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    • Universida de Puer Rico U ad rto Recinto de Mayagüez o Facultad de Artes y Ciencia F Departamento de Biología D Take Home de e Fisiologí Micro ía obiana Glend dalis Vargaas Mirka Morale es María de L. Pére ez Lizah Rodríg hira guez Yamillette Lópezz Ricaardo Serran no Dia Ruiz ana Ivo onne Rosarrio
    • 1. Describa los tipos de secreción, indicando proteínas involucradas, mecanismo general, función y microorganismo que posee el mismo. (20 pts). Función: Translocar y exportar proteínas no plegadas A. Sistema Sec “General Secretory Pathway” Proteínas Involucradas: SecB: chaperona SecYEG: complejo de protenias de unión (SecY, E y G), SecA ATPasa: citoplasmática y receptor SecG: estimula el transporte SecD, SecF y yajC: proteínas regulatorias Mecanismo General: N terminal de proteína es reconocida por SecB y se trasloca por SecA en la forma plegada usando hidrólisis de ATP y el gradiente de electrones. La translocación ocurre en el complejo SecYEG que forma un canal conductor de proteínas. Microorganismos que lo posee: Bacterias Gram -, Gram +, E. coli; Archaea – Euryarcheota y Crenarcheota; Eukaryotes – Levaduras (Saccharomyces cereviciae) B. Tat “Twin arginine translocation pathway” Función: Transportan proteínas totalmente plegadas Proteínas Involucradas: TatA: Proteína membrana (formación del poro) TatB y TatC: reconocedoras Mecanismo General: Reconoce un motif en una secuencia de aminoácidos básica en la región N terminal del cofactor que contiene la proteína y transloca la proteína en el estado plegado utilizando solamente un gradiente de protones como fuente de energía. Microorganismo que lo posee: Bacterias, mitocondrias y cloroplastos; E. coli C. SSTI “Sistema de Secreción Tipo I” Función: Secreción de toxinas y exoenzimas (proteasas y lipasas) Proteínas Involucradas: ABC: transportador en membrana interna PF: proteína de fusión a la membrana interna PME: forma canal en la membrana externa Mecanismo General: Sec-independiente. La secreción de la proteína se da en un solo paso desde el citosol hasta el exterior de la célula. El sustrato se reconoce a través de una secuencia señal en el extremo C terminal. Al ser reconocido forma un complejo con la proteína PF, posteriormente una conexión con el poro de salida PME utilizando un gradiente de protones como fuente de energía, formando un canal que atraviesa el periplasma. Para la secreción del sustrato utiliza hidrólisis de ATP. Microorganismos que lo posee: Gama amplia de bacterias; bacterias Gram - como E. coli
    • Función: Responsable de la secreción de toxinas y enzimas D. SSTII “Sistema de Secreción Tipo II” hidrolíticas. Proteínas Involucradas: GspD: secretina GspS: lipoproteína (actúa como chaperona) GspBCFGHIJKLMNO: asociadas o parte a la membrana interna Mecanismo General: El sustrato con péptido líder es secretado al periplasma mediante el sistema Sec. Luego es excretada a través de la membrana externa por un secretón que consiste de proteínas localizadas en la membrana interna externa. La GspD se inserta en la membrana externa y forma un anillo para transportar los polipéptidos. La GspE, L y M regulan la hidrólisis de ATP. Las proteínas GspG, H, I, J y K forman una estructura en forma de pilis que empuja la proteína a través del poro. Microorganismos que lo poseen: Bacterias Gram -,Klebsiella oxytoca, Vibrio cholerae Función: Traslocar factores de virulencia a la célula huésped, E. SSTIII “Sistema de Secreción Tipo III” biogénesis flagelar y relaciones sibioticas. Proteínas Involucradas: Sobre 20 proteínas forman los anillos, Proteínas citosólicas o periféricas a la membrana, ATPasa, Secretina forman un canal en la ME, Chaperonas para ensamblaje del injectosoma y para translocacion de proteínas efectoras. Es una via Sec-independiente. Las proteínas exportadas son Mecanismo General: translocadas a la célula huesped mediante un poro que cruza el periplasma. Este poro consiste de una serie de anillos en la ME y MI. Para la secreción se requiere la energía de la hidrólisis de ATP. Las proteínas que conforman el poro o translocón, forman parte de los efectores que son exportados por la bacteria. Microorganismos que lo poseen: Sodalis glossinidius, Photorhabdus luminescens Pantoea agglomerans. Patogenos de humanos, animales y plantas como Bordetella, Chlamydia, Erwinia, E. coli, Pseudomonas, Ralstonia, Rhizobium, Salmonella, Shigella, Xanthomonas y Yersinia. Función: Transporta ADN y proteínas, toxina pertusis F. SSTIV “Sistema de Secreción Tipo IV” Proteínas Involucradas: ATPasas forman canales y proveen energía. VirB6 atraviesa la MI, VirB2, VirB1 Mecanismo General: Sec-independiente, Se asocian los componentes generadores de energía en la MI y la maquinaria de secreción. Las estructuras en la superficie celular inician el contacto con la célula hospeder, la vía de translocación del sustrato es aún desconocida. La proteína VirB1 se encarga de lisar la capa de mureína facilitando así el ensamblaje del complejo. Las proteínas pueden ser secretadas al medio o transferidas mediante un pili a la célula hospedera. Microorganismos que lo poseen: Agrobacterium tumefaciencs (plásmido Ti y proteínas en el huésped), Helicobacter pylori (inyecta CagA en células epiteliales gástricas), Bordetella pertusis (toxina persusis), Legionella neumophila, Brucella suis
