por la morfología de la colonia si los microorganismos que crecen fermentan lactosa o sacarosa. Si las bacterias fermentan lactosa o sacarosa, acidifican el medio y la eosina vira a negro dando lugar a la aparición de colonias coloreadas. Las bacterias que no fermentan ni lactosa ni sacarosa originan colonias incoloras. - 18 -
  20. 20. PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA • Medio Agar Verde Brillante. Es un medio complejo que consta de: Lactosa 10 g/l Sacarosa 10 g/l Peptona 10 g/l Extracto de levadura 3 g/l NaCl 5 g/l Rojo de fenol (indicador de pH) 0,08 g/l Verde Brillante (colorante que inhibe el crecimiento de muchas bacterias) 0,0125 g/l pH 6,9. Está indicado para el aislamiento de Salmonella (no para S. typhi). Es un medio casi selectivo puesto que Salmonella puede crecer mientras que otras bacterias son inhibidas por la presencia del colorante verde brillante. Las colonias de Salmonella son blanco-rosáceas, con un halo rojo brillante. Si crecen microorganismos fermentadores de lactosa o sacarosa dan colonias amarillo-verdosas con un halo del mismo color pero más intenso. Algunas cepas de Proteus forman colonias rojas. • Medio Agar TCBS. El medio contiene: Tiosulfato Sódico 10 g/l Extracto de levadura 5 g/l Citrato férrico 1 g/l Citrato sódico 10 g/l Bilis de vaca 5 g/l Peptonas 10 g/l Sacarosa 20 g/l Azul de Timol 0,04 g/l Azul de Bromotimol0,04 g/l pH 8,6. Es un medio utilizado para el cultivo y aislamiento selectivo de Vibrio cholerae y otros vibrios enteropatógenos. Las colonias de Vibrio son grandes, de color amarillo o azul. Este medio inhibe selectivamente enterobacterias, aunque algunas pueden crecer dando pequeñas colonias. • Medio Peptona Alcalina. Este medio contiene: Peptona 10 g/l NaCl 5 g/l pH 9. Por su pH alcalino sólo permite el crecimiento de Vibrio. Es un medio líquido, lo que se observa es la existencia de crecimiento por turbidez del medio. 2. IDENTIFICACIÓN Las siguientes pruebas se deben realizar con los distintos microorganismos obtenidos en los aislamientos en placa. Se llevarán a cabo 5 pruebas individuales: Tinción de Gram, Prueba de la oxidasa, Test de la Catalasa, Prueba de Kligler y Manita-movilidad. Además se llevará a cabo una prueba - 19 -
  21. 21. PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA compuesta por varias reacciones bioquímicas, el API20E. 2.1 Tinción de Gram. La tinción de Gram es una tinción diferencial que nos permite clasificar las bacterias en Gram(+) o Gram(-) según las características de su pared celular. Además permitirá observar la morfología de los microorganismos aislados. Procedimiento • Realizar la tinción de Gram siguiendo el protocolo utilizado en la primera práctica. • Fijarse bien en la morfología de las células. 2.2 Prueba de la Oxidasa. Se trata de determinar si un microorganismo posee citocromo c- oxidasa. Para ello se utiliza un compuesto orgánico que puede ser reducido por el sistema citocromo- oxidasa/citocromo c en presencia de oxígeno molecular, originando un producto coloreado fácilmente apreciable. 1-naftol + dimetilparafenilendiamina ---Oxidasa---> azul de indofenol Procedimiento • Tomar con el asa de siembra una colonia de la placa de EMB o TCBS (o bien hacer una suspensión de una colonia en agua). • Poner la colonia sobre la tira de papel en la zona que contiene el sustrato y extenderla cuidadosamente con el asa de siembra. • Esperar 20-60 segundos y observar si existe algún cambio en la coloración. Resultado: Si la tira se pone de color azul oscuro, el microorganismo es oxidasa positivo. 2.3 Test de la Catalasa. Algunas bacterias poseen catalasa, una enzima capaz de destruir el agua oxigenada generada en algunos procesos metabólicos. Esta enzima está presente en la mayoría de las bacterias que contienen citocromos, bien aerobias o anaerobias facultativas. 2H2O2 ---Catalasa---> 2H2O + O 2 Procedimiento • Coger con cuidado una colonia con el asa de siembra (evitar coger agar). • Poner la colonia directamente sobre un portaobjetos sin añadir agua. • Echar sobre la colonia una gota de agua oxigenada pura o al 30 %. • Observar si se forman burbujas de oxígeno. Resultado: La aparición de burbujas indica que el microorganismo es catalasa positivo. 2.4 Test de Kligler. En este test se utiliza el medio de cultivo KIA ("Agar Hierro de Kligler") y proporciona varios datos fisiológicos importantes para determinar si un microorganismo es: fermentador de - 20 -
