Biologia Molecolare
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Biologia Molecolare Presentation Transcript

  • 1. Gli acidi nucleici  Gli acidi nucleici sono macromolecole polimeriche composti da unità chiamate nucleotidi che, a loro volta, sono costituiti da una base azotata, da un pentoso e da un gruppo fosfato. Oltre ad essere costituenti del DNA e dell'RNA i nucleotidi sono composti ricchi di energia e li troviamo anche come trasduttori secondari di segnali chimici portati da alcuni ormoni e come componenti della struttura di importanti coenzimi.
  • 2. Le basi azotate  Le basi azotate contenute nel DNA sono rappresentate da due purine, adenina (A) e guanina (G) e da due pirimidine, timina (T) e citosina (C). Nell'RNA la timina è sostituita da una base analoga, l'uracile.  (osservare la numerazione degli atomi negli anelli. Saranno importanti perchè nei nucleotidi le purine formano un legame con l'atomo di carbonio 1 del pentoso con l'N in posizione 9 e le pirimidine con l'N in posizione 1.)
  • 3. Gli zuccheri (pentosi)  pentosi dei nucleotidi sono il deossiribosio nel DNA e il ribosio nell'RNA:
  • 4. Nucleosidi e nucleotidi  Le basi azotate si legano all'atomo di carbonio in 1' con un legame N- ß-glicosilico (condensazione con perdita di acqua). Come detto le purine lo fanno con l'N in 9' mentre  le pirimidine con l'N in 1'. Questo legame determina la formazione dei nucleosidi che prendono il nome di adenosina, guanosina, timidina, citidina e uridina Un nucleotide è un nucleoside in cui il C in 5' del pentoso lega con legame estere, un gruppo fosfato (nucleotide monofosfato). Questa è la struttura finale dei nucleotidi presenti nel DNA e nell'RNA. Nella figura sotto è rappresentata, come esempio, l'adenosina 5' monofosfato.
  • 5. Legami tra nucleotidi (in un’elica)  I nucleotidi del DNA e dell'RNA sono uniti tra loro mediante legami covalenti fosfodiesterici in cui il gruppo ossidrile di un fosfato in 5' di un nucleotide è unito al gruppo ossidrile della base successiva. L'alternanza dei residui fosfato e dei pentosi formano lo scheletro degli acidi nucleici. La catena di un acido nucleico ha una polarità che ne determina il senso di crescita. Questa è sempre in direzione 5’P 3’OH. Come si vede all'estremità superiore c'è un gruppo 5'P libero, mentre all'estremità inferiore c'è una estremità 3'OH libera. La crescita (sintesi) della catena procede quindi con aggiunte sul 3'OH di un nuovo nucleotide legandolo col fosfato in posizione 5'. E’ interessante notare che lo scheletro zucchero-fosfato è idrofilo e può fare molti legami H con l’acqua, Le basi azotate sono idrofobiche e si disporranno in modo da evitare il contatto con l'acqua. Gli anelli eterociclici tenderanno a disporsi in pile in cui le basi risultano su piani paralleli, l'una sopra all'altra.
  • 6. Appaiamento rigido tra le basi idrofobe  La doppia elica è possibile solo per interazioni ad idrogeno tra coppie di basi specifiche in modo esclusivo. Come dimostrato da Watson e Crick i legami idrogeno tra le basi sono possibili esclusivamente tra adenina e timina (2 legami) e tra guanina e citosina (3 legami).