    • G. SSTV “Sistema de Secreción Tipo V” Función: Transporte de proteínas, factores de virulencia Proteínas Involucradas: OMP, Tat Enzimas hydroliticas o toxinas que son autotransportadores que forman el poro Helper protein que facilita la traslocacion a través de la membrana Proteínas trimericas T5cSS dobles y Proteínas T5bSS doble una carga el dominio beta Mecanismo General: El péptido señal dirige el transporte del la proteína al citoplasma por el sistema Sec, una vez ahí, la proteína a secretar inserta su dominio C-terminal en la membrana externa formando un poro mediante el cual el dominio pasajero de la proteína alcanza el espacio extracelular. Generalmente estas proteínas se cortan asi mismas liberando el dominio pasajero al medio. Microorganismos que lo poseen: E. coli, Haemophilus influenzae,Yersinia enteroliticola, Bordetella Pertusis, Helicobacter pylori, Neisseria gonorrheae, Neisseria meningitides, Shigela flesneri, Serratia marcescen, Serratia marcescens, Dickeya dadantii, Proteus mirabilis, Edwardsiellla tarda Función: Introducir proteínas efectoras directamente al H. SSTVI “Sistema de Secreción Tipo VI” citoplasma por medio de un injectosoma. Proteínas involucradas: Chaperona citoplasmática con actividad de ATPasa Proteína formadora de poro Proteínas efectoras Mecanismo general: Las proteínas son introducidas en el citoplasma de la célula huésped mediante un injectosoma. Microorganismos que lo posee: Vibrio cholerae, Edwardsiella tarda, Pseudomonas aeruginosa, Francisella tularensis, Burkholderia mallei, Agrobacterium tumefaciens, Pectobacterium atrosepticum, Xanthomonas oryz,. Mesorhizobium loti, Rhizobium leguminosarum, Myxococcus xanthus, Dechloromonas aromatica y Rhodopirellula baltica. I. Función: Transporte de proteínas SSTVII “Sistema de Secreción Tipo VII” Proteínas Involucradas: Rv3877 es una proteina integral de la membrana Proteínas que forman canal en la membrana ATPasas parecida a chaperona Mecanismo General: La proteína integral de la membrana forma un canal interno de translocacion por donde pasa la proteína. Un segundo cana formado por proteínas aun desconocidas se localiza en la mycomembrana para el paso de la proteína. La ATPasa enlasa el terminal C de los efectores. Microorganismos que lo posee: Gram + y microbacterias, Mycobacterium, Corynebacterium diphtheria, Nocardia, Bacillus, Clostridium spp, Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae y Listeria monocytogenes Función: Exportar proteasas, toxinas, adhesinas e invasinas J. Autotransportadores Mecanismo General: Sec dependiente; Atraviesa la membrana interna mediante Sec. El dominio β del intermediario periplásmico adquiere la conformación de barril-β y se inserta en la membrana externa para formar el poro. Por último se transloca el dominio pasajero a la superficie celular donde puede permanecer unido o bien procesarse. Microorganismo que lo posee: Neisseria gonorrhoeae
    • Referencias Flores Herrera O, Riveros Rosas H, Sosa Peinado A, Vázquez Contreras E (eds). Mensaje Bioquímico, Vol XXVII. Depto Bioquímica, Fac Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México. Cd Universitaria, México, DF, MÉXICO. (2003). FACTORS INFLUENCING THE MORPHOLOGY OF BLASTOMYCES DERMATITIDIS SEYMOUR LEVINE AD Z. JOHN ORDALl Department of Bacteriology and Public Health, University of Illinois, College of Medicine, Chicago 15, Illinois. Received for publication August 16, 1946 INFLUENCE OF OSMOTIC PRESSURE ON THE MORPHOLOGY OF THE REITER TREPONEME PAUL H. HARDY, JR. AND E. ELLEN NELL International Treponematosis Laboratory Center, Department of Microbiology, Johns Hopkins University School of Medicine and School of Hygiene and Public Health. Baltimore, Maryland. Received for publication July 13, 1961 2. Diseñe dos experimentos, uno para probar que una proteína es translocada usando el sistema Sec y otro a través de ABC. (10 pts). Sistema Sec Se debe localizar el gen que codifique para la proteína que se sospecha es translocada por el sistema Sec. Luego se hace una fusión traduccional con un reportero que este activo en periplasma, por ejemplo fosfatasa alcalina (Pho A). Para comprobar que la proteína en cuestión es translocada por sistema Sec se debe mutagenizar al menos uno de los componentes del sistema de forma que no se pueda llevar a cabo la translocación de la proteína. En E. coli, por ejemplo, se puede mutar sec A, que es un componente periferial de la translocasa. Sec A tiene función de ATPasa y es la que recibe la pre-proteína y sufre el cambio en conformación que resulta en el enlace de ATP. Este enlace de ATP es responsable de la translocación de parte de la pre-proteína. La chaperona que se encarga de transportar la pre-proteína hasta el lugar en la membrana donde ocurrirá la translocación se conoce como sec B [1]. Por lo tanto, si se muta sec A, el complejo de la translocasa va a estar incompleto y sec B no va a poder transferir la pre-proteína de manera que pueda translocarse. Después se hace un fraccionamiento celular y se verifica la actividad del reportero en los distintos compartimientos. Para el mutante de E. coli con el complejo de la translocasa deficiente no se va a
    • observar señal en el periplasma porque la proteína no puede pasar a través de la membrana citoplasmática. Luego se le puede insertar a este mutante un vector con el gen que codifica para la ATPasa (sec A) del complejo de translocasa en E. coli. Después de crecer estas bacterias y llevar a cabo el fraccionamiento celular se va a observar actividad en el periplasma. Esto comprobaría que la proteína de interés se transloca utilizando el sistema sec y que un solo componente que este mutado ya es suficiente para incapacitar la translocación de la proteína. Referencia: [1] White, D. (2007). The Physiology and biochemestry of prokaryotes 3rd edition. In Chapter 17: quot;Protein Transportquot; (pp. 438-4). New York: Oxford University Press. Sistema ABC Un experimento para determinar el transporte de proteínas a través del sistema ABC, sería validando la función del mismo sistema. Se debe crear una mutación de deleción (para formar una pérdida o impedimento de función) en el segmento del gen que codifica para el motif C del transportador. El motif C es altamente conservado en el sistema ABC y sus función es llevar a cabo hidrólisis de ATP (Hung LW). La mutación en este segmento de la proteina, impediría el transporte de proteínas específicas para el sistema ABC hacia las membranas externas e internas del organismo. Se utilizaría la proteasa alcalina, que es una proteína distintiva de la bacteria Pseudomonas aeruginosa, para ser marcada con “green fluorescent protein” (GFP) y poder observar la acumulación de la proteína no-transportable en la célula. El control para el experimento sería crecer las bacterias sin la mutación de deleción en el segmento del gen que codifica el motif C. El transporte no se veria afectado quedando totalmente funcional y permitiendo el paso de la proteasa alcalina hacia el exterior de la célula. Para verificar los resultados, se podría cotejar la presencia y ausencia de la proteasa alcalina en los diferentes compartimientos a través de fragmentación celular por la fluorescencia de GFP.