  22. 22. PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA glucosa, fermentador de lactosa, productor de gas, productor de ácido sulfhídrico. Es un medio que requiere un procedimiento de inoculación especial. Procedimiento • Inocular los microorganismos aislados en un tubo de medio KIA con el asa de siembra. La siembra se hará de la siguiente manera: sembrar la superficie por estría y sembrar la parte interna del medio por picadura (es necesario pinchar suficientemente, sobre todo para la detección de producción de sulfhídrico. • Incubar 18-24 h a 37°C. Observar e interpretar los cambios producidos en el medio. Características del medio KIA La composición de este medio de cultivo es la siguiente: Lactosa (1%) Glucosa (0,1%), Tiosulfato sódico Rojo de fenol (indicador de pH) Peptona Cationes de metales pesados (Fe2+ ). En él se obtiene la siguiente información fisiológica. • Fermentación de glucosa y lactosa. El medio contiene una pequeña cantidad de glucosa y una gran cantidad de lactosa. Los microorganismo capaces de fermentar cualquiera de estos compuestos darán lugar a la formación de ácidos que bajan el pH del medio. Como consecuencia el rojo fenol vira a amarillo. La sucesión de eventos metabólicos es la siguiente (ver dibujo): 1. El microorganismo utiliza la fuente de carbono más asequible en el medio, la glucosa. Pero como se encuentra en el medio en muy baja concentración se agota rápidamente. Los productos de su degradación acidifican el medio que cambia de rojo a amarillo. 2. Al agotarse la glucosa empieza a utilizar las peptonas, pero sólamente en aerobiosis (se corresponde a la zona de la lengüeta del tubo). Este consumo da lugar a residuos amoniacales, produciendo una basificación del medio. El indicador vira a rojo en esta parte del tubo. 3. Posteriormente se produce el consumo de lactosa, en el caso de los - 21 -
  23. 23. PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA microorganismos que sean capaces de utilizar este disacárido. Esto da lugar a un descenso de pH por lo que cambiará el medio de rojo a amarillo. La razón de que la lactosa se utilice después es debido al tipo de regulación de la ß- galactosidasa, que es la enzima que hidroliza este disacárido para dar los correspondientes monosacáridos. Se trata de una enzima inducible, lo que significa que existe un periodo de latencia entre el agotamiento de la glucosa y la producción de las primeras moléculas de ß- galactosidasa, de tal forma que después de un tiempo de consumo de peptonas se comienza a utilizar lactosa. Lac + Glc + Amarillo 6h 10 h 24 h Rojo Lac - Amarillo Glc + Rojo Amarillo Rojo Amarillo • Producción de gas. La producción de gas se detecta por la formación en el medio de burbujas de gas perfectamente visibles ya que cuartean el medio. El gas se origina mediante la reacción catalizada por la formiato liasa a partir de ácido fórmico. H-COOH --------formiato liasa-----> CO2 + H2 Por tanto, son “gas (+)” aquellos microorganismos que produzcan esta enzima. • Producción de SH2. Algunas bacterias son capaces de llevar a cabo la siguiente reacción a partir del tiosulfato añadido al medio: 2S 2O32- + 4e- + 4 H+ -----tiosulfato reductasa-------> 2 SO32+ + 2 SH2 El ácido sulfhídrico se detecta porque reacciona con las sales de metales pesados (Fe2+ ) presentes en el medio. Esto da lugar a la formación de sulfuro de hierro que se deposita en gran parte del tubo, sobre todo en el fondo, oscureciendo el medio. 2.5 Manita-Movilidad. Se utiliza un medio semisólido para detectar la movilidad de las bacterias. Este medio contiene manitol como fuente de carbono. Si el microorganismo es capaz de usar el manitol se produce una acidificación del medio, lo que da lugar a un viraje del indicador de pH de rojo a amarillo. - 22 -
