B4 4 Methoden Den Gentechnologie 2010
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B4 4 Methoden Den Gentechnologie 2010 B4 4 Methoden Den Gentechnologie 2010 Document Transcript

  • Methoden der Gentechnologie im Überblick: Inhaltsverzeichnis 1.Stempeltechnik (Replica-Plating).................................................................................2 2.Genom-Bibliotheken...................................................................................................3 3.cDNA-Bibliotheken......................................................................................................4 4.Auffinden von DNA-Fragmenten durch Gelelektrophorese.............................................6 5.Sequenzieren von DNA mit der didesoxy-Methode nach Sanger....................................7 6.In-situ-Hybridisierung.................................................................................................9 7.Blot-Techniken.........................................................................................................10 8.ELISA......................................................................................................................11 9.Vervielfältigung von DNA-Sequenzen durch PCR.........................................................12 10.Synthese künstlicher DNA(-Sonden).........................................................................13 11.Genetischer Fingerabdruck......................................................................................14 12.Gendiagnostik........................................................................................................15 13.Gentherapie...........................................................................................................16 14.Grüne Gentechnik...................................................................................................18
  • 1. Stempeltechnik (Replica-Plating) Die Stempeltechnik („replica plating“) dient dazu, die Mangelmutanten eines Bakterienstammes zu identifizieren und anschließend isolieren zu können. Außerdem kann man so auch transfizierte Bakterien isolieren. Will man die Mangelmutanten einer Bakterienkolonie isolieren, so gibt man zu einem Flüssigmedium mit Bakterien ein Mutagen hinzu, wie zum Beispiel Histidin. Nun gibt man dieses Flüssigmedium auf einen Nährboden, auf die „replica plate“ und lässt die Kolonien dort wachsen. Mit einem Samtstempel kopiert man die „master plate“ auf die „replica plate“, auf der kein Histidin vorhanden ist. Die Kolonien, die auf der „master plate“, jedoch nicht auf der „replica plate“ wachsen sind Mangelmutanten. Bei der Selektion von transfizierten Bakterien nutzt man das gleiche Verfahren. Man hat ein Flüssigmedium mit transfizierten Bakterien, ohne Plasmid und Bakterien mit Plasmid. Dieses gibt man anschließend auf die „master plate“ mit Tetracyclin, auf welcher die Bakterien ohne Plasmid nicht wachsen. Nun überträgt man die Kolonien mit Hilfe der Stempeltechnik auf ein Medium mit Ampicilin, die „replica plate“. Im Rückschlußverfahren kann man somit die transfizierten Bakterien herausfinden. Denn an den Stellen, an denen zuvor auf der „master plate“ Kolonien gewachsen sind, wachsen nun auf Grund der fehlenden Amp- Resistenz, auf der replica plate nicht mehr.
  • 2. Genom-Bibliotheken Genbibliotheken Genbibliotheken sind ein unverzichtbares Werkzeug in der Molekularbiologie. Firmen sind entstanden, die eine Vielzahl von speziellen Genbibliotheken anbieten von Mikroorganismen, Pflanzen, Tiere, also von Organismen und bestimmten Organen (z.B. Leber, Gehirn). Somit entfällt die oftmals schwierige Selbstherstellung. Genbibliotheken lassen sich auf zwei verschiedenen Arten herstellen (siehe auch Genombibliothek und cDNA-Bibliothek). Genom-Bibliothek Um eine Genom-Bibliothek zu erhalten, muss man zunächst chromosomale DNA aus dem Gewebe z.B. eines Organes isolieren. Die DNA wird dann mit einem Restriktionsenzym (ECoRI) zerlegt. Die daraus resultierenden Fragmente repräsentieren das gesamte Genom, also mit Exons und Introns. Da die Fragmente beim Übertragen in Bakterien zu schnell von diesen abgebaut und somit verloren gehen würden, müssen die DNA-Fragmente zuerst in Vektoren eingebaut werden. Die DNA eines Vektors, z.B. eines Plasmids, wird ebenfalls mit Restriktionsendonuclease 'verdaut' (wiederum ECoRI): Es kommt zu einer Extraktion und einer Spaltung der DNA. Jetzt passen die DNA-Fragmente in die DNA des Vektors und durch DNA-Ligase wird das Zucker-Phosphat-Rückgrat wieder kovalent geschlossen. Diese rekombinanten Vektoren werden nun in die Wirtszelle, Bakterien, eingeschleust (Transformation). Durch Selektion der transfizierten Bakterien werden die DNA-Fragmente in den rekombinaten Vektoren in einzelnen Komponente aufgeteilt: Die Bakterien einer Kolonie beinhalten jeweils ein bestimmtes Genombruchstück, wie ein Buchtitel einer Bibliothek kann man 'nachschlagen'. Nachteil dieser Methode ist, dass die Bibliothek sämtliche nichtcodierende DNA-Abschnitte wie die Introns des Genoms oder repetitive Sequenzen beinhaltet. Somit ist es schwierig, ein bestimmtes Gen zu finden, ähnlich wie die berühmte „Nadel im Heuhaufen“.