    • Referencia: [1] Crystal structure of the ATP-binding subunit of an ABC transporter. Hung LW, Wang IX, Nikaido K, Liu PQ, Ames GF, Kim SH; Nature 1998;396:703-707 3. Se cree que el concepto de sistemas regulación por dos componentes puede ser involucrado en procesos de control estructural y función. Mencione y describa cuatro ejemplos donde uno de ellos sea la formación de porinas por cambios en osmolaridad. (20 pts) Distintos organismos han desarrollado sistemas que ayudan en la transducción de señales y a detectar factores ambientales. Algunos de los factores ambientales que influyen en las respuestas adaptativas que puede generar una bacteria para sobrevivir en el ambiente son: los cambios en temperatura, en el pH, la intensidad de luz, la concentración de nutrientes, la presencia de repelentes y atrayentes, resistencia a antibióticos y cambios en osmolaridad [6]. Por tal razón el sistema regulador de dos componentes permite que bacterias puedan adaptarse a distintas condiciones ambientales [3]. Este sistema de regulación consiste de dos proteínas asociadas: una proteína sensora (HPK) y una proteína reguladora de respuesta [1-7]. La proteína sensora se encuentra localizada en la membrana y actúa como el receptor del estímulo ambiental. La proteína reguladora de respuesta se encuentra en el citoplasma siendo la encargada de regular los cambios en la expresión de genes. La señal fluye desde la proteína sensora hasta la proteína reguladora mediante el proceso de fosfoliración involucrando residuos de histidina y aspartato. La proteína sensora tiene la capacidad de autofosforilar un residuo de histidina para luego transferir el grupo fosfato a un residuo de aspartato que se encuentra asociado a la proteína reguladora [2]. Existen varios ejemplos en que el sistema de regulación de dos componentes está involucrado en procesos de control estructural y función. Uno de estos ejemplos es la formación de porinas por cambios en osmolaridad mediante el sistema EnvZ/OmpR, el cual regula la expresión de genes para la síntesis de porinas [7]. La bacteria Escherichia coli contiene las porinas OmpC y OmpF en su membrana. El poro de la OmpC es pequeño, mientras que en la OmpF el poro es grande. En medios de alta osmolaridad se favorece un aumento en la proporción de la OmpC, lo cual supone que sólo entren moléculas pequeñas e impidiendo la entrada de moléculas mayores en tamaño, moléculas hidrofóbicas y cargadas negativamente [1]. Las condiciones ambientales de alta osmolaridad son características de los fluidos dentro del cuerpo, como los del tracto digestivo. Por tal razón, la OmpC en las enterobacterias colabora en la protección y retraso de la entrada de substancias toxicas como las sales biliares que existen en el ecosistema intestinal. Fuera del cuerpo hay un ambiente externo de baja osmolaridad y bajas concentraciones de toxinas y nutrientes.
    • Aumentando la proporción de OmpF, siendo más ventajoso ya que contiene el poro más grande facilitando la entrada de nutrientes. [4,7] La proporción de ambas porinas está regulada por un mecanismo genético que depende de la presión osmótica del ambiente. El aumento en la osmolaridad es detectado por la proteína sensora llamada EnvZ, la cual fosforila a la proteína reguladora de respuesta OmpR. La OmpR controla las proporciones relativas de las porinas OmpC y OmpF en la membrana externa y en altos niveles de OmpR-P (fosfatado) estimula la formación de la porina de poro más pequeño, haciendo que predomine la OmpC. [6] Otro ejemplo de sistemas de regulación por dos componentes es el de BaesSR, el cual controla la expresión de los genes transportadores que confieren resistencia a antibióticos en Escherichia. coli. Mediante el análisis del genoma de dicha bacteria se han encontrado 29 proteínas sensoras, 32 proteínas reguladoras de repuesta y un Hpt dominio de proteína. Cada proteína sensora en la bacteria E.coli es específica para los distintos estímulos ambientales que puede enfrentar. En estudios realizados se encontró que el sistema de dos componentes BaeSR controla la resistencia a antibióticos de E. coli al regular la expresión de genes transportadores de antibióticos. La proteína reguladora de respuesta BaeR controla la expresión de los genes mdtABC y acrD, los cuales codifican para múltiples sistemas de transporte de medicamentos (antibióticos). La sobreproducción de la proteína BaeR en un trasfondo de deficiencia de los múltiples sistemas transportadores AcrB de E. coli, le confiere resistencia a la bacteria contra lactámicos, novobiocina, “sodium dodecyl sulfate” y sales biliares. [3] Un tercer ejemplo que se puede mencionar es el de la bacteria Bacillus subtilis, en la cual se han encontrado 36 proteínas sensoras y 35 reguladores de respuesta, de los cuales alrededor de 30 pares de proteínas sensoras-reguladoras se encuentran en el operon del genoma. Alrededor de 10 sistemas de regulación por dos componentes se han caracterizado en esta bacteria. El sistema DesK/DesR está involucrado en “thermosensing” y transducción de señales de bajas temperaturas. Existe