  • 7. La doppia elica  Il DNA è formato, nel suo scheletro esterno, da due catene idrofile costituite dall'alternanza di deossiribosio e fosfato che "proteggono", avvolgendole, le basi azotate, a loro volta legate al deossiribosio in C 1'. Le eliche si avvolgono attorno ad un ipotetico asse centrale (vedi figura a lato) in senso destrorso e all'interno le basi azotate, idrofobe, formano, con i loro anelli rigidamente planari, pile parallele in ogni elica che si legano con legami idrogeno alle basi complementari dell'altra elica.  La composizione in basi del DNA varia da specie a specie ma non in tessuti diversi della stessa specie e non si modifica con l'età. In tutte le specie, ovviamente, il numero delle adenina è uguale a quello delle timina così come quello delle citosina è uguale a quello delle guanina. Le eliche sono complementari l'una all'altra.  Si dice perciò che esse sono antiparallele ed il senso è chiaro se si considera che la complementarietà comporta che se un elica inizia con una terminazione 5'P, l'altra inizia con una terminazione 3'OH e viceversa. Lo stesso vale per il fine elica.  In conclusione un elica, in base ai legami fosfodiesterici, scorre in direzione 5'→ 3' e l'altra in direzione 3'→ 5'. Come nella figura successiva:
  • 8. La doppia elica  La macromolecola del DNA è un lunghissimo filamento di deossiribonucletidi in cui le basi azotate portano l'informazione genetica mentre lo scheletro esterno di deossiribosio e fosfato ne costituiscono la "struttura portante".  Essa è costituita da una doppia elica con un preciso appaiamento di basi complementari che fungono da stampo nel processo di duplicazione operato dalle DNA polimerasi.  Questi enzimi sono in grado di duplicare un'intera molecola con una frequenza di errori inferiore ad 1 nucleotide su 100 milioni.  Si chiama gene una sequenza di basi (un tratto di DNA) che contiene l'informazione per un determinato "carattere" (in realtà è una catena polipeptidica).  Solo in alcuni virus i geni possono essere contenuti nella molecola di RNA che quindi è il loro materiale genetico.
  • 9. I Cromosomi e il DNA
  • 10. Geni e cromosomi  Le molecole di DNA, le più grandi macromolecole cellulari (una sola molecola può essere 5000 volte superiore al diametro della cellula che la contiene) sono organizzate in strutture chiamate cromosomi, contenuti e racchiuse nel nucleo delle cellule eucariotiche. Nelle cellule batteriche, l'unico cromosoma è sparso nel citoplasma. I batteri contengono anche una o molte molecole di DNA circolare extra-cromosomico chiamate plasmidi, con caratteristiche duplicative autonome. L'insieme di tutto il DNA di una cellula si chiama genoma.  I cromosomi degli eucarioti sono molto più complessi e contengono anche brevi sequenze (10 coppie di basi) ripetute milioni di volte chiamate sequenze altamente ripetitive detto anche DNA a sequenze semplici. Questo DNA, chiamato DNA satellite, è associato, negli eucarioti a due importanti strutture: il centromero e i telomeri. Vi sono poi sequenze più lunghe (un centinaio di basi) ripetute migliaia di volte chiamate sequenze moderatamente ripetitive. Questi frammenti di DNA potrebbero rappresentare la traccia di vie evoluzionistiche abbandonate ed è quasi certo che, almeno in parte, siano un DNA di scarto.  Mentre nella maggioranza dei cromosomi batterici i geni hanno una perfetta colinearità tra sequenze nucleotidiche e sequenze aminoacidiche, negli eucarioti le sequenze nucleotidiche codificanti, esoni, sono intercalate da sequenze non traducibili, gli introni.
  • 11. Geni e cromosomi  Come detto la molecola del DNA è enormemente più lunga rispetto alle dimensioni della cellula che la contiene per cui può trovare il suo spazio solo se viene compattato in una caratteristica complessità strutturale chiamata superavvolgimento. Il DNA superavvolto ha una ovvia tensione strutturale a causa dei ripiegamenti della molecola. Quando questi ripiegamenti non vi sono si dice che il DNA è in uno stato rilassato. Durante la duplicazione o la trascrizione del DNA esso dovrà trovarsi in uno stato di parziale rilassamento. Vi sono alcuni enzimi, le topoisomerasi, che si occupano di variare il grado di avvolgimento del DNA regolando i processi di impacchettamento o di rilassamento.  La cromatina è costituita, nella sua complessità, da parti pressoché uguali di DNA e proteine oltre che da una piccola quantità di RNA. Il DNA, in particolare, si condensa e si ordina interagendo con un gruppo di proteine basiche chiamate istoni in unità strutturali chiamate nucleosomi. Le proteine non istoniche regolano l'espressione genica.