  • 3. cDNA-Bibliotheken Um eine cDNA-Bibliothek zu erhalten, muss man zunächst die mRNA aus einem Organ oder bestimmten Gewebe isolieren. Dieser Vorgang ist technisch wesentlich anspruchsvoller als die Gewinnung genomischer DNA. Die so gewonnene mRNA kann jedoch nicht sofort mit Restriktionsenzymen verdaut werden. Ein Primer wird mit dem Poly-A'-Schwanz hybridisiert und stellt ein freies 3'-OH-Ende bereit. Die reverse Transkriptase, ein Enzym, welches in Retroviren wie z.B. HIV enthalten ist, benutzt dieses Ende, um die Synthese einer einzelsträngigen DNA anhand dieser mRNA zu katalysieren. Charakteristisch für die reverse Transkriptase ist nämlich, dass sie "rücktranskribiert". So erhält man eine komplementäre DNA, auch cDNA (complementary DNA/copy DNA) genannt. Nun wird die mRNA mit Ribonucleasen oder Natronlauge zerstört, bzw. abgebaut. Nun ist die cDNA-Kette frei. Die DNA- Polymerase ergänzt nun den DNA-Einzelstrang mithilfe von kurzen Zufallssequenzen, die als Primer dienen, zu einem Doppelstrang. Da die Schnittstellen für die Restriktionsendonuclease nicht zwingend enthalten sind, werden nun kurze Linker (Verbindungsstücke), die die Restriktionsschnittstellen enthalten, durch die DNA- Ligase angefügt. Die cDNA wird hydrolysiert (gespaltet), cDNA und Plasmidvektoren werden enzymatisch zusammengefügt (durch gleiche Restriktionsschnittstellen). Wie bei der Genom- Bibliothek werden cDNA und Plasmide nach der Hybridisierung durch DNA-Ligase geschlossen. So erhält man rekombinante DNA-Moleküle. Jetzt werden die Plasmide in Bakterien (E.coli) eingeschleust, was man auch als Transformation bezeichnen kann. Nun wird E.coli auf Nährböden vermehrt und anschließend werden die Bakterien selektiert, die Fremd-DNA-Stücke enthalten. → Ein Vorteil der cDNA-Bibliothek ist, dass sie eine Sammlung von den Genen ist, die tatsächlich zur Expression kommen, das heißt, dass z.B. keine Introns enthalten sind (bei mRNA-Spleißen schon entfernt). Damit kommt es zu einer Verringerung der klonierenden DNA-Menge. → Wenn man ein spezielles Gen sucht, bevorzugt man daher die cDNA-Bibliothek gegenüber der Genom-Bibliothek. → Für Genidentifizierung und -charakterisierung unentbehrlich, da RNA allein zu instabil für die meisten Analysemethoden ist. → Ein Nachteil dieser Bibliothek ist jedoch, dass es schwierig ist, sie in ausreichender Güte herzustellen. Jedoch kann die Polymerasekettenreaktion (PCR) dieses Problem bereits überwinden.
  • Allgemeine Anwendung/Perspektive •Erhaltung und Schutz der genetischen Vielfalt •Medizin (Herstellung Antikörper, Impfstoff) •Untersuchung des Genaufbaus •gezielte Mutation des Gens •Untersuchung der Funktion des Proteins •Eigenschaften von Proteinen verbessern (Screening) •Herstellung gentechnisch veränderter Mikroorganismen, Tiere, Pflanzen mit vielfältigen Anwendungen (Müllbeseitigung, krankheitsresistente Nutzpflanzen und Tiere) •Diagnose Erbkrankheiten --> Heilung Erbkrankheiten?