otro sistema como el YycG/YycF, que se ha encontrado que es esencial para el crecimiento bacteriano de B. subtilis. [2] Un cuarto ejemplo que se puede mencionar es el de la bacteria Streptococcus pneumoniae existe 13 sistemas de regulación por dos componentes y una proteína reguladora de respuesta. Uno de los sistemas de regulación en esta bacteria es el sistema CiaR/CiaH, el cual pertenece a la familia de EnvZ/OmpR. El sistema de neumococos de transducción de señales de dos componentes más estudiado ha sido el sitema ComDE, el cual está envuelto en competencia genética en respuesta a “competence-stimulating peptide”. Otro sistema que ha sido parcialmente caracterizado es el sistema BlpR/BlpS (TCS13). Dicho sistema es activado por el péptido BlpC autoinducible y controla la producción de bacteriocina. Ocho de los sistemas de regulación han demostrado ser importantes
    • para el crecimiento e infección en el tracto respiratorio del ratón, asumiendo que son importantes para la patogénesis de S. pneumoniae. [6] Referencias: [1] Eleanore T. Wurtzel, Mei-Yin Chou, and Masayori Inouye. (1982). Osmoregulation of Gene Expression I. DNA sequence of the ompR gene of the ompB operon of Escherichia coli and characterization of its gene product. The Journal of Biological Chemistry, (pp. 13685-1369). Vol. 257. No. 22 [2] Kazuo Kobayashi, Mitsuo Ogura, Hirotake Yamaguchi, Ken-Ichi Yoshida, Naotake Ogasawara, Teruo Tanaka and Yasutaro Fujita. (2001). Comprehensive DNA Microarray Analysis of Bacillus subtilis Two- Component Regulatory Systems. Journal of Bacteriology, (pp. 7365–7370). Vol. 183, No. 24 [3] Kunihiko Nishino, Takeshi Honda, and Akihito Yamaguchi. (2005). Genome-Wide Analyses of Escherichia coli Gene Expression Responsive to the BaeSR Two-Component Regulatory System. Journal of Bacteriology, (pp.1763–1772). Vol. 187, No. 5 [4] Linda J. Kenney, Mark D. Bauers, and Thomas J. Silhavy. (1995). Phosphorylation-dependent conformational changes in OmpR, an osmoregulatory DNA-binding protein of Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (pp. 8866-8870). Vol. 92 [5] Sally M. Hoffer, Hans V. Westerhoff, Klaas J. Hellingwerf, Pieter W. Postma, and Jan Tommasen. (2001). Autoamplification of a Two-Component Regulatory System Results in “Learning” Behavior. Journal of Bacteriology, (pp.4914–4917). Vol.183, No. 16 [6] Stuart J. McKessar and Regine Hakenbeck. (2007). The Two-Component Regulatory System TCS08 Is Involved in Cellobiose Metabolism of Streptococcus pneumoniae R6. Journal of Bacteriology, (pp. 1342– 1350) Vol. 189, No. 4 [7] White, D. (2007). The Physiology and biochemestry of prokaryotes 3rd edition. In Chapter 18: quot;Microbial Development and Physiological adaptationsquot; (pp. 492-494). New York: Oxford University Press. 4. Utilizando un diagrama de flujo, y desde el punto de vista quimiotáctico, presente lo qué ocurriría fisiológicamente con una bacteria: (20 pts) (1) si hay un atrayente y un repelente presentes, pero hay mayor concentración de repelente. La quimiotáxis es el mecanismo que la bacteria utiliza para dirigirse en el ambiente de acuerdo a la presencia de atrayente o repelente. El o los flagelos de la bacteria pueden moverse “contra reloj” (CCW) o a “favor de reloj”(CW). Si utiliza el primero veremos que el movimiento que va presentar el organismo es el denominado movimiento dirigido o lineal, mientras que el segundo genera el movimiento denominado “tumble” en el cual la bacteria se queda en un solo lugar. Este último lo utiliza para detectar en qué dirección está el atrayente y poder reorientarse en dirección a él para hacer nuevamente movimiento lineal. El siguiente diagrama muestra ambos movimientos:
    • Movimiento lineal Movimiento “Tumble” o El comp portamiento que exhib o ben las bac cterias va a depender de la pres r sencia de atrayente o repe elente que haya en el ambiente. En un me . edio con at trayente se va a supr e rimir el mov vimiento de e “tum mble” y por lo tanto la bacteria es stará un tie empo más prolongado en movim o miento dirigi o lineal ido l. En e este proces estará deteniéndos algunas veces par realizar “tumble” y reorientars Por otra so d se s ra se. a parte en prese encia de un repelente se detendr más vec para re n rá ces ealizar “tumble” y estará periodos s brev en mov ves vimiento line eal. http://emon h net.biology.y yale.edu/ag gentcell/car rtoon.gif En e esta repres sentación ve emos el mo ovimiento q exhibe la bacteria desde me que a enos conce entración de e atray yente hast donde hay mayo concentr ta or ración del mismo. E el caso de que haya una En o a conc centración mayor de repelente q de atra r que ayente la ba acteria opta por ale ara ejarse aun c cuando hay y atray yente. Esto se debe a que con cada epis o sodio de “tu umble” que haga la b e bacteria, al haber más s repe elente pres sente, dete ectara al m mismo más veces de las que detecte at s e trayente po estar en or n cant tidades menores. Esto por lo tant la llevara a alejarse cada vez más. o to a e (2 en prese 2) encia de un atrayente si los MCP están m n P’s mutados de tal maner