  24. 24. PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA Procedimiento • Inocular por picadura un tubo de medio semisólido con cada uno de los distintos microorganismos aislados. • Incubar 18-24 horas a 37°C. • Observar la zona de crecimiento del microorganismo y si ha habido cambio en la coloración del medio. Resultado: El test de la movilidad se hace mirando el desplazamiento del microorganismo. Si el crecimiento se limita a la zona de la picadura, el microorganismo no es móvil. Si el crecimiento se produce por todo el medio, el microorganismo e s m ó v i l . Géneros Gas(OFG) SH2 Lac Urea Indol TCBS(1) Halofilia(2) Manita-Movilidad Escherichia + - + - + + - + Shigella - - - - - + - - Salmonella + + - - - + - + Citrobacter + + + - VAR + - + Klebsiella + - + + - + - + Enterobacter + - + + - + - + Serratia + - + - - + - + Proteus + + - + VAR + - + Yersinia - - - VAR - + - + 1. Inhibición del crecimiento de colonias en TCBS 2. Crecimiento en 6% NaCl, prueba de halotolerancia 2.6 Batería de pruebas API20E. La batería de pruebas API20E es un sistema de identificación rápida para bacterias de la familia E n t e r o b a c t e r i a c e a e y otras bacterias Gram(-). Básicamente consta de 23 tests bioquímicos estandarizados y miniaturizados y una base de datos. Este sistema presenta las ventajas de ser rápido, eficaz y de permitir realizar numerosas pruebas a la vez. Cada tira de API 20E contiene 20 microtubos o pocillos con distintos sustratos deshidratados. Cada tubo es una prueba bioquímica distinta (ver tabla "sumario de los resultados con API 20E "). Los microtubos se inoculan con una suspensión de microorganismos, en agua o solución salina, que rehidrata los medios. Las tiras se incuban a 37°C y por efecto del metabolismo bacteriano se van a producir cambios de color espontáneos o bien al añadir reactivos. La lectura de las reacciones se hace mediante comparación con una tabla de lectura donde se indica si los - 23 -
  25. 25. PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA microorganismos deben considerarse positivos o negativos para cada reacción según el color aparecido. Procedimiento • Preparación de inóculo. Tomar una colonia bien aislada de cada microorganismo y resuspenderla homogéneamente en 5 ml de solución salina (1% de ClNa) o 5 ml de agua estéril. • Inoculación de los pocillos. Cada pocillo tiene un tubo y una cúpula (ver dibujo). Llenar el tubo y la cúpula de los pocillos | CIT | , | VP |, | GEL | con la suspensión de bacterias. Llenar los tubos, no la cúpula, de los demás pocillos. Llenar con parafina las cúpulas de los pocillos ADH, LDC, ODC, URE, H2S para obtener anaerobiosis. • Poner la tira en la cámara de incubación. Previamente poner agua en los alveolos de la cámara para proporcionar una atmósfera húmeda durante la incubación. • Incubar a 37 °C durante 18-24 h. Resultados: La lectura de los resultados se lleva a cabo por comparación de los colores de cada pocillo con los de la tabla de lectura. Para la lectura se tienen en cuenta los siguientes criterios: Si la glucosa es positiva y/o 3 o más tests son positivos se revelan los test que requieren reactivos: VP: Añadir una gota de KOH 40 % y una gota de α-naftol 6% y esperar 10 minutos. Positivo= color rojo o rosa fuerte. TDA: Añadir una gota de Cl3Fe 10 %. Positivo=color marrón oscuro. IND: Añadir una gota de reativo de Kovacs. Positivo= aparece un anillo rojo en los dos primeros minutos de la reacción. Si la glucosa da negativo y los tests positivos son 2 o menos de 2, no hay que añadir reactivos. Cuando