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  • 1. Prácticas de Microbiología 2º Curso (Lic. Biología) Departamento de Microbiología y Genética Universidad de Salamanca
  • 2. Práctica 1 TÉCNICAS DE MICROBIOLOGÍA BÁSICA: AISLAMIENTO Y RESIEMBRA DE MICROORGANISMOS, MANEJO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO y TINCIONES. Introducción 1. Obtención y mantenimiento de cultivos puros El trabajo con microorganismos no se realiza con células aisladas, sino con poblaciones extensas y homogéneas del microorganismo a estudiar. Por lo tanto, el microbiólogo utiliza técnicas que permiten obtener un cultivo puro, y luego cultivar a gran escala dicho microorganismo. Para obtener cultivos puros se han de utilizar instrumentos estériles, es decir, libres de otros microorganismos no deseados (contaminantes). La esterilidad se consigue por diferentes métodos: 1. Calor seco. Para material de vidrio y de metal. Estos objetos (envueltos en papel o aluminio) se someten a una temperatura de 170°C durante al menos 90 minutos. 2. Calor húmedo. Se utiliza para soluciones acuosas y plásticos. Este material se somete a una temperatura de 120°C durante 20 minutos en una atmósfera de vapor de agua a elevada presión, lo cual evita la ebullición. Se realiza en el autoclave. 3. Filtración. Para esterilizar soluciones termolábiles, a las que se hace pasar a través de un filtro con un tamaño de poro que permite el paso de la solución, pero no de los microorganismos. 4. Esterilización química. Se utiliza para esterilizar material (generalmente algunos tipos de plástico) termolábil. Se utilizan sustancias como el óxido de etileno, que se eliminan una vez finalizado el proceso de esterilización. 5. Radiación. La radiación UV o las radiaciones α o γ pueden utilizarse para esterilizar habitaciones o algunos plásticos. Para poder estudiar los microorganismos en el laboratorio el microbiólogo también debe utilizar medios de cultivo que posean los nutrientes necesarios para el crecimiento de los mismos. Si los nutrientes están en forma de solución acuosa hablamos de medios de cultivo líquidos, mientras que si añaden solidificantes, como la gelatina o el agar (2-3%), obtenemos medios de cultivo sólidos. A veces se utilizan medios de cultivo semisólidos, si la concentración de agar es 0,6-1,5%. Los medios de cultivo se esterilizan mediante calor húmedo. Para aislar un microorganismo de una mezcla de varios y obtener un cultivo puro del mismo, la técnica más utilizada es la de siembra por estría en placa Petri, en medio sólido, que permite obtener colonias separadas de individuos que proceden por división de una única 2
  • 3. célula. Estas colonias nos sirven para iniciar un cultivo a gran escala. Otra técnica consiste en obtener una suspensión de la mezcla de microorganismos y hacer diluciones seriadas que se vierten en una placa Petri hasta conseguir colonias aisladas. Una vez que se ha obtenido un cultivo puro, se puede mantener haciendo resiembras en tubos de agar inclinado o bien congelando las células en glicerol (10-30%) a -80°C, en nitrógeno líquido a -173°C, o mediante liofilización. 2. El microscopio El microscopio es el instrumento más necesario para un microbiólogo, ya que permite la observación de organismos que no pueden ser apreciados en detalle a simple vista, es decir de los microorganismos. Existe una gran variedad de microscopios que, según la fuente de iluminación utilizada, se agrupan en: • Microscopios ópticos: La fuente de iluminación es la luz. De campo claro. Permiten la observación de preparaciones, en su color natural o contrastadas mediante tinciones, resaltadas sobre un fondo más brillante. De campo oscuro. Permiten la observación de formas celulares que destacan brillantes sobre un fondo oscuro. Este efecto se consigue utilizando diafragmas especiales. De contraste de fases. Gracias a la utilización de diafragmas y objetivos especiales, que consiguen aumentar las diferencias en el índice de refracción de las células y el medio que las rodea, permiten la observación de células vivas, ya que no es necesario realizar ninguna tinción de las mismas. De interferencia. Permiten observar células vivas sin teñir, obteniéndose una imagen en relieve de las mismas. De fluorescencia. La luz ultravioleta que excita ciertas moléculas presentes en las células (bien de forma natural o añadidas a la preparación) que emiten fluorescencia en el espectro visible. Confocal. Permite obtener imágenes bi y tridimensionales de alta resolución. Es un microscopio computerizado que acopla un láser a un microscopio óptico obteniéndose imágenes fluorescentes. Análisis digital por ordenador. Tiene un diafragma especial llamado pinhole que elimina la señal de las regiones que se encuentran fuera de foco. • Microscopios electrónicos: La fuente de iluminación es un chorro de electrones y las lentes son electroimanes. De transmisión. Permiten la observación de muestras teñidas con sustancias que son resistentes al paso de electrones y cortadas dando lugar a láminas finas, denominadas cortes finos. Los electrones no son visibles directamente por lo que éstos se envían a una pantalla que emite fluorescencia más o menos intensa según el número de electrones que inciden en ella. Las estructuras celulares que se tiñan más intensamente impedirán el paso de electrones y por lo tanto no permitirán la emisión de fluorescencia, por lo que estas 3
  • 4. estructuras aparecerán oscuras en un fondo más brillante. Se consiguen entre 10.000 y 100.000 aumentos. De barrido. Permiten la observación de células enteras, sin necesidad de cortes finos, de modo que aparecen los relieves originales y las superficies externas. Alcanzan entre 1.000 y 10.000 aumentos. Durante las prácticas se empleará el microscopio óptico de campo claro, cuyos componentes fundamentales (mecánicos, de iluminación y ópticos) se muestran en la Figura. Oculares Objetivos Pletina móvil Condensador Diafragma Filtros Tornillos de enfoque Fuente de iluminación Soporte Esquema del microscopio óptico La capacidad de un microscopio para observar diferentes estructuras se refleja en el número de aumentos y en el límite de resolución (LR). • El número de aumentos de un microscopio resulta de multiplicar los aumentos que proporciona cada una de las lentes presentes entre la fuente de iluminación y la lente ocular. • El límite de resolución (LR) se define como la distancia mínima a la que se deben encontrar dos puntos para que puedan observarse separados. El microscopio es mejor cuanto menor sea el LR del mismo. El LR viene definido por la fórmula: LR = λ / 2nsenθ λ: longitud de onda de la fuente de iluminación. 4
  • 5. 2nsenθ: apertura numérica. Está definida por el valor de 2senθ (característica de cada microscopio y no se puede variar) y n, el índice de refracción del medio. Por lo tanto si queremos mejorar la capacidad de observación de un microscopio se debe incrementar el número de aumentos y disminuir el límite de resolución (LR). Para conseguir lo primero, casi todos los microscopios disponen de varias lentes que se pueden cambiar según el tamaño de la muestra a observar. Para disminuir el LR podemos utilizar una fuente con menor longitud de onda (el caso extremo es el de los microscopios electrónicos) o bien aumentar n, para lo que podemos intercalar entre la preparación y el objetivo un medio más denso que el aire. Normalmente se utiliza aceite de inmersión. Es importante recordar que no todos los objetivos son impermeables al aceite. En los microscopios que se utilizarán en las prácticas, ¡¡sólo puede utilizarse el aceite de inmersión con el objetivo de 100 ×!!. 2. Observación microscópica Para observar una muestra al microscopio óptico podemos recurrirá a: Preparación húmeda. Se realiza colocando una gota de la suspensión de microorganismos entre un porta y un cubreobjetos. Se observa directamente. Preparación fijada. Se coloca una suspensión homogénea de microorganismos en una gota de agua sobre el portaobjetos y se fija (mediante calor o agentes químicos). Después se tiñen mediante diferentes técnicas. Estas preparaciones se observan sin cubreobjetos y, habitualmente, con objetivos de inmersión. 