que siempre están e ra n meti ilados.: La metilación de las MCPs que es realizada p CheR c por constantem mente, caus la neutra sa alización de e carg en esta proteína lo que a su v reduce los efectos de repulsión electros gas a o vez e s stática lo qu fuerza la ue a sepa aración de terminales carbonilos Esto perm que se restablezc el complejo recepto activo de s. mite e ca or e Che eA-CheW. A ocurrir es la acció de autof Al sto ón fosforilación de CheA comienza. CheA-P e n A entonces se e enca arga de fos sforilar a CheB y Che Esta ú C eY. última actúa sobre el motor flagelar lo que promueve a e e mov vimiento “CW y por lo tanto “tum W”, o mble”. Por o parte c otra cuando hay presencia de atrayen éste se y a nte, e enla a los receptores lo que causa un cambio en confor aza o a o rmación y p lo tanto disminuye la actividad por d de a autofosforila ación de CheA. Con n niveles bajo de CheA también disminuye CheY-P l que lleva os A-P n lo a
    • a movimiento lineal o “sm mooth swim mming”. En el caso d que hay una mut n de ya tación de lo MCPs y os esto se mante os engan metilados, ento onces la acc ción de CheB-P que e demetila los MCPs no tendrá es ar s, á efec cto sobre ellos. Com consec mo cuencia la acción autofosforila adora de C CheA se mantendrá á, aum mentarán los niveles de CheA-P y por lo ta s d anto tambié de CheY lo que mantendrá la bacteria én Y-P a haci iendo “tumble”, aun cuando est en prese c té encia de at trayente. E siguiente es un dia El e agrama que e mue estra el mec canismo de las proteín Che. e nas “Tummble” – se re ealiza cuando los CheY se Y qued fosforilad y dan dos activ FLIM van 5. Di iagramáticam mente repre esente el mo odelo de interacción entr las proteín re nas Af fectadas y la involucrad en las siguientes sit as das tuaciones: (2 20pts) a. prese encia de per róxido de hid drógeno en e medio de cultivo. el El peróxi de hidro ido ogeno (H2O2 es un ag 2) gente oxidan que pued originarse en el met nte de tabolismo de e muchas bacteria aeróbicas y anaeróbicas. En el c as s caso de las bacterias a aeróbicas y a aeróbicas fa acultativas e el H2O es a su v transform intracelularmente po medio de la enzima c O2 vez ma or catalasa. El H2O2 inhibe o destruye e e las b bacterias por medio de la inactivació de enzimas. (4) Este se descomp r a ón pone fácilme ente produciendo agua y oxige eno, pero d dentro de la células e as esta descom mposición se debe por acción de l enzima c e la catalasa que e neut traliza la acc ción de este químico. P e Pero si la bacteria no p produce esta enzima su mecanism de acción a u mo n cons siste en la o oxidación de los grupo sulfhidrilo y los dob os o bles enlaces de los enz s zimas de la bacterias as s, prov vocando una modificació conforma a ón acional de la proteínas que forman dichos enz as n zimas, con la pérdida de a e su fu unción, y po lo tanto, la muerte celular. (fig. #1 Lo más q afecta a la bacteria son los rad or a 1) que a dicales libres s que se producen de la descomposición de H2O2, afectando la célula. n
    • Uno de los ejemplos donde observamos que la proteína OxyR es activada luego de recibir un estimulo al exponerse a un ambiente oxidativo es cuando los factores de transcripción redox de los procariotas se unen al DNA, ya que esta acción solo se realiza cuando están baja condiciones de estrés oxidativo. Es demostrado por OxyR la firmeza de la Figura # 1 union refleja el tipo de modificacion oxidativa de las cisteínas reactivas (S- OH, S-SG, S-NO). (3)(Figura # 1) Una de las proteínas que regula su expresión en presencia de H2O2 es OxyR en especial en organismos gram (-). (Fig. #1) OxyR es un activador clase I, este se une a secuencia blanco de DNA interactuando con el terminal carboxilo α de RNA polimerasa. Esta proteína es activada a través de oxidación, que resulta en la formación de enlaces disulfuro entre cisteínas. (1) Su función varía dependiendo de los organismo que la posea en N. gonorrhoeae OxyR es un regulador negativo, esta es distinta en E. coli y S. typhimurium en donde OxyR es un regulador positivo de la expresión de catalasa y incrementa la sensitividad de H2O2 en cepas mutantes de OxyR. Esta regula la expresión de la mayoría de las respuestas de H2O2 en E. coli, incluyendo katG. Los genes que regulan OxyR están directamente e indirectamente relacionados con las funciones de defensa contra el estrés oxidativo. La actividad del peróxido de hidrogeno es reversible ala de OxyR en el proceso de la oxidación de los residuos de las dos cisteínas y la formación del doble enlace desulfuró intermolecular. (2) Algunas de las enzimas que la expresión es regulada por OxyR esta katG, gorA, grxA, ahp C y ahpF. (1) (1) Albert G. Moat, John W. Foster and Michael P. Spector (2002) Microbial Physiology 4th edition. In chapter 18: Microbial Stress Responses (pp. 592-595) New York, Wiley-Liss (2) Kate L. Seib, Hsing-Ju Wu, Yogitha N. Srikhanta, Jennifer L. Edwards,Megan L. Falsetta, Amanda, J. Hamilton, Tina L. Maguire, Sean M. Grimmond, Michael A. Apicella, Alastair G. McEwan and Michael P. Jennings. 2007. Characterization of the OxyR regulon of Neisseria gonorrhoeae. J. Molecular Microbiology. 63(1), 54–68 (3) G Filomeni, G Rotilio and M R Ciriolo (2005) Disulfide relays and phosphorylative cascades: partners in redox-mediated signaling pathways. J. Cell Death & Differentation. 12, 1555–1563. (4) Universidad Nacional de Colombia. 2004. Peróxido de hidrogeno. 7 de abril de 2009. http://www.virtual.unal.edu.co/cursos/agronomia/2001819/lecciones/cap06/cap06_02.html b. Cambiar la temperatura de un microorganismo que de 37oC a 42oC. Cada microorganismo posee condiciones y temperaturas específicas a las cuales su crecimiento y condiciones internas se encuentran en un estado óptimo y constante. Alterar los mismos o exponerlos a algún