ésto ocurre se hacen otros tipos de API como el API OF, el API M o el API 10S para ver determinados metabolismos especiales. Identificación: Del conjunto de reacciones y resultados se obtiene un perfil numérico. Los pocillos están separados en grupos de tres: en total tenemos 7 tripletes (el test número 21 corresponde al test de la oxidasa). A cada pocillo se le da el valor 0, 1, 2 o 4. • Si la reacción es negativa se pone 0. • Si la reacción es positiva se pone: 1 si es el primer pocillo de un triplete, 2 si es el segundo, 4 si es el tercero. • Se suman los valores de cada triplete y se obtiene un código de 7 cifras. • Con este código se busca en la tabla de identificación la especie de que se trata. - 24 -
  26. 26. PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA - 25 -
  27. 27. PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA Práctica 4. DETERMINACIÓN DEL CRECIMIENTO DE UN MICROORGANISMO INTRODUCCIÓN El crecimiento microbiano se define como un incremento en el nº de células, es decir, se refiere al crecimiento de poblaciones. Este viene dado como consecuencia del crecimiento de cada célula individual y su división celular. El crecimiento de un microorganismo depende de varios factores como: • El microorganismo en sí. Así por ejemplo, en condiciones óptimas E.coli tiene un ciclo de vida de 15-20 minutos, mientras que Mycobacterium tuberculosis lo tiene de 18 horas. • La composición del medio de cultivo. Las células crecerán más lentamente en un medio mínimo (MM) que en un medio rico (MR) con todos los nutrientes. Dependiendo de la fuente de carbono y de la facilidad con que la asimilen crecerán más o menos rápidamente (por ejemplo, crecen mejor con glucosa (Glc) como fuente de carbono que con galactosa (Gal). • Las condiciones de incubación. La temperatura de incubación, la concentración de CO2 en la atmósfera de cultivo, la agitación, etc... son factores importantes. • La procedencia y características del inóculo. La curva de crecimiento variará dependiendo de que se parta de un cultivo estacionario o de uno en crecimiento exponencial, que se pase un cultivo crecido en MM+Glc a MM+Gal o de MR a MM+Glc. MEDIDA DEL CRECIMIENTO DE UNA POBLACIÓN MICROBIANA Existen varios métodos para medir el crecimiento microbiana: • Métodos directos. Son aquellos en los que se cuenta el nº total de células en un volumen conocido y así se estima el nº total en la población. Entre ellos: a. Recuento directo del nº de células al microscopio. Se utilizan portas especialmente diseñados para el recuento celular y denominados cámaras de recuento. Existen varios tipos de cámaras de recuento, una de ellas es la cámara Thoma que es la que nosotros utilizaremos. Este método tiene el inconveniente de que no diferencia entre células viables y no viables. Es poco preciso. b. Contadores electrónicos. Las células son suspendidas en un fluido conductor que pasa lentamente a través de una abertura fina por la que pasa una corriente eléctrica. Cada célula que pasa produce un cambio en la conductividad y estos cambios o pulsos convenientemente amplificados son registrados electrónicamente dando una medida directa del nº de células en el medio. No diferencia entre células viables y no viables ni entre células o partículas inertes. c . Recuento de células viables. Haciendo diluciones apropiadas seguidas de siembra sobre placas Petri podemos obtener crecimiento de colonias aisladas procedentes cada una de una única célula. Si se - 26 -