  • 12. Flusso dell’informazione genetica  Il dogma centrale della biologia definisce ed evidenzia i processi fondamentali tramite i quali l'informazione genetica, contenuta nel nucleo nella molecola di DNA, capace di autoreplicazione, si trasferisce al citoplasma. I geni del DNA vengono, nel nucleo, trascritti in una molecola di RNA messaggero, che, passando attraverso i pori della membrana nucleare, va nel citoplasma dove, a livello dei ribosomi, viene operata, tramite il codice genetico, la traduzione dal linguaggio dei nucleotidi a quello degli aminoacidi. Le proteine così sintetizzate sono i prodotti biologici, sui quali viene trasferita l'informazione genetica che così si rende "visibile" nella loro funzionalità.  Perché l'informazione possa essere trasmessa alla generazione successiva. il DNA viene ricopiato con elevatissima precisione eliminando eventuali errori attraverso un efficace meccanismo di riparo.
  • 13. La duplicazione (replicazione)del DNA  Una peculiarità della duplicazione della molecola del DNA è che essa è semiconservativa come fu dimostrato da Meselson e Sthal nel 1957. Coltivando per molto tempo cellule in un terreno contenente solo azoto pesante (15N) [figura a sinistra] e centrifugandone il DNA in un gradiente di densità di CsCl, osservarono un'unica banda (in alto) corrispondente all'azoto pesante. Le cellule furono poi trasferite in un terreno contenente solo azoto leggero (14N). Dopo la replicazione misurarono la densità del DNA trovando una banda di sedimentazione ad un livello più alto (meno denso), risultato interpretato con la formazione di un ibrido (14N/15N). Continuando la replicazione per una generazione si producevano due DNA ibridi e due DNA leggeri.  La sintesi del DNA inizia in un punto in cui la molecola viene preventivamente srotolata chiamato origine. Si forma così un'ansa di replicazione alla cui estremità troviamo le "forcelle di replicazione" e la sintesi può proseguire sia in una che in due direzione. Nel DNA batterico, circolare, le forcelle si incontrano in un punto della circonferenza opposto all'origine.  clicca qui
  • 14. Sintesi del DNA  La sintesi del DNA è catalizzata da un gruppo di enzimi chiamati DNA polimerasi che possono sintetizzare solo se il punto d'allungamento è dato da una terminazione 3'OH libera con direzione di crescita è 5'→ 3'. Poiché le eliche sono antiparallele, ne consegue che un'elica, chiamata catena leader, o stampo, viene letta e copiata nella direzione di avanzamento della forcella e procede in modo continuo e veloce. L'altra elica dovrà essere sintetizzata con ritardo e in modo discontinuo dovendo attendere lo srotolamento dell'elica veloce. Okazaki, biologo giapponese, scoprì che la catena discontinua viene sintetizzata, con frammenti, in direzione opposta all'avanzamento della forcella.  E' da tenere presente che ogni frammento di Okazaki termina con un'estremità 3'OH libera.  La duplicazione del DNA richiede numerosi enzimi e fattori proteici: La separazione delle eliche viene assicurata da particolari enzimi, elicasi, che si muovono lungo il DNA e per tenere separate le eliche consumano ATP. La separazione provoca tensioni topologiche che vengono rimosse dalle topoisomerasi. Il primer di RNA viene sintetizzato dalle primasi e poi rimossi e sostituiti da una nuova DNA polimerasi. Le DNA ligasi riparano eventuali buchi nei legami fosfodiesterici.
  • 15. Sintesi del DNA  Le DNA polimerasi catalizzano la reazione di addizione di un nucleotide ad una sequenza primer e necessita di uno stampo.  le DNA polimerasi necessitano di uno stampo rappresentato dall'elica antiparallela per il corretto appaiamento delle basi e di un primer, molecola di innesco che fornisca una estremità 3'OH libera. Le DNA polimerasi possono aggiungere nucleotidi ad una catena preesistente, ma non cominciare una catena ex-novo. Spesso, l'innesco è un oligonucleotide di RNA potendo la RNA polimerasi cominciare a sintetizzare una catena ex-novo. In seguito questo breve tratto di RNA sarà rimosso da una RNAasi e sostituito da DNA.  E' rilevante osservare che tutte le DNA polimerasi hanno anche un'attività 3'→ 5' nucleasica capace di rimuovere eventuali appaiamenti sbagliati. Questa attività, chiamata proofreading, lettura delle bozze, rende molto precisa ed accurata la replicazione aumentata anche da altri sistemi enzimatici di riparo.