    • tipo de estrés, puede conllevar a cambios, los cuales podrían ser letales si no poseen los mecanismos necesarios para su estabilización. El aumentar la temperatura de una bacteria con temperatura óptima de 37 a 42 podría provocar en la misma tanto cambios morfológicos como fisiológicos. Un ejemplo de esto es el caso de la bacteria E. coli. El aumentar la temperatura de ésta a 42 induce a la producción de unas proteínas llamadas Proteínas de cheque térmico (Hsp). Las proteínas de choque térmico son uno de los más importantes factores de protección contra el estrés en todos los organismos (2). Estas proteínas aunque se encuentran en bajas concentraciones en la célula normalmente, es en estrés térmico cuando su producción y estabilidad aumenta. Algunas de las HSP son chaperonas no forman parte de la estructura primaria de la proteína funcional, son moleculares las cuales unen y estabilizan las proteínas a fases intermedias de dobles, montaje y translocacion a través de las membranas y la degradación (3). Estas proteínas participan en el plegamiento de proteínas recién sintetizadas y protegen a las ya existentes de los procesos de desnaturalización producidos por el incremento de la energía cinética de las distintas moléculas ante un incremento de temperatura. (5) Los cambios de conformación tridimensional de las proteínas pueden estar afectados por un conjunto de varias chaperonas que trabajan coordinados, dependiendo de su propia estructura y de la disponibilidad de las chaperonas. Existen unas HSP específicas las cuales tienen un papel importante en la regulación de apoptosis de la célula. Esto es posible ya que estas HSP interactúan directamente con los componentes principales de la ruta apostólica.(3) Otras proteínas de choque térmico, como la HSP70 y la gp96, están en estudio en vacunas para tratar el cáncer. (4) A mayor temperatura M. xanthus induce la síntesis de un mayor número de proteínas en respuesta al cambio brusco de To. Finalmente se establece que M. xanthus es capaz de crecer y proliferar a temperaturas elevadas de forma similar a otros microorganismos, probablemente estas proteínas le permiten a este microorganismo sobrevivir en su ambiente natural en donde la temperatura del suelo cambia conforme pasa el tiempo.(5) Otra de las funciones de las HSP son que permiten el paso de proteínas de un compartimiento de la célula a otra y transportan viejas proteínas a depósitos de basura dentro de la célula. Proteínas de choque térmico también se cree que desempeñan un papel en la presentación de fragmentos de proteínas (péptidos o) sobre la superficie de la célula para ayudar al sistema inmunitario reconoce las células enfermas. (6) No importa si el organismo se mantiene expuesto a estas temperatura, la expresión de HSP ira disminuyendo hasta llegar a su nivel normal, ya que solo durante el periodo inicial de estrés la síntesis de HSP está en su máximo nivel. (3) Figura # 2, En esta se observa la función de las HSP la cual es ayudar en el doblamiento de las proteínas, para adquirir su estructura funcional. La grafica nos muestra como el aumento de temperatura beneficia la viabilidad de las células.
    • Referencias: (1) D Lanneau , M Brunet , E Frisan , E Solary , M Fontenay , and C Garrido (2008) Heat shock proteins: essential proteins for apoptosis regulation. J. Cell Mol Med (2) Dr. Cronje MJ (2009) Cellular stress and Heat Shock Protein. University of Johannesburg. (3) Dr. Landry (September, 1998) Protein Interactions and Molecular Chaperones. Tulane University (4) Instituo nacional del cáncer. 2009. Proteína de choque térmico. 6 de abril de 2009. http://www.cancer.gov/Templates/db_alpha.aspx?CdrID=617664&lang=spanish (5) Mosser, D.D., Caron, A. W., Bourget, L., Meriin, A.B., Sherman, M. Y., Morimoto, R.I., and Massie, B. (2000). The Chaperone funtion of Hsp 70 is required for protection against stress - induced apoptosis. Mol. Cell. Biol. 20, 7146-7159. (6) Antigenics. 2008. Proteínas de choque térmico: fundamentos. 7 de abril de 2009. http://translate.google.es/translate?hl=es&langpair=en|es&u=http://www.antigenics.com/products/tech/h sp/&prev=/translate_s%3Fhl%3Des%26q%3Dproteinas%2BHsp%26tq%3Dprotein%2BHSP%26sl%3D es%26tl%3Den (7) Assay Design. 2009. Proteins. 