  • 4. Auffinden von DNA-Fragmenten durch Gelelektrophorese Die Gelelektrophorese ist eine Technik zur Trennung von Markomolekülen nach ihrer Größe, bzw. Länge. In der Regel wird sie für DNA aber auch für Proteine angewendet. Das Prinzip beruht darauf, dass sich geladene Moleküle entlang eines elektrischen Feldes durch ein Gel bewegen müssen. Vereinfacht kann man sich das Gel als schwammartige Struktur oder dreidimensionales Geflecht vorstellen, das die Moleküle bei ihrer Wanderung behindert. Je kleiner ein Abbildung 1 Molekül, um so leichter kann es durch die Poren des Gels wandern, um so schneller bewegt es sich vorwärts. Je nachdem, wie klein die Poren sind, brauchen die Moleküle länger, dafür ist auch die Autrennung feiner. So kann man mit Agarosegelen (größere Poren) DNA Fragmente grob trennen, mit Acrylamid Gelen DNA Fragmente bis auf eine Base Längenunterschied. Abbildung 1 zeigt den Aufbau einer typischen (horizontalen) Gelkammer mit der Spannungsquelle links. Das Gel liegt in einer Pufferlösung, die den Widerstand herabsetzt und das Gel vor Austrocknung schützt. Am Minuspol liegen die Taschen, in die die Proben pipettiert werden. Abbildung zwei zeigt ein Agarosegel mit eingearbeitetem Fluoreszensfarbstoff, nachdem die Proben 90 Minuten gelaufen sind. Nach der Auftrennung werden die Proben aus dem Gel geschnitten („Picking“) oder per Abklatsch („Blotting“) fixiert. © S.Blattmann
  • 5. Sequenzieren von DNA mit der didesoxy-Methode nach Sanger In vierVersuchsansätzen wird die DNA- Doppelhelix zunächst durch Hitze denaturiert und somit entstehen Einzelstränge, die zur weiteren Vorgehensweise benötigt werden. Die Einzelstränge werden am 3' Ende mit einem Primer markiert. Durch die Zugabe von DNA-Polymerase wird der komplementäre Strang synthetisiert. Danach werden parallel vier Reaktionen durchgeführt, bei denen jeweils eines der vier Kettenabbruchnukleotide (Didesoxynukleosidtriphosphat, ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) hinzugefügt wird. Diesen Nucleotiden fehlt die OH- Gruppe am 3' Ende wodurch eine Verbindung des Phosphats und der Desoxyribose nicht möglich ist. Dadurch kann keine Kettenverlängerung des komplementären Stranges stattinden und es kommt zufällig zum Abbruch, wodurch unterschiedlich lange DNA- Fragmente entstehen, die jeweils mit dem zugegebenen Didesoxynucleosidtriphosphat enden.