  28. 28. PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA multiplica por el factor de dilución tendremos el nº de células en cultivo. Sólo detecta viables pero es un método lento y caro por el elevado número de placas que hay que utilizar para que los resultados sean significativos. • Métodos indirectos. Son aquellos que utilizan parámetros distintos del nº de células, pero que pueden relacionarse de forma directa con éste (masa celular, actividad metabólica, etc..). Ello es posible porque durante el crecimiento de un cultivo hay un aumento ordenado de todos los constituyentes celulares y así la velocidad de crecimiento de la población puede estimarse por la velocidad del incremento de cualquiera de estos parámetros. Entre los métodos indirectos se encuentran: a. Determinación del peso seco. Se trata de medir la masa celular presente en un cultivo y estimar el nº de células proporcional a ésta. b. Determinación del nitrógeno celular. Medir el contenido proteíco del cultivo. c . Determinación del DNA d. Determinación de una actividad metabólica según el tipo de microorganismo: consumo de oxígeno (en aerobios), liberación de CO2 u otro producto de fermentación, aumento de la concentración de alguna enzima constitutiva, incorporación en la célula de algún material radiactivo, etc. e . Medida de la turbidez del cultivo. Se basa en la capacidad de las células y partículas en general de absorber y/o dispersar la luz que incide sobre ellas. Un cultivo celular aparece turbio porque las células dispersan la luz que atraviesa la suspensión. La turbidez es proporcional al número de células y puede medirse utilizando un espectrofotómetro. El espectrofotómetro es un aparato que hace pasar la luz a través de una suspensión celular y detecta la luz no dispersada. Luz Luz no Incidente dispersada Filtro Muestra Fotocélula o con (mide la luz no Registrador Prisma células dispersada) Este instrumento mide la relación de intensidad de luz incidente con la intensidad del rayo luminoso que sale después de atravesar la muestra. Cuanto mayor sea el nº de células mayor es la turbidez del cultivo, la densidad óptica (D.O.) y menor la cantidad de luz no dispersada que emerge tras atravesar la muestra. La D.O. del cultivo es pues proporcional a la densidad celular. Esto es así dentro de ciertos límites puesto que a elevadas concentraciones pueden formarse agregados celulares o producirse un efecto "pantalla" de unas células sobre otras. En el caso de S.cerevisiae la relación lineal entre la D.O. y - 27 -
  29. 29. PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA el número de células se mantiene hasta un valor de D.O. de aproximadamente 0.4. DILUCIONES Con algunos de los métodos mencionados, medida de la turbidez por ejemplo, es necesario en algunos puntos diluir la muestra. Es conveniente además hacer varias diluciones, generalmente seriadas en base de 10. Así para hacer una dilución de 10 veces se mezclaría 1ml de cultivo con 9ml de diluyente (medio de cultivo o agua). Si hacemos lo mismo con esta dilución obtendríamos una dilución de 100 veces, si lo hacemos con esta última conseguiríamos una dilución de 1000 veces y así sucesivamente. De esta forma obtendremos valores más exactos y reales. CÁLCULO DEL TIEMPO DE GENERACIÓN El tiempo requerido para que una célula microbiana se divida dando lugar a dos células se denomina tiempo de generación, G y es pues el tiempo que necesita una población para duplicar el nº de células. Si consideramos que entre un tiempo inicial, To, y otro final, Tf, han transcurrido n generaciones, tenemos que la expresión de G es: G = (Tf-To)/n (A) Donde: n = número de generaciones, y viene dado por el número de ciclos de división ocurridos en la población en un tiempo dado. Si inicialmente tenemos en el cultivo No células, trás una serie de divisiones tendremos: después de la primera división No x 2 1 después de la segunda división No x 2 2 después de la tercera división No x 2 3 después de n divisiones No x 2 n Se trata de una progresión geométrica del número 2. Por tanto el número de células final (Nf) será: Nf = No x 2n (B) Operando convenientemente (aplicando logaritmos) a partir de esta fórmula obtendremos el valor de n logNf = log(No x 2 n ) logNf = logNo + n log2 n = (logNf - logNo)/log2 (C) Conocido el valor de n, lo sustituimos en la ecuación (A) y obtenemos el valor de G - 28 -