8 de abril de 2009. http://images.google.es/imgres?imgurl=http://www.assaydesigns.com/corp/images/hsp70- pathway.jpg&imgrefurl=http://www.assaydesigns.com/cccrp1073-1015-proteins- proteins.htm&usg=__k0HjdkmnqSg4HvJlwLXQdDRRUkk=&h=800&w=800&sz=122&hl=es&start=29&u m=1&tbnid=2Y- CG0vBfW1sOM:&tbnh=143&tbnw=143&prev=/images%3Fq%3DHSP%26ndsp%3D18%26hl%3Des%2 6rlz%3D1B3GGGL_esPR238PR238%26sa%3DN%26start%3D18%26um%3D1 (8) Albert G. Moat, John W. Foster and Michael P. Spector (2002) Microbial Physiology 4th edition. In chapter 18: Microbial Stress Responses (pp. 596-601) New York, Wiley-Liss (9) A Parcellier , S Gurbuxani , E Schmitt , E Solary , and C Garrido (2003)Heat shock proteins, cellular chaperones that modulate mitochondrial cell death pathways .Biochem Biophys.304: 505-12. (10) J. Starmer, A. Stomp, M. Vouk and D. Bitzer (2005) Predicting Fidelity of Protein Synthesis in E. coli. 6. En la replicación microbiana las proteínas Fts y Mreb juegan un papel protagónico. Presente un modelo secuencial de participación de estas proteínas en el proceso de replicación y las consecuencias de haber mutaciones en las mismas que eviten su expresión y actividad. (10 pts). En E. coli las proteínas del citoplasma MreB y FtsZ juegan un papel importante en asegurar que la nueva subunidad de peptidoglucano se inserte en la pared celular en la ubicación correcta durante la elongación y la división celular. En particular, para mantener un diámetro constante y una figura definida, en adición para que se inserte nuevo material (peptidoglucano) dentro de la pared uniformemente alrededor del perímetro de la célula. La función de la proteína Fts es intervenir en la
    • división de las bacterias, si este se muta las bacterias no se pueden dividir y todas las copias de las células se quedan unidas a la célula madre formando una célula alargada. En cambio la proteína Mreb interviene en la forma que asume la bacteria, si este está activo la bacteria es alargada (bacilo), pero si esta mutada la bacteria es redonda (coco). Esto se ha comprobado experimentalmente ya se ha inhibido la proteína MreB con antibióticos (A22) y esto no ha afectado la inserción de una nueva pared, en cambio la célula pierde su forma alargada y se torna en una redonda. Esto sustenta que la forma de la célula es determinada solo por la presencia o la ausencia de MreB y no por la regulación de la distribución del nuevo material de la pared celular donde está involucrado FtsZ. Una forma simple de visualizar como esto ocurre en células en forma de bacilo, es cuando la pared es creada por dos procesos alternados. En el primer proceso, se inserta nuevas moléculas de peptidoglucano al lado de la pared permitiendo que la célula se alargue y de esta forma crear un espacio en donde el material citoplasmático es segregado. En la segunda etapa la síntesis del peptidoglucano (PG) es completada, luego comienza a invaginarse la pared en el centro formando unos anillos para dividir la célula en dos y a la misma vez completar el proceso de segregación del citoplasma. En la bacteria E.coli el proceso de elongación de la célula es controlada por la proteína MreB, se cree que su función es para localizar los componentes de la maquinaria de la síntesis de peptidoglucano a lo largo de la pared celular, controlando la geometría del crecimiento de la pared. La división celular es iniciada cuando el homologo de la proteína tubulina (FtsZ) es condensado en el interior de la membrana en el centro de la célula y esto desencadena la invaginación por la atracción de un par de proteínas que forman el septo del anillo. Así, MreB se encarga de la inserción del PG en la pared y Ftsz se encarga del desarrollo del septo de la pared. Las proteínas MreB y FtsZ están localizadas en al lado del citoplasma de la membrana interior, mientras que la síntesis de PG está localizada en el periplasma. Estas proteínas nunca entran en contacto con el periplasma, están interactúan con la síntesis de PG indirectamente a través de unas proteínas transmembranales. (1)
    • En este dibujo se observa el efecto en la morfología de las bacterias al inhibir alguna de las proteínas que interactúan en la división celular. (A) y (F) Inhibición de MreB y FtsZ (B) y (E) inhibición de FtsZ con SulA por pFAD38 (C) y (D) inhibición de MreB con el antibiótico A22. (2) (3)
    • (4) Referencias ( Archana Varma and Kevin D. Young (abril, 2009) In Escherich coli, Mre and FtsZ direct the a n eB Z hia (1) synthesi of lateral cell wall via independ is dent pathwa that req ays quire PBP 2 J. Bacteri 2. riology. 10.11288 ( Archana Varma, Miguel A. de Pedro,† an Kevin D. Young. (2 a nd 2007) FtsZ D Directs a Second (2) Mode of Peptidogly f ycan Synthe esis in Esch iology. Vol. 189, No. 15 herichia co J. Bactei oli. ( Martin T Thanbichler & Lucy Shapiro. (200 Getting organized — how bac 08) cterial cells move (3) proteins and DNA. J. Nature R Review. 6, 228-40 ( Ramón Muñoz-Chá ápuli. (2001 ¿Existe u citosque 1) un eleto en pro ocariotas? (4) uentros en la Biología 7 73:5-7 J. Encu l 7. Usando el pr rograma Tm mpRed, sug giera la loca alización y topología d la siguiente proteína. de Aseggúrese de i incluir la gr ráfica de hid drofobicidad (10 pts) d.