  • Um die DNA-Fragmente zu analysieren werden sie mit Hilfe der Gelelektrophorese getrennt. Hierbei werden die 4 Versuchsansätze jeweils auf ein Polyacrylamidgel gegeben und Spannung angelegt. Die kurzen DNA-Abschnitte wandern im Gel schneller und weiter Richtung Anode (+) als die langen Abschnitte. Durch diese Methode erhält man den komplementären DNA-Strang (ausgehend von der Anode abgelesen) und somit die gesuchte Basenabfolge des Einzelstranges. Anwendungsgebiet: Die DNA-Sequenzanalyse dient zur Untersuchung von genetischem Material. Perspektiven: Heute werden nicht mehr vier Ansätze, sondern nur noch einer benötigt. Die „Kettenabbruch-Nukleotide“ werden mit unterschiedlichen Fluoreszenz- Farbstoffen markiert, so können sie in einem Durchlauf von einem Detektor erkannt werden. Die Abfolge der Farbsignale, die am Detektor erscheinen (Chromatogramm) geben dann die Sequenzabfolge der Basen des sequenzierten DNA-Stranges wieder. Während früher der Primer radioaktiv markiert wurde, wir auch er seit Anfang der 90er Jahre mit Fluoreszenz-Farbstoffen gekennzeichnet. Erika Hilbold, Maike Schrader, Simone Lehmann
  • 6. In-situ-Hybridisierung Anwendungsbereich allgemein: Die In-Situ-Hybritisierung (ISH) ermöglicht das Auffinden spezifischer DNA Sequenzen in einem Präparat. So wird die ISH beispielsweise für die Diagnose verwende, wie zB den Nachweis vom Epstein Barr Virus. Funktionsweise •Zuerst brauchen wir eine Sonde aus einer DNA Probe oder künstlicher DNA, die komplementär zu dem DNA Abschnitt ist, den wir suchen. •Ein Fluoreszensfarbstoff (zB mit Haptenen wie Digoxigenin, Biotin, Dinitrophenol) wird dann an die Sonde gekoppelt, oder sie wird radioaktiv markiert mithilfe Radioaktiver Nukleotide (zB Trizium oder Schwefel) •Die DNA (oder RNA) wird dann bei 95°C denaturiert. •Die Sonde wird hinzugegeben und die Hybritisierungstemperatur wird runter gesetzt. •Die Sonde koppelt sich an die komplementäre Stelle, das Zielgen •Zielgen ist sichtbar Svenja Uhrig
  • 7. Blot-Techniken Southern-Blotting wird dazu verwendet, um in einem Gemisch von DNA- Fragmenten das Vorhandensein einer bestimmten Sequenz nachzuweisen. Entsprechendes gilt für das Northern-Blotting für RNA-Sequenzen und das Western-Blotting für Proteine. Für den Transfer vom Gel auf eine Membran (z.B. Nitrocellulose), das Blotting, stehen mehrere Verfahren zur Verfügung: · Kapillar-Blot: Eine Flüssigkeit zieht die DNA mit, meist eine Salzlösung. Diese läuft von unten über das Gel auf die Membran, da sich darüber saugfähiges Material befindet. Die DNA bleibt dabei in den Maschen der Membran hängen. Wie der Name schon sagt, funktioniert der Kapillar-Blot durch die Kapillarkräfte. Es darf allerdings keine Luft eindringen, da an diesen Stellen kein Transfer der DNA stattfinden kann. Der Nachteil dieses Verfahrens ist, dass die Flüssigkeit 10 bis 12 Stunden laufen muss und ein hoher Verbrauch der Salzlösung einhergeht. · Vakuum-Blot: Die Flüssigkeit wird, ähnlich dem Kapillar-Blot durch die Membran gezogen, nur dass die Flüssigkeit von einem Vakuum durch Gel und Membran gezogen wird. Der Vorteil hier gegenüber dem Kapillar-Blot besteht darin, dass er sparsamer und schneller ist. · Elektro-Blot: Hierbei wird die negative Ladung der DNA ausgenutzt. Das Gel liegt nahe der negativ geladenen Kathodenplatte, über der Membran befindet sich die positiv geladene Anodenplatte. Am besten man verwendet eine Salzlösung, denn durch sie kann der Strom fließen. Wird nun eine Sannung angelegt, bewegt sich die DNA Richtung Anode und bleibt in der Membran hängen. Ramona