  30. 30. PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA El incremento de una población en el que el número de células se dobla cada cierto periodo de tiempo, el tiempo de generación, se conoce como crecimiento exponencial y está representado por la ecuación (B) , que nos da el nº total de células a lo largo del tiempo. Logarítmica Nº de Células (escala aritmética) Nº de Células (escala logarítmica) Aritmética Tiempo (horas) Sin embargo, cuando seguimos el crecimiento de una población microbiana, midiendo por ejemplo su D.O. en función del tiempo, obtenemos su curva de crecimiento, que nos viene dada por una gráfica del tipo: Fases de Crecimiento Latencia Exponencial Estacionaria Muerte Turbidez Viables (D.O.) Tiempo El incremento en el número de células es lento al principio y después llega a ser de forma exponencial. Esta gráfica es característica de un cultivo en un recipiente cerrado en el que los nutrientes son limitados. En la curva se distinguen cuatro fases: 1. Fase de latencia. Fase de adaptación de las células a las nuevas condiciones del medio de incubación al que han sido transferidas. Las células no crecen inmediatamente sino después de este tiempo de latencia. Las células son metabólicamente activas, se adaptan al medio y eventualmente lo modifican. Para un mismo inóculo, esta fase de latencia varia dependiendo del medio al que se transfieren y de las condiciones de incubación. 2. Fase de crecimiento exponencial. Fase en la que las células se están dividiendo regularmente a ritmo constante. En condiciones apropiadas durante esta fase, el grado de desarrollo es máximo. Es en este periodo donde puede calcularse el tiempo de generación de un microorganismo. 3. Fase estacionaria. El nº de células no se incrementa más porque los nutrientes del medio se van agotando y posibles sustancias tóxicas pueden ir acumulándose. No hay incremento neto del nº de células, el nº de células que se originan es igual al nº de las que mueren. - 29 -
  31. 31. PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA 4. Fase de muerte celular. Las células mueren a una velocidad mayor a la que se originan debido al agotamiento total de los nutrientes y/o excesiva acumulación de sustancias tóxicas. A veces la muerte va acompañada de lisis celular y ésto disminuye la absorbancia del cultivo. OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA • Medir el crecimiento de una población microbiana (S.cereviasiae) utilizando dos métodos distintos: Medir de la turbidez del cultivo (método indirecto) y Recuento del nº de células al microscopio (método directo) • Determinar el tiempo de generación de la población (S.cerevisiae). MATERIALES Microorganismo: Saccharomyces cerevisiae. Matraz de 250ml con 75ml de medio YED (extracto de levadura y glucosa). Pipetas estériles, cámara de recuento (Cámara Thoma), microscopio óptico, espectrofotómetro. Mecheros de alcohol, incubadores a 28 ºC. Procedimiento 1. Para la determinación de la curva de crecimiento: • Inocularemos el matraz que contiene el medio de cultivo con un preinóculo. Mediremos la D.O. a 600nm y comprobaremos que esta D.O. inicial (to) es aproximadamente de 0.05. • Seguiremos la evolución de la turbidez del cultivo midiendo la D.O. a diferentes tiempos durante unas 12-24 horas. Tomaremos muestras a 0, 6, 9, y 11 hrs. Y en algunos de estos puntos haremos diluciones para medir la D.O. • Representaremos en una gráfica los valores de D.O. obtenidos a lo largo del tiempo. La curva obtenida será la curva de crecimiento del cultivo. 