3. Tinciones Son técnicas que permiten observar microorganismos en función de la capacidad de los mismos para retener o no determinadas sustancias colorantes, lo que depende de la carga de la célula y del colorante. Los colorantes pueden ser de distintos tipos: Catiónicos. Son sustancias que tienen carga positiva. Penetran en el interior de las células y las tiñen. Ejemplos: azul de metileno, cristal violeta, safranina. Aniónicos. Con carga negativa. No penetran en el interior celular, de modo que no tiñen las células, sino el entorno. En este caso se habla de tinción negativa. Ejemplos: eosina, nigrosina. Liposolubles. Se mezclan con los lípidos celulares y los tiñen. Ejemplo: negro sudán. Las tinciones pueden ser: Simples. Utilizan un solo colorante. Se basan en el hecho de que las células tienen una composición química diferente a la de su entorno, de modo que ambos se comportan de forma diferente frente a un colorante. El colorante tiñe las células (azul de metileno, safranina) o no (nigrosina). Diferenciales. Se basan en el hecho de que distintos tipos de células tienen distinta composición química, y por lo tanto reaccionan de forma diferente frente a una tinción, lo 5
  • 6. que permite clasificar los microorganismos en diferentes grupos, según su capacidad de tinción. En este apartado están dos tinciones de importancia taxonómica y médica: la tinción de Gram y la de ácido-alcohol resistencia (de Ziehl-Neelsen). Estas tinciones utilizan más de un colorante. Selectivas. Se basan en el hecho de que distintas estructuras celulares tienen distinta composición química, de modo que se tiñen selectivamente con ciertos colorantes. Ej; tinción de esporas, de flagelos, de paredes celulares, de corpúsculos metacromáticos. Pueden utilizarse uno o más colorantes. Objetivos 1. Obtención de cultivos puros de microorganismos mediante estría en medio sólido y mantenimiento de los mismos en tubos de agar inclinado. 2. Manejo del microscopio óptico de campo claro. 3. Realización de preparaciones húmedas de suspensiones de microorganismos y tinciones que nos permitirán observar la forma y tamaño de distintos microorganismos, así como algunas estructuras especiales (esporas en Bacillus y corpúsculos metacromáticos en Lactobacillus). También realizaremos tinciones diferenciales que nos permitirán clasificar microorganismos en distintos grupos (tinción de Gram y de ácido- alcohol resistencia). Materiales Asa de siembra, placas de medio sólido y tubos de agar inclinado (Agar Nutritivo). Mechero de alcohol. Microscopio óptico. Portaobjetos, cubreobjetos y colorantes. Suspensión de una mezcla de microorganismos. Resiembras de microorganismos: Bacillus megaterium, Escherichia coli, Micrococcus luteus, Serratia marcescens. Yogurt preincubado a 37°C. Agar Nutritivo (AN) Extracto de levadura 2 g/l Extracto de carne 1 g/l Peptona 5 g/l ClNa 5 g/l Agar 20 g/l pH 7,4 Procedimiento 1. AISLAMIENTO A partir de una suspensión de microorganismos se realizarán estrías sucesivas en placas de medio sólido. Las placas se incuban luego a 28ºC durante 24 horas. 6
  • 7. 2. RESIEMBRA Mediante el asa de siembra se transfieren microorganismos desde unos tubos de agar inclinados con la muestra a otros estériles. Luego se incuban a 28ºC durante 24 horas. 3. TINCIONES • Simples a) Azul de metileno (Tinción positiva). Permite teñir el interior celular. Tiñe microorganismos procarióticos (vivos o muertos). Los eucarióticos sólo se tiñen si están muertos. Algunas estructuras, como los corpúsculos metacromáticos, se tiñen más intensamente con este colorante que el resto de la célula. Procedimiento 1. Extensión: poner una gota de agua en el portaobjetos y extender en ella la muestra (Escherichia y Bacillus ) utilizando el asa de siembra. 2. Fijación: pasar el portaobjetos varias veces por encima de la llama del mechero de alcohol, sin permitir que llegue a hervir, hasta que se seque. 3. Añadir Azul de metileno y esperar 2 minutos. 4. Lavar con agua 5. Secar. 6. Observar primero con el objetivo 40×; luego se añade aceite de inmersión y se observa con el objetivo 100×. b) Nigrosina (Tinción negativa). Se trata de un colorante aniónico, que no penetra en el interior celular. Proporciona una visión de la forma y el tamaño celulares al observarse los microorganismos brillantes sobre un fondo oscuro. Procedimiento 1. Colocar una gota de Nigrosina sobre uno de los extremos del portaobjetos. 2. Extender la muestra (Escherichia y Bacillus) en la gota con el asa de siembra. 3. Realizar un frotis: con un segundo portaobjetos se extiende la muestra de modo que cubra toda la superficie del primero. 4. Secar al aire. 5. Observar (primero 40× y luego 100× con aceite de inmersión). • Selectivas a) Tinción de corpúsculos metacromáticos en células de Lactobacillus. 7
  • 8. Procedimiento 1. Tomar una muestra de un yogurt con el asa de siembra y colocar en un portaobjetos. 2. Teñir con azul de metileno como se ha descrito anteriormente. En esta preparación se observan dos microorganismos: Lactobacillus (con los corpúsculos metacromáticos en su interior) y Streptococcus (forman cadenas). b) Tinción de endosporas. Las bacterias de los géneros Bacillus y Clostridium se caracterizan porque forman endosporas. Las endosporas son formas de resistencia que garantizan la supervivencia de la especie en situaciones adversas (agotamiento de nutrientes, cambios de temperatura, acumulación de metabolitos tóxicos...). Estas estructuras, que contienen una copia completa del genoma, se desarrollan en el interior de la célula bacteriana y cuando la célula muere y se lisa la endospora queda libre. Las endosporas germinarán cuando las condiciones ambientales vuelvan a ser favorables. Algunas enfermedades muy conocidas son producidas por especies de los géneros Clostridium [ej. C. tetani (tétanos), C. perfringens (gangrena gaseosa) y C. botulinum (botulismo)] y Bacillus [ej. B. anthracis (antrax)]. Procedimiento 1. Extensión (B. megaterium). 2. Fijación. 3. Colocar un papel de filtro sobre la muestra y sujetarlo con una pinza. Empapar el papel con Verde malaquita y pasarlo por encima de la llama del mechero para que haya emisión de vapores. Cuando dejen de salir vapores volver a pasar la muestra por encima de la llama, volviendo a empapar el papel con colorante si es necesario. Repetir hasta 5 minutos. 4. Retirar el papel y lavar con agua. 5. Safranina 1 minuto. 6. Lavar con agua. 7. Secar. 8. Observar (100×). • Diferenciales a) Tinción de Gram. De gran importancia en Microbiología porque permite diferenciar dos grandes grupos de bacterias (Gram+ y Gram-), según se comporten ante esta tinción. El fundamento radica en la diferente estructura de la pared celular de ambos grupos: las bacterias Gram+ tienen una gruesa capa de peptidoglicano en su pared, mientras que las bacterias Gram- tienen una capa de peptidoglicano más fina y una capa lipopolisacarídica externa. Tras la tinción con el primer colorante (Cristal violeta) se efectúa un lavado con etanol que arrastrará al colorante sólo en las Gram (-), mientras que en las Gram (+) el colorante queda retenido y las células permanecerán azules. Las células Gram (-) se teñirán después con un colorante de contraste (safranina) para que puedan observarse. 8
  • 9. Procedimiento 1. Extensión de la muestra (Escherichia y Bacillus). 2. Fijación. 3. Cristal violeta 1-2 minutos. 4. Tirar el exceso de colorante (¡NO lavar con agua!). 5. Añadir lugol, esperar 1 minuto y tirar el exceso (¡No lavar con agua!) 6. Decolorar con etanol-acetona (20 segundos) 7. Lavar con agua. 8. Añadir Safranina (colorante de contraste), esperar 1 minuto. 9. Lavar con agua. 10. Secar. 11. Observar (100×). Gram(+) Gram(-) Peptidoglicano Peptidoglicano Membrana Plasmática Membrana Plasmática Espacio periplásmico Lipopolisacárido y Proteína Gram (-) Exterior Polisacárido O Lipopolisacárido Membrana Núcleo Polisacarídico (LPS) externa Lípido A Gram(-) Proteína Porina 8 nm Fosfolípido Lipoproteína Espacio Periplásmico Peptidoglicano Membrana Plasmática Interior 9