    • -----> STRONGLY prefered m > Y model: N-ter rminus outsidde 12 strong transmmembrane he elices, total s score : 21406 # fro om to length score orien h ntation aa (i) a (t) # aa aa score d dirección 1 61 77 7 17 1176 o o-i 2 90 108 1 19 2473 i-o 3 157 174 1 18 1743 o o-i 4 214 233 2 20 2094 i-o 5 237 258 2 22 1557 o o-i 6 276 293 2 18 941 i-o 7 303 322 3 20 2413 o o-i 8 344 361 3 18 981 i-o 9 388 406 4 19 1213 o o-i 10 421 440 4 20 1743 i-o 11 493 511 5 19 2652 o o-i Gra afica de hidrofobicidad donde nos muestra la d s as 12 543 560 5 18 2420 i-o partes de la proteina que son hidr p rofobicos e hidrofilicos. Ta abla que util lizamos para determin que nar fragmenntos de la p proteína era an trans smembrana ales y cuale estaban solubles es en e el citopla asma. Al analiz los resu zar ultados obte enidos del programa T TmpRed pu udimos iden ntificar 12 r regiones de e la p proteína qu son tran ue nsmembran nales (hidro ofóbico), y 11 que e están solub bles en el citoplasma a (hidr rofílicos). P la loca Por alización de las regio ones trans smembrana ales pudimo determi os inar que e el term minal amino (N) y el carboxilo (C se encue o C) entran fuera de la me a embrana. P Podemos in nferir según n los resultados obtenidos que la p s proteína es una tr ransmembra anal multip paso en β β-lámina. A
    • continuación expondremos algunas de las características que tiene estas proteinas, las cuales rectifican nuestros resultados. La hoja plegada β o β-lámina es un tipo de estructura secundaria que pueden adoptar distintas proteínas integrales de la membrana. Muchas de las proteínas con estructuras de β-lámina pueden ser expresadas en forma de agregado o cuerpos de inclusión y re arregladas en su conformación original. Estas proteínas transmembranales pueden atravesar la bicapa múltiples veces utilizando un mínimo de 10 amino ácidos (aa). Algunos de los organismos que posee este tipo de proteínas son los cloroplastos, mitocondrias y las bacterias. (3) Muchas de las proteínas β- láminas, se presentan en la naturaleza como OMP’s. (1) La única localización conocida para las β- láminas en bacterias es en la membrana externa de las Gram negativas. (2) Las proteínas β-láminas muestran una variedad de funciones, incluyendo el transporte pasivo de iones y pequeñas moléculas hidrofílicas, la exportación de “xenobiotics”, la importación de “siderophore-bound iron” y también tiene un rol en la patogenicidad bacteriana. De estas funciones, dos son de partículas importancias al momento de predecir la topología de la β-lámina: se establece que el N- y C- terminal se encuentran localizados en el espacio periplásmico del final de la β-lámina, limitando el número de hebras a solo valores pares. De igual forma se establece que las conexiones de la parte externa de la β-strand son loops largos y las de la hebra del espacio periplasmico son cortas. (3) Referencias (1) Ioannis K. Valavanis Pantelis G. Bagos Ioannis Z. Emiris (2006) β-Barrel transmembrane proteins: Geometric modelling, detection of transmembrane region, and structural properties Source. J. Elsevier Science Publishers B. V. 30, 416-424 (2) Georg E Schulz (2000) β-Barrel membrane proteins. J. Science Direct. 10(4):443-7. (3) Paul D Taylor,1 Christopher P Toseland,2 Teresa K Attwood,3 and Darren R Flower (2006) Beta barrel trans-membrane proteins: Enhanced prediction using a Bayesian approach. J. PubMed Central. 1(6): 231–233. (4) Pantelis G. Bagos*, Theodore D. Liakopoulos, Ioannis C. Spyropoulos and Stavros J. Hamodrakas (2004) PRED-TMBB: a web server for predicting the topology of b-barrel outer membrane proteins. J. Nucleic Acids Research, Vol. 32. Bono: Describa los factores involucrados en la morfología microbiana (10pts) La temperatura es un factor que afecta el crecimiento microbiano. Las formas de un microorganismo (micelio, levadura) poseen una temperatura máxima para la cual el crecimiento más rápido.
    • Un organismo como Blastomyces dermatitidis crece en forma mycelial dede temperatura ambiente hasta 33°C. De 35°C a 37°C crece en forma de levadura. Treponemes expuestos a temperaturas sobre 40°C forman esferas. Al bajar la temperatura algunas bacterias tienden a reducir su tamaño ya que a menor tamaño, mayor velocidad y eficiencia en el intercambio de nutrientes. El pH también afecta el crecimiento microbiano. La formación de micelio aéreo en Blastomyces dermatitidis es restringida a pH de 4.5 o menos. La combinación de los factores de temperatura y pH tiene diferentes efectos en el crecimiento microbiano. A temperatura ambiente y una variación en pH Blastomyces dermatitidis restringe la formación de micelio mientras mas alto sea el pH. Al aumentar la temperatura a 33°C se restringe la formación de micelio a cualquier concentración de pH. Los nutrientes disponibles también afectan la morfología microbiana. En un medio deficiente para el crecimiento de Blastomyces dermatitidis, la levadura y el micelio serán diferentes. Spiroplasma citri crece en forma redonda en ausencia de un surem PPLO, cambiando su forma espiral, helicoidal y filamentosa. Reiter treponemes mantiene su forma espiral al ser suspendido en solución de NaCl fisiológico mientras que en agua destilada adquiere un forma esférica, este cambio en morfología esta determinado por la presión osmótica. Un cambio en la concentración de lípidos debido a la presencia o ausencia de lípidos en el medio puede afectar la morfología microbiana. Mycoplasma mycoides produce filamentos cortos en un medio sin colesterol mientras que en un medio con colesterol los filamentos producidos por este microorganismo son largos. Deficiencias de colesterol, Glicerol y ácidos grasos de cadenas largas produce formas muy frágiles en M. mycoides. La luz es un factor que afecta la producción de pigmento.
    • En Platypoecilus masculatus la coloración a la luz del sol, luz incandescente y ultravioleta varía dependiendo del tiempo de exposición. La temperatura afecta la pigmentación de los organismos. En Platypoecilus masculatus no produce pigmentación a 4°C mientras que al transferir el cultivo a 37°C se desarrolla el mismo nivel de pigmentación que el del organismo cultivado a 37°C. La concentración de Oxigeno también afecta la formación de pigmento. En Platypoecilus masculatus a condiciones anaerobias no hay formación de pigmento mientras que a condiciones aerobias se produce la pigmentación usual. La concentración de nutrientes también afecta la formación de pigmento. El Pigmento en S. aureus es mayor en medios ricos de agar sangre que las que crecen en medios de agar coagulado de Loeffler. Referencias (5) Albert G. Moat, John W. Foster and Michael P. Spector (2002) Microbial Physiology 4th edition. New York, Wiley-Liss (6) Effect of External Environmental Factors on the Morphologyof Spiroplasma citri R. PATEL,* K. J. MAYBERRY-CARSON, AND P. F. SMITH Department ofMicrobiology, University of South Dakota, Vernillion, South Dakota 5706. Received for publication 20 October 1977 .