2. Al mismo tiempo haremos una recta patrón usando la cámara de recuento y suspensiones celulares de D.O. conocida. Utilizando esta curva patrón, calcularemos por extrapolación el nº de células que corresponden a los valores de D.O. obtenidos en nuestras lecturas al espectrofotómetro y haremos una gráfica del nº de células en función del tiempo. • Recuento directo del número de células al microscopio. La cámara de recuento consiste en un porta modificado con una hendidura de 0.1mm de profundidad. Está dividida en 16 cuadrados y éstos a su vez divididos en 16 ó 25 celdillas. Cada celdilla tiene una superficie de 0.0025mm2 y una profundidad de 0.1mm. Por tanto el volumen de cada celdilla (Va) es de 0.00025mm3 . Como hay 16 celdillas por cuadrado, el volumen de éste (VA) es de 16 x Va = 0.004mm3 . Como 1mm3 = 10 -3 ml. VA = 4 x 10 -6 ml (volumen de un cuadrado) De los cuadrados mayores se cuentan 4 al azar y se calcula la media (X) de células por cuadrado. Si este nº de células lo dividimos por el volumen del cuadrado tendremos la concentración de células por ml de medio: X cel / 4 x 10-6 ml = X x 25 x 104 cel/ml - 30 -
  32. 32. PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA Los valores de nº cel/ ml se representan gráficamente frente a su D.O. correspondiente para obtener la curva patrón. 3. Por último, haremos un cálculo de la G de nuestro cultivo, S. cerevisiae, utilizando dos valores consecutivos comprendidos dentro de la fase exponencial de crecimiento. - 31 -
  33. 33. PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA D.O. Nº (600nm) Células/ml - 32 -
  34. 34. PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA Práctica 5. ANTIBIÓTICOS DEFINICIÓN Los antibióticos son compuestos orgánicos de bajo peso molecular sintetizados por microorganismos, que a bajas concentraciones inhiben el desarrollo o matan a otros microorganismos. CARACTERÍSTICAS GENERALES 1. Inhiben el crecimiento (bacteriostáticos) o matan (bactericidas). 2. Son efectivos a bajas concentraciones. 3. Poseen toxicidad selectiva: actúan sobre el patógeno sin afectar al organismo hospedador. 4. Pueden actuar frente a procariotas o eucariotas. 5. Pueden ser de acción muy específica o de amplio espectro. 6. Solubles en agua. 7. Poseen estabilidad química. 8. Son productos del metabolismo secundario. Es importante tener en cuenta la posibilidad de aparición de resistencia a determinados antibióticos en algunos microorganismos durante el tratamiento de una infección. MICROORGANISMOS PRODUCTORES Se encuentran tanto dentro del grupo de procariotas como en el de eucariotas. A . Procariotas: Bacillus, Streptomyces, Nocardia B. Eucariotas: Penicillium, Aspergillus, Cephalosporium CLASIFICACIÓN Hay muy diversas clasificaciones: Según su origen • naturales: sintetizados por microorganismos. • sintéticos: obtenidos completamente por síntesis química. • semisintéticos: parte de compuesto sintetizada por microorganismos y otra parte sintetizada químicamente. Según su estructura química • ß-lactámicos: penicilinas, cefalosporinas. • macrólidos: eritromicina. • aminoglucósidos: estreptomicina. - 33 -
  35. 35. PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA • polipeptídicos: bacitracina. • poliénicos: anfotericina B • tetraciclinas • derivados del benceno: cloranfenicol. Según su mecanismo de acción • actúan sobre la pared celular bacteriana inhibiendo su síntesis: penicilinas. • actúan sobre la membrana celular alterando su permeabilidad. • inhiben la síntesis proteica. • inhiben la síntesis de ácidos nucléicos: mitomicina. OBJETIVOS Se llevarán a cabo tres pruebas que permiten detectar la producción de antibiótico por unos microorganismos, valorar la cantidad de antibiótico presente en una solución y determinar qué antibiótico entre varios es más efectivo contra un organismo testigo. MATERIALES Tubos de YED sólido, baños entre 45 y 50 ºC, placas Petri, discos de papel, pinzas, alcohol, mecheros, pipetas estériles, regla, papel semilogarítmico de 3 periodos, antibióticos: penicilina G 25, 50, 100 mg/ml y concentración desconocida; bacitracina: 1 mg/ml; cicloheximida: 2 mg/ml; microorganismos: Streptomyces griseus, Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, Bacillus subtilis. 