  • 10. Proteína asociada Gram (+) Acidos Teicoicos a la pared Acidos Lipoteicoicos Peptidoglicano Membrana Plasmática b) Tinción de ácido-alcohol resistencia (Ziehl-Neelsen). Se basa en que ciertos microorganismos no son desteñidos con alcohol ácido si han sido previamente teñidos con fucsina fenicada. A estos microorganismos se denominan ácido-alcohol resistentes. Una vez realizada la decoloración con esta mezcla se utiliza un colorante de contraste (azul de metileno) para poder observar las células sensibles a la decoloración con alcohol ácido. Son microorganismos ácido-alcohol resistentes las micobacterias, debido a la composición de su pared celular (tiene ácidos micólicos). Esta tinción tiene interés desde el punto de vista del diagnóstico clínico puesto que algunos microorganismos patógenos son ácido-alcohol resistentes, tales como Mycobacterimum tuberculosis (tuberculosis) o M. leprae (lepra). Procedimiento 1. Extensión (Mycobacterium phlei y Micrococcus luteus). 2. Fijación. 3. Colocar un papel de filtro sobre la muestra y sujetarlo con una pinza. Empapar el papel con Fucsina fenicada y pasarlo por encima de la llama del mechero para que haya emisión de vapores. Cuando dejen de salir vapores volver a pasar la muestra por encima de la llama, volviendo a empapar el papel con colorante si es necesario. Repetir hasta 5 minutos. 4. Quitar el papel de filtro y lavar abundantemente con agua. 5. Añadir ácido-alcohol y esperar 30 segundos. 6. Lavar con agua 7. Añadir azul de metileno (colorante de contraste) y esperar 1-2 minutos. 8. Lavar con agua. 9. Secar. 10. Observar (100×). 10
  • 11. Práctica 2 DETERMINACIÓN DEL CRECIMIENTO DE UN MICROORGANISMO Introducción El crecimiento microbiano se define como un incremento en el nº de células, es decir, se refiere al crecimiento de poblaciones. Este viene dado como consecuencia del crecimiento de cada célula individual y su división celular. El crecimiento de un microorganismo depende de varios factores como: 1. El microorganismo en sí. Así por ejemplo, en condiciones óptimas E.coli tiene un ciclo de vida de 15-20 minutos, mientras que Mycobacterium tuberculosis lo tiene de 18 horas. 2. La composición del medio de cultivo. Las células crecerán más lentamente en un medio mínimo (MM) que en un medio rico (MR) con todos los nutrientes. Dependiendo de la fuente de carbono y de la facilidad con que la asimilen crecerán más o menos rápidamente (por ejemplo, crecen mejor con glucosa (Glc) como fuente de carbono que con galactosa (Gal). 3. Las condiciones de incubación. La temperatura de incubación, la concentración de CO2 en la atmósfera de cultivo, la agitación, etc... son factores importantes. 4. La procedencia y características del inóculo. La curva de crecimiento variará dependiendo de que se parta de un cultivo estacionario o de uno en crecimiento exponencial, que se pase un cultivo crecido en MM+Glc a MM+Gal o de MR a MM+Glc. Existen varios métodos para medir el crecimiento microbiano: Métodos directos: son aquellos en los que se cuenta el nº total de células en un volumen conocido y así se estima el nº total en la población. Entre ellos: Recuento directo del nº de células al microscopio. Se utilizan portas especialmente diseñados para el recuento celular y denominados cámaras de recuento. Existen varios tipos de cámaras de recuento, una de ellas es la cámara Thoma que es la que nosotros utilizaremos. Este método tiene el inconveniente de que no diferencia entre células viables y no viables. Es poco preciso. Contadores electrónicos. Las células son suspendidas en un fluido conductor que pasa lentamente a través de una abertura fina por la que pasa una corriente eléctrica. Cada célula que pasa produce un cambio en la conductividad y estos cambios o pulsos convenientemente amplificados son registrados electrónicamente dando una medida directa del nº de células en el medio. No diferencia entre células viables y no viables ni entre células o partículas inertes. 11
  • 12. Recuento de células viables. Haciendo diluciones apropiadas seguidas de siembra sobre placas Petri podemos obtener crecimiento de colonias aisladas procedentes cada una de una única célula. Si se multiplica por el factor de dilución tendremos el nº de células en cultivo. Sólo detecta viables pero es un método lento y caro por el elevado número de placas que hay que utilizar para que los resultados sean significativos. Métodos indirectos: son aquellos que utilizan parámetros distintos del nº de células, pero que pueden relacionarse de forma directa con éste (masa celular, actividad metabólica, etc..). Ello es posible porque durante el crecimiento de un cultivo hay un aumento ordenado de todos los constituyentes celulares y así la velocidad de crecimiento de la población puede estimarse por la velocidad del incremento de cualquiera de estos parámetros. Entre los métodos indirectos se encuentran: Determinación del peso seco. Se trata de medir la masa celular presente en un cultivo y estimar el nº de células proporcional a ésta. Determinación del nitrógeno celular. Medir el contenido proteíco del cultivo. Determinación del DNA Determinación de una actividad metabólica según el tipo de microorganismo: consumo de oxígeno (en aerobios), liberación de CO2 u otro producto de fermentación, aumento de la concentración de alguna enzima constitutiva, incorporación en la célula de algún material radiactivo, etc. Medida de la turbidez del cultivo. Se basa en la capacidad de las células y partículas en general de absorber y/o dispersar la luz que incide sobre ellas. Un cultivo celular aparece turbio porque las células dispersan la luz que atraviesa la suspensión. La turbidez es proporcional al número de células y puede medirse utilizando un espectrofotómetro. El espectrofotómetro es un aparato que hace pasar la luz a través de una suspensión celular y detecta la luz no dispersada. 12
  • 13. Este instrumento mide la relación de intensidad entre la luz incidente y la emergente después de atravesar la muestra. Cuanto mayor sea el nº de células mayor es la turbidez del cultivo o densidad óptica (DO) y menor la cantidad de luz no dispersada que emerge tras atravesar la muestra. Por tanto, la DO de un cultivo es proporcional a la densidad celular. Sin embargo, esto es así dentro de ciertos límites, puesto que a elevadas concentraciones pueden formarse agregados celulares y producirse un efecto “pantalla” de unas células sobre otras (en el caso de S. cerevisiae la relación entre la DO y la concentración de células es lineal hasta un valor de DO de aproximadamente 0,3). Por tanto, en algunos casos será necesario diluir la muestra antes de realizar la medida (ej. para hacer una dilución 1/10 se mezclaría 1 ml de cultivo con 9 ml de medio de cultivo o agua). Cuando la dilución sea alta (mayor de 1/10) conviene hacer diluciones seriadas para reducir el error (ej. para una dilución 1/50 primero se hace una dilución 1/10 y despues se hace una dilución 1/5 de la dilución 1/10). Cálculo del tiempo de generación El tiempo requerido para que una célula microbiana se divida dando lugar a dos células se denomina tiempo de generación (g). Por tanto, g es el tiempo que necesita una población para duplicar el nº de células. Si consideramos que entre un tiempo inicial (To) y otro final (Tf) han transcurrido n generaciones, el valor de g se expresará como: g = (Tf - To)/n (A) Si inicialmente tenemos en el cultivo N0 células, después de la primera división el número de células será N0 × 21; después de la segunda división N0 × 22; después de la tercera división N0 × 23…….; después de n divisiones, el número final de células (Nf) será N0 × 2n. Por tanto, se trata de una progresión geométrica cuya sucesión se puede expresar como: Nf = No × 2n (B) Despejando el valor de n se aplican logaritmos: Log Nf = log(No × 2n) log Nf = log No + n log 2 n = (log Nf – log No)/log 2 Conocido el valor de n, lo sustituimos en la ecuación (A) y obtenemos el valor de g: g = 0,3 (Tf - To)/ (log Nf – log No) El crecimiento de una población en el que el número de células se dobla cada un tiempo g se conoce como crecimiento exponencial y está representado por la ecuación (B). Logarítmica Nº de Células (escala aritmética) Nº de Células (escala logarítmica) Aritmética Tiempo (horas) 13
