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Tecnología del Adn Recombinante
 

Tecnología del Adn Recombinante

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    Tecnología del Adn Recombinante Tecnología del Adn Recombinante Presentation Transcript

    • Tecnología del ADN recombinante
      • ADN recombinante  Molécula de unión artificial de dos fragmentos de ADN.
      • Tecnología de ADN Recombinante  Técnicas que permiten aislar un gen de un organismo para su manipulación y inserción en otro diferente. Resultado  Un organismo, animal, vegetal, bacteria, hongo o virus, producirá una proteína que le sea totalmente extraña.
      • Está regida por tres premisas fundamentales:
      • La lectura precisa de la secuencia de nucleótidos del ADN, el recorte del ADN con las enzimas de restricción en los lugares precisos y conocidos (endonucleasas) y el ligamiento de los restantes fragmentos de ADN con otras enzimas (ligasas);
      • Localización de vectores de clonación, es decir de fragmentos de ADN que para ello, sin perjuicio de lo ya expuesto en el punto anterior, deben poseer dos propiedades:
      • Debe ser capaz de replicarse.
      • Debe poseer un gen que le confiera una propiedad particular a la célula en el que se encuentra, para poder entonces separar las células que contienen el vector de aquellas que no lo contienen, por el empleo de marcadores.
    •  
    • ¿Cómo cortar y pegar el ADN? Enzimas de restricción
      • Las enzimas de restricción son producidas por bacterias como método de defensa contra virus y degradan el ADN extraño. A su vez, el propio genoma bacteriano está protegido contra sus enzimas de restricción mediante metilaciones (es decir, el agregado de un grupo metilo [-CH3)]) en un átomo específico de ciertos nucleótidos.
      • Estas moléculas son indispensables para la ingeniería genética, ya que producen fragmentos que se pueden unir entre sí fácilmente (con la ayuda de un “pegamento molecular”: la enzima ligasa). Las enzimas de restricción cortan dejando extremos cohesivos o romos.
    • Enzimas restricción
    • ¿ Cómo introducir ADN recombinante en las bacterias?
      • Los plásmidos contienen uno o más genes de resistencia a antibióticos y son capaces de autoreplicarse, ya que contienen una secuencia de iniciación
      • Podemos crear una molécula de ADN recombinante usando un plásmido: Es una manera relativamente eficaz de obtener millones de copias del ADN incorporado. Dado que todas las copias del gen provienen de una sola molécula multiplicada a partir de una única bacteria que dio origen a la colonia, esta técnica lleva el nombre de clonación .
      • Clon  grupo de células u organismos genéticamente idénticas.
      • Vector  cualquier organismo o virus capaz de mover genes de un organismo a otro
      • Plásmidos . Son moléculas de ADN circular , con un tamaño menor que el del cromosoma. Se replican con independencia del cromosoma bacteriano ya que tienen su propio origen de replicación .
      • En esta secuencia de dibujos se puede ver como se realiza la inserción de un gen en un plásmido. En la 1ª figura tenemos un gen (color rojo) que interesa insertar en un plásmido (color turquesa)
      • En la 2ª figura , vemos como una enzima de restricción ha cortado el gen y el plásmido, quedando unos bordes cohesivos o pegajosos.
      • La unión del ADN que contiene el gen que se desea clonar con el vector de clonación , se realiza por medio de otras enzimas, denominadas ADN-ligasas , que unen ambos trozos de ADN. El resultado es una molécula de ADN recombinante, ya que contiene fragmentos de ADN de distinta procedencia.
    • ¿Cómo amplificar el ADN? Reacción en cadena de la polimerasa
      • Reacción en cadena de la polimerasa:
      • Se basa en la separación de ambas hebras de ADN, la posterior unión de pequeños fragmentos (denominados primers ) y la extensión de estos fragmentos usando de molde el ADN de la muestra. Así se obtienen dos copias idénticas por cada molécula en cada ciclo de reacción.
      • La reacción en cadena de la polimerasa permite amplificar la muestra de manera espectacular y su sensibilidad es tal que alcanza con una molécula para que la reacción genere una infinidad de copias.
    • Cadena polimerasa
    • ¿Cómo encontrar el gen adecuado? Imanes biológicos: sondas y anticuerpos