  • 8. ELISA = (enzyme-linked immunosorbent assay, dt. Enzym gekoppelter Immunbindungs) ELISA gehört im engeren Sinne eigentlich nicht zu den gentechnologischen Verfahrenm, ist aber ein inzwischen verbreitetes Verfahren, um einzelne Proteine nachweisen zu können. Dabei nutzt man die Mechanismen des Immunsystems: Wird eine Substanz vom Immunsystem als fremd erkannt, bildet es "Antikörper", die an das fremde Molekül andocken und es so markieren. Diese so genannte Antikörper-Antigen-Reaktion wird für den ELISA-Test genutzt. Soll ein bestimmtes Protein nachgewiesen werden, müssen die dazu passenden Antikörper bekannt sein und zuvor mit verschiedenen gentechnischen oder zellbiologischen Verfahren hergestellt worden sein. Ist dann in einer Probe das gesuchte Protein vorhanden, fischen es die auf ein Trägermedium aufgebrachten Antikörper heraus. Dabei wird eine von Enzymen gesteuerte Reaktion ausgelöst, die zu einem sichtbaren Farbniederschlag führt. Umgekehrt kann man, z.B. beim AIDS-Test, die Platte auch mit dem Antigen (HIV- Oberflächenmoleküle) beschichten und dann im Serum Antiköper nachweisen. ELISA-Tests sind heute in der medizinischen Diagnostik weit verbreitet. Speziell Doping- Kontrollen verwenden sie. Sie werden aber auch in vielen anderen Bereichen genutzt, wenn einzelne Proteine nachzuweisen sind. Davon zu unterscheiden sind Verfahren, mit denen DNA oder DNA-Sequenzen nachgewiesen werden können. (Quelle: http://www.biosicherheit.de/de/lexikon/33.elisa.html) (Quelle: http://www.doping.chuv.ch/en/lad_home/lad-recherche-developpement/lad-recherche- developpement-projets-actuels/lad-recherche-developpement-projets-actuels-cera.htm)
  • 9. Vervielfältigung von DNA-Sequenzen durch PCR Definition: PCR (Polymerase Chain Reaction) Die Polymerase-Ketten-Reaktion ermöglicht es, Nukleotidsequenzen im Reagenzglas zu verfielfältigen. Dies ist vor allem dann notwendig, wenn zu geringe Mengen für eine ausführliche Untersuchung zur Verfügung stehen. Es werden in ständiger Wiederholung 3 Schritte durchgeführt. •1.Schritt: (Denaturierung) Erhitzen auf 95° C und damit Auftrennung des DNA -Doppelstrangs in zwei Einzelstränge •2.Schritt: (Primerhybridisierung) Abkühlen des Versuchsansatzes auf 50° C und Anlagerung der Primer an den Anfängen beider DNA-Einzelstränge. •3.Schritt: (Elongation) Erwärmung auf 72° C und Einleitung der DNA-Replikation der beiden Einzelstränge durch eine hitzestabile Taq-Polymerase1 (Enzym) Diese drei Schritte werden zigfach wiederholt, bis Milliarden von identischen Kopien der Nukleotidsequenz vorliegen. Anwendungsbereiche: -Untersuchungen an Tatorten -Vaterschaftstest -Erkennung von Krankheiten -Klonierung von Genen -Mutagenese -Analyse alter (fossiler) DNA -Geschlechtsbestimmung -genetischer Fingerabdruck -Nachweis von genetisch veränderten Bestandteilen in Lebensmitteln 1 DNA-Polymerase des hitzeliebenden Bakteriums Tthermophilus aquaticus, das in heißen Quellen vorkommt.