  • 14. Sin embargo, cuando seguimos el crecimiento de una población microbiana, midiendo por ejemplo su DO en función del tiempo, obtenemos su curva de crecimiento, que nos viene dada por una gráfica del tipo: Fases de Crecimiento Latencia Exponencial Estacionaria Muerte Turbidez Viables (D.O.) Tiempo El incremento en el número de células es lento al principio y después llega a ser de forma exponencial. Esta gráfica es característica de un cultivo en un recipiente cerrado en el que los nutrientes son limitados. En la curva se distinguen cuatro fases: Fase de latencia. Fase de adaptación de las células a las nuevas condiciones del medio de incubación al que han sido transferidas. Las células no crecen inmediatamente sino después de este tiempo de latencia. Las células son metabólicamente activas, se adaptan al medio y eventualmente lo modifican. Para un mismo inóculo, esta fase de latencia varia dependiendo del medio al que se transfieren y de las condiciones de incubación. Fase de crecimiento exponencial. Fase en la que las células se están dividiendo regularmente a ritmo constante. En condiciones apropiadas durante esta fase, el grado de desarrollo es máximo. Es en este periodo donde puede calcularse el tiempo de generación de un microorganismo. Fase estacionaria. El nº de células no se incrementa más porque los nutrientes del medio se van agotando y posibles sustancias tóxicas pueden ir acumulándose. No hay incremento neto del nº de células, el nº de células que se originan es igual al nº de las que mueren. Fase de muerte celular. Las células mueren a una velocidad mayor a la que se originan debido al agotamiento total de los nutrientes y/o excesiva acumulación de sustancias tóxicas. A veces la muerte va acompañada de lisis celular y ésto disminuye la absorbancia del cultivo. Objetivos 1. Medir el crecimiento de una población microbiana (S.cerevisiae) utilizando dos métodos distintos: Medir de la turbidez del cultivo (método indirecto) y recuento del nº de células al microscopio (método directo) 2. Determinar el tiempo de generación de la población (S.cerevisiae). 14
  • 15. Materiales Inóculo de Saccharomyces cerevisiae 1 ml (DO: 1,25). Matraz con 25 ml de medio YED (extracto de levadura y glucosa). Pipetas estériles, cámara de recuento (Cámara Thoma), microscopio óptico, espectrofotómetro. Mecheros de alcohol, incubadores a 28 ºC. Procedimiento 1. Para la determinación de la curva de crecimiento: Inocularemos el matraz que contiene el medio de cultivo con un preinóculo. Mediremos la D.O. a 600 nm y comprobaremos que esta D.O. inicial (to) es aproximadamente de 0.05. Seguiremos la evolución de la turbidez del cultivo midiendo la D.O. a diferentes tiempos durante unas 24 horas. Tomaremos muestras cada dos horas. Y en algunos de estos puntos tendremos que hacer diluciones para medir la D.O. Representaremos en una gráfica los valores de D.O. obtenidos a lo largo del tiempo. La curva obtenida será la curva de crecimiento del cultivo. 2. Al mismo tiempo haremos una recta patrón usando la cámara de recuento y suspensiones celulares de D.O. conocida. Utilizando esta curva patrón, calcularemos por extrapolación el nº de células que corresponden a los valores de D.O. obtenidos en nuestras lecturas al espectrofotómetro y haremos una gráfica del nº de células en función del tiempo. Recuento directo del número de células al microscopio. La cámara de recuento consiste en un porta modificado con una hendidura de 0,1 mm de profundidad. Está dividida en 16 cuadrados y éstos a su vez divididos en 16 ó 25 celdillas. Cada celdilla tiene una superficie de 0,0025 mm2 y una profundidad de 0,1 mm. Por tanto el volumen de cada celdilla (Vc) es de 0,00025 mm3. Como hay 16 celdillas por cuadrado, el volumen total de una celda (VT) es de Vc × 16 = 0,004 mm3. Como 1 mm3 = 10-3 ml. V = 4 × 10-6 ml (volumen de una celda) Se cuentan 6 celdas al azar, se calcula la media (X) de células por celda y se expresa la concentración en células por ml: X cel / 4 × 10-6 ml = X × 25 × 104 células/ml Los valores de células/ml se representan gráficamente frente a su DO correspondiente para obtener la curva patrón. 3. Por último, haremos un cálculo de g de nuestro cultivo, S. cerevisiae, utilizando dos valores consecutivos comprendidos dentro de la fase exponencial de crecimiento. 15
  • 16. Práctica 3 ANTIBIÓTICOS Introducción Los antibióticos son compuestos orgánicos de bajo peso molecular sintetizados por microorganismos, que a bajas concentraciones inhiben el desarrollo o matan a otros microorganismos. Se caracterizan por: -Inhiben el crecimiento (bacteriostáticos) o matan (bactericidas). -Son efectivos a bajas concentraciones. -Poseen toxicidad selectiva: actúan sobre el patógeno sin afectar al organismo hospedador. -Pueden actuar frente a procariotas o eucariotas. -Pueden ser de acción muy específica o de amplio espectro. -Solubles en agua. -Poseen estabilidad química. -Son productos del metabolismo secundario. Es importante tener en cuenta la posibilidad de aparición de resistencia a determinados antibióticos en algunos microorganismos durante el tratamiento de una infección. Los microorganismos productores se encuentran tanto dentro del grupo de procariotas (Bacillus, Streptomyces, Nocardia) como en el de eucariotas (Penicillium, Aspergillus, Cephalosporium) Se pueden clasificar según: Su origen •Naturales: sintetizados por microorganismos. •Sintéticos: obtenidos completamente por síntesis química. •Semisintéticos: parte de compuesto sintetizada por microorganismos y otra parte sintetizada químicamente. Su estructura química •ß-lactámicos: penicilinas, cefalosporinas. •Macrólidos: eritromicina. •Aminoglucósidos: estreptomicina. •Polipeptídicos: bacitracina. •Poliénicos: anfotericina B •Tetraciclinas •Derivados del benceno: cloranfenicol. Su mecanismo de acción •Actúan sobre la pared celular bacteriana inhibiendo su síntesis: penicilinas. •Actúan sobre la membrana celular alterando su permeabilidad. •Inhiben la síntesis proteica. •Inhiben la síntesis de ácidos nucleicos: mitomicina. 16
  • 17. Objetivos 1. Detectar la producción de antibiótico por microorganismos 2. Valorar la cantidad de antibiótico presente en una solución 3. Determinar qué antibiótico entre varios es más efectivo frente a un organismo (“antibiograma”). Materiales Tubos con 20 ml de AN y YED fundido, baño a 50ºC, placas Petri, mecheros, pipetas pasteur, pipetas estériles, regla, papel semilogarítmico de 3 periodos, antibióticos: penicilina G 25, 50, 100 µg/ml y concentración desconocida; bacitracina: 10 mg/ml; cicloheximida: 2 mg/ml; microorganismos: Streptomyces, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis. Procedimiento 1. PRUEBA DE PRODUCCIÓN DE ANTIBIÓTICOS Mediante un bioensayo en medio sólido podemos determinar si un microorganismo produce algún antibiótico capaz de inhibir el crecimiento de un organismo de prueba. Para ello se emplearán dos posibles microorganismos productores del género Streptomyces y un microorganismo sensible (Saccharomyces cerevisiae). Procedimiento 1. Tomar un tubo con medio YED fundido mantenido a 45-50ºC en un baño a dicha temperatura. 2. Añadir 1 ml de la suspensión de células de S.cerevisiae (organismo sensible). 3. Tapar el tubo con Parafilm, invertir varias veces y verter en una placa Petri vacía. 4. Cuando el medio esté sólido (después de unos 20’) colocar encima 2 tacos de agar, cada uno con uno de los microorganismos a ensayar. 5. Poner la placa a 4ºC durante 2 horas para permitir la difusión del antibiótico. 6. Incubar la placa a 28ºC durante unas 24 horas para permitir el crecimiento del microorganismo sensible. Resultado: Observar la existencia o no de halos de inhibición del crecimiento de Saccharomyces cerevisiae. 2. VALORACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE ANTIBIÓTICO La concentración de un antibiótico en una solución se puede determinar por comparación con el efecto de cantidades conocidas del mismo antibiótico sobre un microorganismo sensible, Bacillus subtilis. Esta técnica se emplea en los procesos de mejora de la producción de un 17