1.PRUEBA DE PRODUCCIÓN DE ANTIBIÓTICOS Mediante un bioensayo en medio sólido podemos determinar si un microorganismo produce algún antibiótico capaz de inhibir el crecimiento de un organismo de prueba. Para ello se emplearán dos posibles microorganismos productores, Streptomyces griseus y Yarrowia lipolytica. y un microorganismo sensible, Saccharomyces cerevisiae. Procedimiento 1 . Tomar un tubo con medio YED sólido fundido y dejar enfriar hasta 45-50 ºC en un baño a dicha temperatura. 2 . Añadir 1 ml de la suspensión de células de S.cerevisiae (organismo sensible). 3 . Tapar el tubo con Parafilm, invertir varias veces y verter en una placa Petri vacía. 4 . Cuando el medio esté sólido (después de unos 20’) colocar encima 2 tacos de agar, cada uno con uno de los microorganismos a ensayar. 5 . Poner la placa a 4ºC durante 2 horas para permitir la difusión del antibiótico. 6 . Incubar la placa a 28ºC durante unas 15 horas para permitir el crecimiento del - 34 -
  36. 36. PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA microorganismo sensible. Resultado: Observar la existencia o no de halos de inhibición del crecimiento de Saccharomyces cerevisiae. 2.VALORACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE ANTIBIÓTICO La concentración de un antibiótico en una solución se puede determinar por comparación con el efecto de cantidades conocidas del mismo antibiótico sobre un microorganismo sensible, Bacillus subtilis. Esta técnica se emplea en los procesos de mejora de la producción de un determinado antibiótico por la especie productora. El proceso se lleva a cabo mediante bioensayo en placa sobre un microorganismo sensible. Se valorará la concentración de Penicilina G en una solución frente a una recta patrón generada con cantidades conocidas del mismo antibiótico. Procedimiento 1 . Tomar un tubo con medio YED sólido fundido y dejar enfriar hasta 45-50 ºC en un baño a dicha temperatura. 2 . Añadir 1 ml de la suspensión de células de B. subtilis (organismo sensible). 3 . Tapar el tubo con Parafilm, invertir varias veces y verter en una placa Petri vacía. 4 . Cuando el medio esté sólido (después de unos 20’) colocar encima discos de papel impregnados en las soluciones que contienen 25, 50 y 100 µg/ml de Penicilina G, y otro disco impregnado en la solución de concentración desconocida. 5 . Poner la placa a 4ºC durante 2 horas para permitir la difusión del antibiótico. 6 . Incubar la placa a 28ºC durante unas 15 horas para permitir el crecimiento del microorganismo sensible. Resultado: Observar el tamaño de los halos de inhibición del crecimiento, medir los diámetros con una regla, hacer la representación gráfica sobre papel semilogarítmico de 3 periodos y deducir la concentración de antibiótico desconocida. 3.ANTIBIOGRAMA El antibiograma se utiliza para comprobar cuál de una serie de antibióticos es más activo frente a un determinado microorganismo, Bacillus subtilis en este caso. Se compararán tres antibióticos, Penicilina G (0,1 mg/ml), Bacitracina (1 mg/ml) y Cicloheximida (2 mg/ml). Procedimiento 1 . Tomar un tubo con medio YED sólido fundido y dejar enfriar hasta 45-50 ºC en un baño a dicha temperatura. 2 . Añadir 1 ml de la suspensión de células de B. subtilis (organismo sensible). 3 . Tapar el tubo con Parafilm, invertir varias veces y verter en una placa Petri vacía. - 35 -
  37. 37. PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA 4 . Cuando el medio esté sólido (después de unos 20’) colocar encima discos de papel impregnados en las soluciones de los diferentes antibióticos (penicilina G, Bacitracina y Cicloheximida). 5 . Poner la placa a 4ºC durante 2 horas para permitir la difusión del antibiótico. 6 . Incubar la placa a 28ºC durante unas 15 horas para permitir el crecimiento del microorganismo sensible. Resultado: Observar la aparición o no de halos de inhibición del crecimiento y su tamaño. Indicar qué antibiótico es el más efectivo frente a B. subtilis. - 36 -

×