  • 10. Synthese künstlicher DNA(-Sonden) Künstliche DNA: Dabei handelt es sich weder um menschliches noch um tierisches Erbmaterial, sondern um eine synthetische Molekülkette aus den gleichen Bausteinen Die künstliche DNA wird heute durch sogenannte DNA-Syntheseautomaten hergestellt. Diese Maschinen, die durch Mikroprozessoren gesteuert weden, können automatisch und sehr schnell Sequenzen einzelsträngiger DNA synthetisieren. 1. Gewünschte Sequenz wird in den Automaten eingegeben 2. Mikroprozessoren sorgen dafür, dass Nucleotide, Reagenzien und Lösungsmittel für jeden einzelnen Schritt durch die Synthesizersäule gepumpt werden 3. In der Syntesizersäule befindet sich Kieselerde, in Form von feinem Sand; jedes Kügelchen gibt der an ihr entstehenden DNA-Kette einen festen Halt. Beispiel: Sequenz TACG •man geht von einer Säule aus, an deren Kügelchen bereits das erste Nucleotid(hier Thymin) •fixiert ist und zwar mit dem 3´ Ende •durch Mikroprozessoren gesteuert werden Millionen von Molekülen vom nächsten Nucleotid (hier Adenin) durch die Säule gepumpt •um eine Bindung zwischen Thymin und Adenin zu erreichen, muss sich das 5´Ende von Adenin mit dem 3´Ende von Thymin verküpfen •sobald die Schutzgruppe entfernt wird, kann sich das Cytosin anlagern •der Vorgang wird bei Guanin wiederholt ----> Durch diese neue moderne Technik können kurze Ketten bis zu etwa 50 Nucleotiden hergestellt werden. Die fertigen Ketten werden dann aus der Säule gewaschen. Verwendung künstlicher DNA: 1. Oligonucleotide können zu größeren vollständig synthetischen Genen zusammengebaut werden(beispielsweise wie beim Insulin). 2. Sie können als DNA-Sonden benutzt werden. 3. Sie werden als Primer für die Polymerase-Kettenreaktion(PCR) und Sequenzierung benötigt. 4. Die künstlich hergestellte DNA wird in der Kriminologie verwendet, um Verbrecher besser zu identifizieren und gestohlene Gegenstände können leichter ihren Besitzern zugeordnet werden
  • 11. Genetischer Fingerabdruck
  • 12. Gendiagnostik Die Gendiagnostik ist ein jüngerer Zweig der medizinischen Diagnostik. Man versucht dabei, genetisch bedingte Ursachen oder Veranlagungen zu Krankheiten bereits lange vor Ausbruch der eigentlichen Krankheit zu bestimmen. Hierbei wird zwischen diagnostischen Tests (zur Feststellung einer konkreten Erkrankung) und prädiktiven Tests (zur Prognose eines Krankheitsrisikos) unterschieden. Die Gendiagnostik gehört zur genetischen Beratung, die es schon länger gibt. Unter Gendiagnostik i.e.S. sind die unter c) genannten Methoden zu verstehen: Karyogramm eines Menschen a) Familienanamnese Stammbaumanalyse b) Lichtmikroskopische Untersuchung der Chromosomen auf Aneuploidien (Gesamtkaryogramm) oder Chromosomenaberrationen c) biochemische/ molekulargenetische Methoden: RFLP (wenn Mutationen des Gens Restriktionsschnittstellen betreffen verändert sich das Fragmentmuster) Gensonden (In situ Hybridisierung in Gewebe- oder Zellproben) Nachweis mit PCR (Da betroffene Gene i.d.R. Bekannt sind, lassen sich Primer synthetisieren, die jeweils die Enden der Gene markieren. Mittels PCR kann man dann aus einer Speichel- oder Haarwurzelprobe die Sequenz vervielfältigen. Die amplifizierte Sequenz wird dann in einem Sequenzierautomaten analysiert. Das Ergebnis wird dann interpretiert, d.h. mit Sequenzen verglichen, von denen bekannt ist, dass sie z.B. mit einer Neigung zu Dickdarmkrebs oder Multipler Sklerose in Verbindung stehen.) Eingesetzt wird sie vor allem in der PID (Präimplantationsdiagnostik), der Pränataldiagnostik und bei der genetischen Beratung von Eltern mit Kinderwunsch, in deren Familien jedoch bekanntermaßen genetische Krankheiten auftreten. Generell besteht dabei eine Diskrepanz zwischen der Fähigkeit, Gene oder Genvarianten innerhalb des Erbguts zu finden und zu identifizieren und der Fähigkeit zu therapieren. Zudem ist die PID in Deutschland verboten, so dass auch dieser Anwendungsbereich wegfällt.