  • 18. determinado antibiótico por la especie productora. El proceso se lleva a cabo mediante bioensayo en placa sobre un microorganismo sensible. Se valorará la concentración de Penicilina G en una solución frente a una recta patrón generada con cantidades conocidas del mismo antibiótico. Procedimiento 1. Tomar un tubo con medio AN fundido. 2. Añadir 1 ml de la suspensión de células de B. subtilis (organismo sensible). 3. Tapar el tubo con Parafilm, invertir varias veces y verter en una placa Petri vacía. 4. Cuando el medio esté sólido (después de unos 15 minutos) colocar con ayuda de pinzas cuatro discos de papel saturados con la correspondiente solución de antibiótico. 5. Poner la placa a 4ºC durante 2 horas para permitir la difusión del antibiótico. 6. Incubar la placa a 28ºC durante unas 24 horas para permitir el crecimiento del microorganismo sensible. Resultado: Observar el tamaño de los halos de inhibición del crecimiento, medir los diámetros con una regla, hacer la representación gráfica sobre papel semilogarítmico de 3 periodos y deducir la concentración de antibiótico desconocida. 3. “ANTIBIOGRAMA” El antibiograma se utiliza para comprobar cuál de una serie de antibióticos es más activo frente a un determinado microorganismo, Bacillus subtilis en este caso. Se compararán tres antibióticos, Penicilina G (0,1 mg/ml), Bacitracina (10 mg/ml) y Cicloheximida (2 mg/ml). Procedimiento 1. Tomar un tubo con medio AN fundido. 2. Añadir 1 ml de la suspensión de células de B. subtilis (organismo sensible). 3. Tapar el tubo con Parafilm, invertir varias veces y verter en una placa Petri vacía. 4. Cuando el medio esté sólido (después de unos 20 minutos) colocar con ayuda de pinzas tres discos de papel saturados con la correspondiente solución de los diferentes antibióticos: Penicilina G (0,1 mg/ml), Bacitracina (10 mg/ml) y Cicloheximida (2 mg/ml). 5. Poner la placa a 4ºC durante 2 horas para permitir la difusión del antibiótico. 6. Incubar la placa a 28ºC durante unas 24 horas para permitir el crecimiento del microorganismo sensible. Resultado: Observar la aparición o no de halos de inhibición del crecimiento y su tamaño. Indicar qué antibiótico es el más efectivo frente a B. subtilis. 18
  • 19. Práctica 4 ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DEL AGUA Introducción En el agua pueden encontrarse una gran variedad de microorganismos, los cuales afectan en mayor o menor medida a la potabilidad del agua y a sus características organolépticas. Además de la flora normal (Bacillus, Pseudomonas, etc.), en el agua pueden existir microorganismos contaminantes. Una de las fuentes principales de contaminación son las aguas residuales, las cuales suelen contener restos de heces que pueden portar microorganismos patógenos. Aparte del problema de transmisión de enfermedades, la contaminación del agua también acarrea otras consecuencias. Por ejemplo, la degradación biológica por los microorganismos de grandes cantidades de residuos orgánicos vertidos al agua hace disminuir rápidamente el oxígeno existente, creando un ambiente desprovisto de toda forma de vida que no sea anaeróbica: mueren los peces, disminuye la vida vegetal y se produce el hedor característico debido a las actividades de los microorganismos anaerobios. Objetivo 1. Determinar si el agua está contaminada por heces humanas o de otros animales. La calidad del agua se determina principalmente por análisis bacteriológicos. Las pruebas que se realizan son: Recuento de aerobios totales Colimetría Estreptometría Clostridiometría Estos ensayos siguen en líneas generales la normativa publicada en el BOE de 20-IX-1990. No obstante, a partir de marzo de 2003 los criterios de calidad del agua de consumo humano se determinan de acuerdo a la normativa publicada en el BOE de 21 de febrero de 2003. Materiales Muestra de agua (aprox. 100 ml). Medios de cultivo: Placas de agar nutritivo (AN) (4), tubos de medio Caldo Lactobiliado (3 EC concentrado y 6 EC simple), tubos de medio Caldo Azida de Rothe (3 AR concentrado, 6 AR simple), medio Wilson Blair (1 tubo de agar WB fundido), placa de medio Eosina Azul de Metileno (EMB). Tubos con 1 ml de agua estéril para 19
  • 20. diluciones. 1 tubo de vidrio estéril. Pipetas estériles (de 1 y 10 ml). Parafilm™. Baño a 80°C. Baño a 60°C. Estufa incubadora a 37°C. Tabla estadística de “Número Más Probable” (NMP). Asa de vidrio, mechero de alcohol y alcohol de quemar. 1. Bacterias aerobias totales Las bacterias que vamos a identificar en este ensayo son bacterias heterótrofas, aerobias y anaerobias facultativas, mesófilas, capaces de crecer en un medio rico (AN). El ensayo se basa en contar el nº de colonias capaces de crecer en una placa de medio rico, en la que se ha sembrado un volumen de agua conocido, transcurrido un determinado tiempo de incubación a 37 °C. Este ensayo sólo nos indica la cantidad de microorganismos de este tipo que hay en la muestra de agua, pero NO IDENTIFICA microorganismos concretos. Al incubar a 37°C se seleccionan bacterias de origen fecal (adaptadas a vivir en el interior del cuerpo de los animales). Si se hiciera el mismo ensayo a 22 °C nos daría una idea de la flora autóctona. Procedimiento 1. Preparar diluciones seriadas de la muestra original: 1/2, 1/4 y 1/8. 1. Sembrar 0,2 ml de la muestra original y de cada una de las diluciones (1/2, 1/4 y 1/8) en cuatro placas de AN. 2. Incubar las placas a 37 °C durante 24 horas. Resultados: Contar el número de colonias existentes en cada placa, seleccionar la placa que contenga entre 30 y 300 colonias para la realización de los cálculos. El resultado se expresa como microorganismos por ml de agua. ¡Hay que tener en cuenta las diluciones!. 2. Bacterias coliformes (Colimetría) Son bacterias de morfología bacilar, Gram (-), aerobias o anaerobias facultativas, oxidasa negativas, no esporógenas y capaces de fermentar la lactosa con producción de ácido y gas a 37°C en un tiempo máximo de 48 horas. Las bacterias coliformes de origen fecal se incluyen dentro de las bacterias entéricas o "enterobacterias" y se caracterizan por habitar el tracto gastrointestinal del hombre y otros animales. Este grupo incluye los géneros: Escherichia, Citrobacter, Klebsiella y Enterobacter. Las heces pueden ser vehículos de transmisión de otras bacterias no coliformes que son patógenas como Salmonella, Proteus y Shigella, algunas de cuyas especies causan infecciones intestinales como la fiebre tifoidea y la disentería bacilar. Ya que los microorganismos patógenos son muy sensibles y se encuentran en bajas concentraciones se toma como indicador de contaminación fecal la presencia en las aguas de los géneros arriba indicados y principalmente de Escherichia coli. Se realizan dos pruebas, presuntiva y confirmativa; el ensayo se considera positivo si dan positivas ambas pruebas. 20