  • 16. Sintesi del DNA  Torna alla descrizione.
  • 17. Sintesi del DNA (riassunto appossimato)
  • 18. Flusso dell’informazione genetica  Descriviamo adesso il flusso dell'informazione genetica che dai geni contenuti nel DNA porta alla loro espressione "visibile", il fenotipo, rappresentato a livello molecolare dalle catene polipeptidiche. Come vedremo, tutti i geni attivi vengono dapprima trascritti da un enzima specifico, l'RNA polimerasi, in RNA messaggero che sono molecole capaci di passare attraverso i pori delle membrane nucleari e portare l'informazione contenuta nel DNA alle macchine molecolari sede della sintesi proteica: i ribosomi. In pratica il linguaggio dei nucleotidi viene tradotto, a livello dei ribosomi, nel linguaggio degli aminoacidi. Questa traduzione viene eseguita seguendo un "dizionario" che è il codice genetico.  Cominciamo a parlare dell’RNA ……
  • 19. Gli RNA  A parte alcuni RNA con funzioni catalitiche o regolatorie, nella cellula vi sono 3 tipi di RNA che partecipano al flusso dell'informazione genetica:  L'RNA messaggero (mRNA) è il prodotto della trascrizione di un gene del DNA ed uscendo dal nucleo porta ai ribosomi la sequenza dei nucleotidi che sarà tradotta in sequenza aminoacidica.  L'RNA transfer (tRNA) "legge" le triplette del mRNA (codoni) (tramite una tripletta complementare chiamata anticodone) e trasferisce il corrispondente aminoacido alla sequenza polipeptidica in crescita.  L'RNA ribosomiale (rRNA) che associato a proteine forma i ribosomi, gli organuli sede della sintesi proteica.
  • 20. Gli RNA  Le RNA polimerasi presenti nelle cellule degli eucarioti sono 3: la RNA polimerasi I, la II e la III. Solo la polimerasi II presiede alla trascrizione dell'RNA messaggero mentre la polimerasi I trascrive i precursori dell'RNA ribosomiale e la polimerasi III presiedono alla sintesi dell' RNA transfer.  La polimerasi II è un grosso enzima composto di 12 subunità e che richiede molte altre proteine, i fattori di trascrizione, per formare il complesso attivo. Rispetto alla DNA polimerasi, la RNA polimerasi contiene una subunità, la σ (sigma), che riconosce le sequenze del sito di inizio sintesi sul DNA, chiamato promotore e quindi non necessita di un innesco. Essa è in grado di cominciare una catena ex-novo. Una delle differenze più macroscopiche tra la replicazione e la trascrizione consiste nel fatto che nella trascrizione dell'RNA viene copiata una sola elica ed un solo piccolo tratto di essa, cioè un gene.  Passiamo ora alla trascrizione che è la copia di un gene in una molecola di RNA messaggero. Questa “piccola” molecola passa dai pori della membrana nucleare per legarsi alla subunità minore dei ribosomi per essere “letta” dagli RNA transfer che legano uno specifico aminoacido.
  • 21. La trascrizione  L'azione della RNA polimerasi è quella di aggiungere unità ribonucleotidiche al terminale 3'OH libero. Essa sintetizza in direzione 5'→3' avendo come stampo l'elica del DNA in direzione 3'→ 5'e quindi l'RNA messaggero che ne risulta sarà copia dell'elica non stampo che è la catena codificante. (vedi figura). In pratica l'RNA messaggero sarà una copia dell'elica 5'→3' con, l'uracile al posto della timina e il ribosio al posto del deossiribosio.  Per permettere la trascrizione, la doppia elica deve srotolarsi e aprirsi temporaneamente formando così una "bolla di trascrizione" che in figura scorre verso destra provocando lo srotolamento di altri tratti di DNA, mentre quello trascritto, a sinistra, si riavvolge. La sintesi di RNA procede fino ad un punto in cui la RNA polimerasi incontra sequenze sul DNA che favoriscono la sua dissociazione e la fine della sintesi. (sequenze non senso) Il gene è stato completamente trascritto.