  • 13. Gentherapie Definition: Unter Gentherapie versteht man die gezielte Einführung von Genen mit Hilfe geeigneter Übertragungsmethoden in Zellen von Kranken mit dem Ziel der Heilung oder therapeutischen Besserung engster Begriff = Genkorrektur ( Reparatur eines defekten Genabschnittes in der Zelle ) oder = Ersatz defekter Gene durch funktionell intakte Kopien ("Genaddition") oder = die Inaktivierung pathogener Genprodukte ("Anti-Gen-Therapie", "Antisense-Therapie") oder = die indirekte Heilung von Krankheiten durch therapeutische Gene. Keimbahntherapie = Veränderungen der menschlichen Keimbahn Somatische Gentherapie = Korrektur von Gendefekten in Körperzellen invivo = Therapie der Zelle im Körper ex vivo = Therapie durch Zellen, die außerhalb des Körpers verändert wurden (z.B. Blutstammzellen) Prinzip der somatischen Gentherapie: Damit die Gentherapie dauerhaften Erfolg hat, nimmt man Knochenmarkzellen, da die sich das ganze Leben lang teilen und das neue Allel an all ihre mitotischen Nachkommen weitergeben. = Problem: kein Genersatz sondern nur Genaddition, mit begrenzter Genexpression möglich Ex vivo: 1. Das gesunde/fehlende Allel in RNA-Form wird in einen Vektor Retrovirus eingebaut 2. Knochenmarkzellen (könnten aber auch Lymphocyten, etc. sein), die wir zuvor de Patienten entnommen haben, werden mit dem Retrovirus infiziert 3. Ziel ist es, dass der Retrovirus eine Kopie seines Genoms, in DNA-Form, in das Genom der Wirtszelle einbaut 4. Daraufhin werden die genetisch-veränderten Zellen dem Patienten wieder ins Knochenmark injiziert 5. Bei erfolgreicher Gentherapie, würden sich die Zellen ein Leben lang vermehren und das neue Gen exprimieren In vivo: VIRALE VEKTOREN Einem zuvor abgeschwächtem Virus, wird das gewünschte Genmaterial eingepflanzt. Sie dienen als Genfähren und werden dem Patienten direkt injiziert. (Transduktion) Vorteil: Hohe Rate von Transduktionsereignissen Nachteile: Immunreaktion, häufig nicht stabil, zu geringe Expressionsrate, Krebsrisiko
  • LIPOSOMEN: DNA wird in kleine Lipidtröpfchen verpackt, die dann auf Schleimhäute (z.B. als Aerosol-Spray) aufgebracht werden. Vorteil: Keine Immunantwort, kein bekanntes Krebsrisiko Nachteil: sehr geringe Transduktionsrate, erreicht nur Schleimhauszellen Risiken von Gentherapie: •Erhöhtes Krebsrisiko •Ungewollte Aktivierung oder Veränderung anderer Gene möglich •Unabsehbare Risiken •Ethische Problematik (Eugenie, Evolution)  Würde des Menschen noch unantastbar ?  Welche späteren Folgen könnte der Verlust von genetischer Variabilität haben? Anwendungsbereiche – monogene Krankheiten (CF, Bluterkrankheit, ADA[Adenosin-Desaminase]-Syndrom, septische Granulomatose) – Krebsbekämpfung – Bekämpfung viraler Infekte Vektorenproblem: – gute Erfolge nur exvivo, invivo zu geringe Transfektionsrate, bzw. zu hohe Risiken bei Versuch der Erreichung einer hohen Rate – in Vivo v.a. Virale Vektoren, künstliche V und physikalische Methoden – Virale Vektoren könne a) eine Immunantwort hervorrufen und b) ist es nicht sicher, wo im Genom sie inserieren. Häufig sind es Stellen, die stark exprimiert werden. – Neu: mit homologer Rekombination oder Zinkfinger-Nukleasen
  • 14. Grüne Gentechnik Ziele: Ertragssteigerung, Verringerung der Produktionskosten durch Resistenz gegen Insekten/ Würmer/ Pilze/ Viren, Veränderung des Stoffwechsels (Zusammensetzung der sekundären Pflanzenstoffe, Produktions bestimmter Moleküle, Erhöhung der Produktion einzelner Stoffe) Werkzeuge: –bei Dikotylen (Zweikeimblättrigen, Gemüseplfanzen, Tabak, Obstbäume): –Plasmide des Agrobakteriums tumefaciens als Vektoren (steuert den Zellzyklus und Zellstoffwechsel der infizierten Zelle um) –Mikroinjektion von DNA –bei Monokotylen (Einkeimblättrige, alle Getreide): –Partikel-Beschuss –spontane Aufnahme von DNA nach Behandlung der Zellwand und – membran mit Enzymen Transgene Zellen können dann über Kalluskulturen wieder zu vollständigen Pflanzen herangezogen werden. Probleme: •Verändertes Verhalten der Pflanzen im Freiland •Freisetzung gentechnisch veränderten Erbguts, die nicht rückgängig gemacht werden kann. •Nachweisder Gesundheitsverträglichkeit schwierig, Kontrollen erfolgen teilweise nach Maßgaben der Konzerne (USA) •Öffentlicher Widerstand