  • 21. Prueba presuntiva: El agua problema se siembra en el medio denominado caldo lactobiliado (EC), que permite el enriquecimiento e identificación de bacterias coliformes. La lactosa existente es fermentada produciendo ácido y gas que se detecta en la campana de Durham. La bilis inhibe el crecimiento de cocos Gram (+) y bacilos formadores de endosporas y no inhibe a los bacilos entéricos Gram (-) ni otros ambientales (ej. Pseudomonas). Es un medio de enriquecimiento y selectivo. Procedimiento 1. Sembrar 10 ml de la muestra en 3 tubos con 10 ml de caldo lactobiliado concentrado (ECC) con campana de Durham. Agitar suavemente hasta mezclarlo bien. 2. Sembrar 1 ml de la muestra en 3 tubos con 10 ml de caldo lactobiliado simple (EC) con campana de Durham. Agitar suavemente hasta mezclarlo bien. 3. Sembrar 0,1 ml de la muestra en 3 tubos con 10 ml de caldo lactobiliado simple (EC) con campana de Durham. Agitar suavemente hasta mezclarlo bien. 4. Incubar a 37°C durante 24 horas. Resultados: se consideran "tubos gas +" aquellos en los que aparece enturbiamiento y acumulación de gas en la campana. Los "tubos gas -" se incuban otras 24 h. La interpretación se realiza según la tabla de “número más probable” (NMP) adjunta. Esta tabla indica el número más probable de microorganismos presentes en 100 ml de agua (NMP), teniendo en cuenta los tubos en que hay crecimiento así como las diluciones y aplicando métodos estadísticos. Prueba confirmativa: 1. Siembra en estría en placas de EMB (medio selectivo y diferencial para coliformes) a partir de "tubos gas+". 2. Incubar a 37°C durante 24 h. Resultados: En este medio los microorganismos fermentadores de lactosa forman colonias características opacas y pigmentadas en rosa, azul o violeta con o sin brillo metálico (por ejemplo, E. coli forma colonias de color verde-violeta oscuro metálico características sobre este medio). La prueba es + si aparecen este tipo de colonias fermentadoras de lactosa. Otra prueba confirmativa de la presencia de E. coli es sembrar los microorganismos que han crecido en caldo lactobiliado a 37°C en este mismo medio pero incubando a 44°C. E. coli es capaz de fermentar la lactosa en estas condiciones. 21
  • 22. 3. Estreptococos fecales (Estreptometría) Son cocos Gram (+), anaerobios aerotolerantes, catalasa negativos y fermentadores de glucosa con producción de ácido láctico a 37°C en un tiempo máximo de 48 h. Este grupo comprende especies como Streptococcus faecalis, S. faecium, S. bovis y S. equinus. Los estreptococos fecales son residentes normales del intestino del hombre y animales y reciben la denominación general de enterococos. El ensayo incluye prueba presuntiva y confirmativa y se considera positivo si ambas pruebas son positivas. Prueba presuntiva El ensayo se basa en saber si existen microorganismos capaces de crecer a 37 °C en un medio líquido glucosado con agentes inhibidores selectivos. El medio utilizado, denominado caldo azida de Rothe (AR) es un medio selectivo que contiene azida que inhibe la cadena de transporte de electrones del metabolismo respiratorio de los microorganismos. Los estreptococos y otros microorganismos poseen un metabolismo fermentativo y carecen de cadena de transporte de electrones por lo que no se ven afectados por la azida. Procedimiento 1. Sembrar de la misma forma que en bacterias coliformes en medio selectivo para estreptococos, caldo azida de Rothe (3 tubos ARC, 6 tubos AR). Agitar 2. Incubar a 37°C durante 24 h. Resultados: Se consideran "tubos +" aquellos en que existe enturbiamiento y/o sedimento. Interpretación según la tabla NMP (microorganismos/100 ml de agua). Prueba confirmativa Se trata de realizar una tinción de Gram del sedimento de los tubos con objeto de reconocer al microscopio los estreptococos, que se observarán como cadenas de cocos Gram (+). 4. Clostridios sulfito-reductores (Clostridiometría) Son bacterias de morfología bacilar, Gram(+), anaerobios estrictos, capaces de formar esporas y con actividad sulfito reductora (desasimilatoria). Algunas especies de Clostridium habitan en el tracto intestinal de animales, otras en el suelo, etc. El ensayo consiste en contar el número de bacterias anaerobias formadoras de endosporas con capacidad sulfito reductora en un medio que contiene sulfito sódico y una sal de hierro, denominado medio Wilson Blair (WB). Estas colonias aparecen de color negro debido a la formación de sulfuro ferroso por reducción del sulfito. Procedimiento 1. Fundir previamente el medio Wilson-Blair 2x (WB) y mantener en baño a 60°C. 22
  • 23. 2. Calentar la muestra de agua (10 ml) durante 10 minutos a 80°C, para matar formas vegetativas e inducir la germinación. Enfriar en el grifo. 3. Añadir la muestra de agua precalentada al tubo de WB 2x 4. Tapar bien el tubo con algodón y con Parafilm™. Mezclar por inversión. 5. Incubar a 37°C durante 24-48 horas. Resultados: Contar el nº de colonias negras existentes en la totalidad del tubo (sin tener en cuenta las colonias puntiformes). El resultado se expresa como nº de clostridios existentes en el volumen de agua sembrada. (Ver normas vigentes). Interpretación de los resultados El agua se considera potable si los valores obtenidos en los ensayos están dentro de los límites establecidos por la ley. Las normas legales exigen: Aerobios totales: No existe límite legal pero los valores máximos recomendados son: Aerobios a 37°C: 10 /ml. Aerobios a 22°C: 100 por ml. Coliformes: Coliformes totales: < 1 / 100ml. Coliformes fecales: < 1 / 100ml. Estreptococos fecales: < 1 / 100ml. Clostridios sulfito reductores: < 1 / 20 ml. NMP (Número más probable) Con los intervalos de confianza del 95 por 100, entre los cuales pueden variar para diversas combinaciones de resultados positivos y negativos. Límite de confianza del 95 por Número de tubos que dan reacción positiva entre Índice 100 3 tubos de 10 3 tubos de 0,1 NMP/100ml 3 tubos de 1 ml Límite inferior Límite superior ml ml 0 0 1 3 < 0,5 9 0 1 0 3 < 0,5 13 1 0 0 4 < 0,5 20 1 0 1 7 1 21 1 1 0 7 1 23 1 1 1 11 3 36 1 2 0 11 3 36 2 0 0 9 1 36 2 0 1 14 3 37 2 1 0 15 3 44 2 1 1 20 7 89 2 2 0 21 4 47 2 2 1 28 10 149 3 0 0 23 4 120 3 0 1 39 7 130 3 0 2 64 15 379 3 1 0 43 7 210 3 1 1 75 14 230 3 1 2 120 30 380 3 2 0 93 15 380 3 2 1 150 30 440 3 2 2 210 35 470 3 3 0 240 36 1300 3 3 1 460 71 2400 3 3 2 1100 150 4800 23
  • 24. Composición de los medios de cultivo empleados Caldo lactobiliado (EC) Agar nutritivo (AN) Biotona 20,0 g/l Extracto de levadura 2 g/l Lactosa 5,0 g/l Extracto de carne 1 g/l Fosfato de potasio 5,5 g/l Peptona 5 g/l Cloruro de sodio 5,0 g/l ClNa 5 g/l Sales biliares 1,5 g/l Agar 20 g/l Caldo azida de Rothe (AR) Peptocomplex 15,0 g/l Extracto de carne 4,5 g/l Glucosa 7,5 g/l Cloruro de sodio 7,5 g/l Azida sódica 0,2 g/l Medio Wilson Blair (WB) Peptona 10,0 g/l Sulfito sódico 0,5 g/l Citrato férrico 0,5 g/l Agar 15,0 g/l Medio EMB (Eosina-azul de metileno) Lactosa 5 g/l Sacarosa 5 g/l Peptona 10 g/l Difosfato potásico 2 g/l Eosina (indicador de pH, cambia de incoloro a negro a pH ácido) 0,4 g/l Azul de metileno (inhibe el crecimiento de bacterias Gram +) 0,065 g/l Agar 13,5 g/l pH 7,2 24
  • 25. Práctica 5 DETERMINACIÓN DE ENTEROBACTERIAS Introducción En esta práctica tratamos de simular un aislamiento de microorganismos a partir de una muestra (heces, agua o alimentos contaminados...), para identificarlos posteriormente mediante un conjunto de pruebas. Concretamente, vamos a realizar la determinación de bacterias pertenecientes al grupo de bacilos Gram (-) anaerobios facultativos, en el que se incluyen las enterobacterias. Muchas de ellas forman parte de la flora normal del tracto digestivo del hombre pudiendo producir enfermedades en determinadas circunstancias. Otros como Salmonella o Vibrio pueden causar enfermedades por la ingestión de alimentos o agua contaminados. De ahí la necesidad de desarrollar pruebas que permitan aislar e identificar rápidamente estos microorganismos. La correcta detección e identificación de los microorganismos presentes en muestras clínicas o de otros orígenes es imprescindible para determinar el origen de las infecciones, seguir el curso de las enfermedades y decidir los tratamientos a aplicar. Todos los puntos del proceso son importantes, desde la forma de tomar y mantener las muestras hasta su manipulación en el laboratorio. Se puede decir que en el proceso de identificación de microorganismos