      • Las sondas son fragmentos de ADN o ARN de simple cadena complementarias a la región de ADN o ARN que queremos encontrar. Contienen alguna “marca” que permite revelar su unión (hibridación) a la secuencia elegida y de esa manera revela presencia de la región buscada.
      • ¿Cómo se marcan? -Las sondas pueden ser “coloreadas” durante su síntesis utilizando nucleótidos marcados con isótopos radiactivos. -mediante la unión con una molécula que pueda ser detectada posteriormente como fluorescente, un marcador químico que puede ser detectado por un anticuerpo, o una enzima cuya actividad produce el cambio de color de su sustrato.
      • Una de las técnicas más empleadas para localizar fragmentos determinados del genoma es la hibridación in situ .
      • Hibridación in situ con sondas fluorescentes (FISH). Mediante el uso de sondas fluorescentes dirigidas contra los ribosomas, y específicas para taxones concretos se puede identificar la abundancia y morfología de éstos. En este caso observamos en verde Salinibacter ruber y en azul una haloarchaea en una muestra de salmuera de salinas solares.
      • Este es el proceso de Hibridación in Situ por el cual las cadenas Monocatenarias de ADN se hibridan con los fragmentos de RNA que hay en las células, como resultado vemos el diagnóstico de las enfermedades que buscamos. Esta es una Técnica antigua
      • HIstosonda ® representa una nueva generación de Herramientas para el Diagnóstico que sin duda revolucionará la medicina actual pues permite ver la expresión Génica de Genes que hasta ahora no se podían ver.
      Hibridacion in situ, Histosona
    • ¿Cómo estudiar la expresión de diversos genes?
      • Electroforesis en gel, muy usado para separar moléculas de diversos tamaños y es la base de las técnicas para identificar ADN, ARN, y proteínas.
      • Separación de ácidos nucleicos y proteínas. Electroforesis en gel:
      • -Esto se logra por la diferencia de desplazamiento de las moléculas a lo largo de un gel sometido a un campo eléctrico. La carga eléctrica sirve como fuerza impulsora que atrae las moléculas cargadas negativamente hacia el otro extremo del gel que posee carga positiva. Existen distintos tipos de gel; comúnmente se utiliza agarosa o poliacrilamida.
    • Electroforesis
    • ¿Cómo estudiar la expresión de diversos genes? Southern, Northern y Western Blot
      • El nombre de la técnica deriva en parte del apellido del investigador que la desarrolló (Edward M. Southern) y de la palabra inglesa Blot, que significa traspasar. El Southern Blot es una técnica que permite la identificación (presencia o ausencia) de secuencias específicas de DNA de diferentes fuentes e identificar el tamaño del fragmento de restricción que contiene la secuencia.
      • Las técnicas Northern y Southern Blot persiguen fines distintos:
      • El Southern Blot detecta la presencia de ciertas secuencias en el ADN, se usa, por ejemplo, para estudiar mutaciones en el genoma.
      • El Northern , en cambio, permite detectar qué genes son transcriptos en determinadas condiciones.
      • Dos células del mismo organismo se distinguen por los genes que expresan y no por su ADN. El Southern Blot nos permite evidenciar el mismo material genético y el Northern Blot, la expresión de diferentes genes.
      • Si luego queremos detectar proteínas, usaremos otra técnica similar: el Western Blot, que deriva de la electroforesis en gel y separa proteínas mediante la utilización de anticuerpos específicos.
    • Northern blot Western blot Southern blot
    • ¿Cómo sacar fotos de genes activados? Microarreglos
      • Los microarreglos de DNA son soportes sólidos en los cuales se encuentran inmovilizados, en un área pequeña, de cientos a miles de genes de manera ordenada.
      • En los microarreglos, el DNA puede ser impreso, depositado o sintetizado directamente sobre la superficie sólida.
      • Los microarreglos de DNA son una versión paralela y masiva a las técnicas de Northern y Southern blot; sin embargo, en vez de que las sondas de oligonucleótidos sean reconocidas a lo largo de un gel de DNA o RNA, en el microarreglo, las sondas son inmovilizadas en una superficie sólida. Además, la muestra no se marca con isótopos radioactivos, en su lugar se usan colorantes fluorescentes que pueden detectarse por un escáner.
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