se ponen en juego todos los conocimientos acumulados en Microbiología. La identificación de bacterias puede basarse en muchos caracteres: morfología celular o de las colonias, tinción, fisiológicos, bioquímicos, de tipo serológico y de patogenicidad. Morfología celular: forma (bacilos, cocos) y agrupamiento (diplococos, racimos, rosarios). Presencia o ausencia de estructuras especiales: flagelos, endosporas Morfología de las colonias: forma, color, consistencia, borde, sección... Tinción (Gram, ácido-alcohol resistentes...) Fisiología: aerobios, anaerobios, anaerobios facultativos; temperatura óptima de crecimiento; movilidad, etc. Bioquímica: presencia o ausencia de una enzima o de toda una ruta metabólica; tipo de fermentación de carbohidratos; utilización de citratos como única fuente de carbono, etc Actualmente existen kits que agrupan muchas pruebas fisiológicas y bioquímicas en un formato sencillo y que produce resultados rápidos. No obstante, todavía muchas pruebas requieren el empleo de métodos de cultivo tradicionales, selectivos, diferenciales y de enriquecimiento. El grupo de bacterias gram (-) anaerobias facultativas incluye bacilos o cocobacilos que pueden crecer en presencia o en ausencia de O2 (anaerobios facultativos). 25
  • 26. En anaerobiosis obtienen la energía por fermentación. En este grupo se incluyen las familias Enterobacteriaceae y Vibrionaceae. Familia Enterobacteriaceae Forma: bacilos, cocobacilos Movilidad: inmóviles o móviles por flagelos peritricos Catalasa (+) y Oxidasa (-) La mayoría de enterobacteriáceas pueden fermentar glucosa y otros azúcares. La capacidad o no para fermentar algunos sustratos se utiliza para la identificación de las distintas especies. Por ejemplo, Escherichia, Klebsiella, Enterobacter fermentan la lactosa (coliformes), mientras que Salmonella, Shigella, Proteus no fermentan la lactosa (no coliformes). Familia Vibrionaceae Forma: bacilos ligeramente curvados. Movilidad: móviles por flagelos polares Catalasa (+) y Oxidasa (+) Las vibrionáceas crecen bien en medio alcalino. La mayoría son inofensivas y se encuentran en ambientes acuáticos. Algunos son patógenos, como Vibrio cholerae que es el agente causal del cólera. Objetivo Aislamiento e identificación de las bacterias presentes en una muestra (suspensión que contiene una mezcla de microorganismos). Materiales Se describen para cada experimento Procedimiento 1. AISLAMIENTO Para el aislamiento se utilizan medios que son selectivos para determinadas bacterias, donde podremos ver la morfología, color y otras características de los distintos tipos de microorganismos presentes en la muestra. Se llevarán a cabo inoculaciones en placas de medios sólidos (Agar nutritivo, Verde Brillante, EMB, TCBS) y en medio líquido (Peptona alcalina), empleando las mezclas A o B. 26
  • 27. Procedimiento 1.1. Cultivos en placas Tomar una muestra de la suspensión microbiana con un asa de siembra estéril y sembrar por estría los siguientes medios, con el fin de obtener colonias bien aisladas: 1 placa de Agar nutritivo, 1 placa de Verde Brillante, 1 placa de EMB, 1 placa de TCBS. Incubar a 24 h a 37 °C. Observar la morfología de las colonias y determinar cuantos microorganismos distintos hay en cada mezcla. 1.2. Cultivos en medio líquido Añadir con una pipeta Pasteur estéril varias gotas de la suspensión bacteriana en un tubo de peptona alcalina. Incubar a 37 °C y observar la presencia o no de crecimiento bacteriano. Características de los medios empleados Agar Nutritivo Extracto de levadura 2g/l Extracto de carne 1 g/l Peptona 5 g/l ClNa 5 g/l Agar 20 g/l No es un medio selectivo, por lo tanto permite el crecimiento de muchos microorganismos. Medio EMB (Eosina-azul de metileno) Lactosa 5 g/l Sacarosa 5 g/l Peptona 10 g/l Difosfato potásico 2 g/l Eosina (indicador de pH, cambia de incoloro a negro a pH ácido) 0,4 g/l Azul de metileno (inhibe el crecimiento de bacterias Gram +) 0,065 g/l pH 7,2. Es un medio selectivo de la familia Enterobacteriaceae. También es un medio diferencial ya que nos permite saber por la coloración de la colonia si los microorganismos que crecen fermentan lactosa o sacarosa. Si las bacterias fermentan lactosa o sacarosa, acidifican el medio y la eosina vira a negro dando lugar a la aparición de colonias oscuras. Las bacterias que no fermentan ni lactosa ni sacarosa originan colonias claras. 27
  • 28. Medio Agar Verde Brillante Lactosa 10 g/l Sacarosa 10 g/l Peptona 10 g/l Extracto de levadura 3 g/l NaCl 5 g/l Rojo de fenol (indicador de pH) 0,08 g/l Verde Brillante (colorante que inhibe el crecimiento de muchas bacterias) 0,0125 g/l Agar 20 g/l pH 6,9 Es también un medio selectivo de la familia Enterobacteriaceae y un medio diferencial ya que nos permite saber por la coloración del medio si los microorganismos que crecen fermentan lactosa o sacarosa. Si crecen microorganismos fermentadores el pH del medio se acidifica y se torna amarillento debido al Rojo de Fenol. Si no son fermentadores, el pH se vuelve más alcalino por la utilización de las peptonas, y medio vira a rosa o rojo debido al mismo colorante. Está indicado para el aislamiento de Salmonella (no para S. typhi). Las colonias de Salmonella son blanco-rosáceas, con un halo rojo brillante. Medio Agar TCBS Tiosulfato Sódico 10 g/l Extracto de levadura 5 g/l Citrato férrico 1 g/l Citrato sódico 10 g/l Bilis de vaca 5 g/l Peptonas 10 g/l Sacarosa 20 g/l Azul de Timol 0,04 g/l ClNa 10 g/l Azul de Bromotimol 0,04 g/l Colato de sodio 3 g/l Agar 14 g/l pH 8,6 Es un medio utilizado para el cultivo y aislamiento selectivo de la familia Vibrionaceae, en concreto de Vibrio cholerae y otros vibrios enteropatógenos. Las colonias de Vibrio son grandes, de color amarillo o azul. Este medio inhibe selectivamente el crecimiento de la Familia Enterobacteriaceae, aunque algunas especies pueden crecer dando pequeñas colonias. Medio Peptona Alcalina Peptona 15 g/l NaCl 30 g/l pH 9,0 Es un medio utilizado para el cultivo y aislamiento selectivo la familia Vibrionaceae. Por su pH alcalino sólo permite el crecimiento de Vibrio. Es un medio líquido, lo que se observa es la existencia de crecimiento por turbidez del medio. 28
  • 29. 2. IDENTIFICACIÓN Las siguientes pruebas se deben realizar con los distintos microorganismos obtenidos en los aislamientos en placa. Se llevarán a cabo 4 pruebas individuales: Prueba de la oxidasa, Test de la Catalasa, Prueba de Kligler y Manita-movilidad. Además se llevará a cabo una prueba compuesta por varias reacciones bioquímicas, el API20E. 2.1. Prueba de la Oxidasa. Se trata de determinar si un microorganismo posee citocromo c-oxidasa. Para ello se utiliza un compuesto orgánico que puede ser reducido por el sistema citocromo-oxidasa/citocromo c en presencia de oxígeno molecular, originando un producto coloreado fácilmente apreciable. oxidasa 1-naftol + dimetilparafenilendiamina → azul de indofenol Procedimiento 1. Tomar con el asa de siembra una colonia de la placa de EMB o TCBS (o bien hacer una suspensión de una colonia en agua) y depositar en un porta. 2. Poner la colonia sobre el porta y añadir una gota de sustrato cromógeno fresco (10 mg/ml). 3. Esperar 20-60 segundos y observar si existe algún cambio en la coloración. Si se pone azul es (+). Resultado: Si la tira se pone de color azul oscuro, el microorganismo es oxidasa positivo. 2.2. Test de la Catalasa. Algunas bacterias poseen catalasa, una enzima capaz de destruir el agua oxigenada generada en algunos procesos metabólicos. Esta enzima está presente en la mayoría de las bacterias que contienen citocromos, bien aerobias o anaerobias facultativas. catalasa 2 H2O2 → 2 H2O + O2 Procedimiento 1. Coger con cuidado una colonia con el asa de siembra (evitar coger agar) de la placa de EMB (Enterobacteriaceae) y TCBS (Vibrionaceae) 2. Poner la colonia directamente sobre un portaobjetos sin añadir agua. 3. Echar sobre la colonia una gota de agua oxigenada pura o al 30 %. 4. Observar si se forman burbujas de oxígeno. Resultado: La aparición de burbujas indica que el microorganismo es catalasa positivo. 29
  • 30. 2.3. Test de Kligler. En este test se utiliza el medio de cultivo KIA ("Agar Hierro de Kligler") y proporciona varios datos fisiológicos importantes para determinar si un microorganismo es capaz de utilizar la lactosa, produce gas o ácido sulfhídrico. Es un medio que requiere un procedimiento de inoculación especial. Procedimiento 1. Inocular los microorganismos aislados en la placa de EMB en un tubo de medio KIA con el asa de siembra. La siembra se hará de la siguiente manera: sembrar la superficie por estría y sembrar la parte interna del medio por picadura. 2. Incubar 18-24 h a 37°C. Observar e interpretar los cambios producidos en el medio. En este medio se puede obtener la siguiente información fisiológica: a) Fermentación de glucosa y/o lactosa. El medio contiene una pequeña cantidad de glucosa y una gran cantidad de lactosa. Los microorganismo capaces de fermentar cualquiera de estos compuestos darán lugar a la formación de ácidos que bajan el pH del medio. Como consecuencia el rojo fenol vira a amarillo. La sucesión de eventos metabólicos es la siguiente (ver dibujo): 1º) El microorganismo utiliza la fuente de carbono más asequible en el medio, la glucosa, pero como se encuentra en el medio en muy baja concentración se agota rápidamente. Los productos de su degradación acidifican el medio que cambia de rojo a amarillo. 2º) Al agotarse la glucosa empieza a utilizar las peptonas, pero sólamente en aerobiosis (se corresponde a la zona de la lengüeta del tubo). Este consumo da lugar a residuos amoniacales, produciendo una basificación del medio. El indicador vira a rojo en esta parte del tubo. 3º) Posteriormente se produce el consumo de lactosa, en el caso de los microorganismos que sean capaces de utilizar este disacárido. Esto da lugar a un descenso de pH por lo que cambiará el medio de rojo a amarillo. La razón de que la lactosa se utilice después es debido al tipo de regulación de la ß- galactosidasa, que es la enzima que hidroliza este disacárido para dar los correspondientes monosacáridos. Se trata de una enzima inducible, lo que significa que existe un periodo de latencia entre el agotamiento de la glucosa y la producción de las primeras moléculas de ß- galactosidasa, de tal forma que después de un tiempo de consumo de peptonas se comienza a utilizar lactosa. 30
  • 31. Lac + Glc + Amarillo 6h 10 h 24 h Rojo Lac - Amarillo Glc + Rojo Amarillo Rojo Amarillo Medio KIA Extracto de carne 3 g/l Extracto de levadura 3 g/l Peptonas 15 g/l Lactosa 10 g/l Glucosa 1 g/l Tiosulfato sódico 0,3 g/l Sulfato ferroso (Fe2+) 0,2 g/l Rojo de fenol 0,024 g/l ClNa 5 g/l Agar 12 g/l pH 7,4 b) Producción de gas. La producción de gas se detecta por la formación en el medio de burbujas de gas perfectamente visibles ya que cuartean el medio. El gas se origina mediante la reacción catalizada por la formiato liasa a partir de ácido fórmico. formiato liasa H-COOH → CO2 + H2 Por tanto, son “gas (+)” aquellos microorganismos que produzcan esta enzima. 31
  • 32. c) Producción de SH2. Algunas bacterias son capaces de llevar a cabo la siguiente reacción a partir del tiosulfato añadido al medio: tiosulfato reductasa 2+ - + 2 S2O3 + 4 e + 4 H → 2 SO32+ + 2 SH2 El ácido sulfhídrico se detecta porque reacciona con las sales de metales pesados (Fe2+) presentes en el medio. Esto da lugar a la formación de sulfuro de hierro que se deposita en gran parte del tubo, sobre todo en el fondo, oscureciendo el medio. 2.4. Manita-Movilidad. Se utiliza un medio semisólido para detectar la movilidad de las bacterias. Este medio contiene manitol como fuente de carbono. Si el microorganismo es capaz de usar el manitol se produce una acidificación del medio, lo que da lugar a un viraje del indicador de pH de rojo a amarillo. Medio MM Peptona de caseina 10 g/l Nitrato potásico 1 g/l Manitol 7,5 g/l Rojo fenol 0,04 g/l Agar 3,5 g/l pH 7,6 Procedimiento 1. Inocular por picadura un tubo de medio semisólido con cada uno de los distintos microorganismos aislados. 2. Incubar 24 horas a 37°C. 3. Observar la zona de crecimiento del microorganismo y si ha habido cambio en la coloración del medio. 32
  • 33. Resultado: El test de la movilidad se hace mirando el desplazamiento del microorganismo. Si el crecimiento se limita a la zona de la picadura, el microorganismo no es móvil. Si el crecimiento se produce por todo el medio, el microorganismo es móvil. Géneros Gas SH2 Lactosa Manita-Movilidad Escherichia + - + + Shigella - - - - Salmonella + + - + Citrobacter + + + + Klebsiella + - + + Enterobacter + - + + Serratia + - + + Proteus + + - + Yersinia - - - + 2.5. Batería de pruebas API20E La batería de pruebas API20E es un sistema de identificación rápida para enterobacterias y otras bacterias Gram(-). Básicamente consta de 20 tests bioquímicos estandarizados y miniaturizados y una base de datos. Este sistema presenta las ventajas de ser rápido, eficaz y de permitir realizar numerosas pruebas a la vez. Cada tira de API 20E contiene 20 microtubos o pocillos con distintos sustratos deshidratados. Cada tubo es una prueba bioquímica distinta (ver tabla "sumario de los resultados con API 20E "). Los microtubos se inoculan con una suspensión de microorganismos, en agua o solución salina, que rehidrata los medios. Las tiras se incuban a 37°C y por efecto del metabolismo bacteriano se van a producir cambios de color espontáneos o bien al añadir reactivos. La lectura de las reacciones se hace mediante comparación con una tabla de lectura donde se indica si los microorganismos deben considerarse positivos o negativos para cada reacción según el color aparecido. Procedimiento 1. Preparación de inóculo. Tomar una colonia bien aislada de cada microorganismo y resuspenderla homogéneamente en 5 ml de solución salina (1% de ClNa) o 5 ml de agua estéril. 2. Inoculación de los pocillos. Cada pocillo tiene un tubo y una cúpula (ver dibujo). 3. Llenar el tubo y la cúpula de los pocillos | CIT | , | VP |, | GEL | con la suspensión de bacterias. 4. Llenar los tubos, no la cúpula, de los demás pocillos. 5. Llenar con parafina las cúpulas de los pocillos ADH, LDC, ODC, URE, H2S para obtener anaerobiosis. 33
  • 34. 6. Poner la tira en la cámara de incubación. Previamente poner agua en los alveolos de la cámara para proporcionar una atmósfera húmeda durante la incubación. 7. Incubar a 37°C durante 24 h. Interpretación de los resultados La lectura de los resultados se lleva a cabo por comparación de los colores de cada pocillo con los de la tabla de lectura. Para la lectura se tienen en cuenta los siguientes criterios: Si la glucosa es positiva y/o 3 o más tests son positivos se revelan los test que requieren reactivos: VP: Añadir una gota de KOH 40 % y una gota de α-naftol 6% y esperar 10 minutos. Positivo= color rojo o rosa fuerte. TDA: Añadir una gota de Cl3Fe 10 %. Positivo=color marrón oscuro. IND: Añadir una gota de reativo de Kovacs. Positivo= aparece un anillo rojo en los dos primeros minutos de la reacción. Si la glucosa da negativo y los tests positivos son 2 o menos de 2, no hay que añadir reactivos. Cuando esto ocurre se hacen otros tipos de API como el API OF, el API M o el API 10S para ver determinados metabolismos especiales. Identificación: del conjunto de reacciones se obtiene un perfil numérico. Los pocillos están separados en grupos de tres. En total hay 7 tripletes (el test número 21 corresponde al test de la oxidasa). A cada pocillo se le da el valor 0, 1, 2 o 4 según corresponda: 1. Si la reacción es negativa………… 0 2. Si la reacción es positiva…….…… 1 (primer pocillo de un triplete) 2 (segundo pocillo de un triplete) 4 (tercer pocillo de un triplete) 3. Se suman los valores de cada triplete y se obtiene un código de 7 cifras. 4. Con este código se busca en la tabla de identificación la especie de que se trata. 34

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