  • 22. Modificazioni post-trascrizionali  L'RNA messaggero che viene prodotto alla fine della trascrizione si chiama trascritto primario, ma in tutte le cellule eucariote questo RNA neosintetizzato subisce delle modificazioni post trascrizionali molto importanti.  Il trascritto primario degli eucarioti contiene tutta l'informazione genetica per codificare la produzione di una catena polipeptidica ma le sequenze utili, esoni, sono intercalate da sequenze non codificanti, introni, che dovranno essere rimossi con un processo chiamato splicing. In questo modo gli esoni vengono riuniti a formare una sequenza nucleotidica contigua che specificherà per la sequenza aminoacidica funzionante.  L'RNA maturo, risultato delle modificazioni post trascrizionali del trascritto primario, degli eucarioti possiede ad un'estremità un cappuccio 5' e all'altra estremità una coda costituita da 150-200 residui di adenina: poli A. Le funzioni di queste due "appendici" non sono note del tutto anche se sappiamo che il cappuccio potrebbe partecipare al legame dell'RNA al ribosoma e che entrambe potrebbero contribuire a proteggere l'RNA dalle eventuali degradazioni enzimatiche. Tutte queste modificazioni avvengono nel nucleo, prima che l'mRNA lo lasci attraverso i pori della membrana nucleare.  Vedi figura successiva
  • 23. Modificazioni post-trascrizionali Torna alla spiegazione
  • 24. Il codice genetico  La trascrizione del DNA in mRNA assicura la conservazione delle informazioni contenute nei geni e la loro esportazione alle macchine molecolari che dovranno eseguire la traduzione, i ribosomi. L' RNA messaggero è dunque una catena che contiene le sequenze nucleotidiche dell'elica codificante del DNA. Ma come vengono lette tali sequenze per poi tradurle nel linguaggio degli aminoacidi? E' ovvio che non può esserci corrispondenza tra un nucleotide e un aminoacido essendo diversa e largamente insufficiente la "numerosità" dei nucleotidi.  Anche se si considerassero le doppiette, le combinazioni possibili di quattro basi, prese a due a due sarebbe 42 =16, ancora insufficiente per codificare tutti e venti gli aminoacidi.  Accurati studi hanno dimostrato che la sequenza di basi dell'mRNA viene letta a triplette. Le combinazioni possibili sarebbero così 43 = 64, più che sufficienti per codificare i venti aminoacidi. Sulla base di ingegnosi esperimenti scientifici si è potuto alla fine decifrare tutto il codice genetico e le sue proprietà.  Vedi figura
  • 25. Il codice genetico
  • 26. Proprietà del codice genetico  Il codice genetico composto dalle 64 triplette possibili di cui 61 codificanti per un determinato aminoacido e tre di fine lettura o codoni non senso (stop in figura). La tripletta AUG, evidenziata in figura, è il codone d'inizio della lettura sia negli eucarioti che nei procarioti.  Tutte le triplette nell'mRNA prendono il nome di codoni.  La sequenza aminoacidica di una proteina è quindi definita dalla sequenza delle triplette del DNA portate nel citosol dalla sua "fotocopia" rappresentata dall'mRNA. (colinearità)  Il codice genetico non è sovrapposto il che vuol dire che nessun nucleotide fa parte contemporaneamente di più di un codone. E’ senza punteggiatura. Non esistendo una corrispondenza biunivoca tra triplette e aminoacidi, il codice è non ambiguo, poiché nessun codone specifica per più di un aminoacido e degenerato, non dando però a questo aggettivo il significato negativo che ha nell'accezione corrente. La degenerazione del codice invece è la caratteristica più sorprendente per la quale per molti aminoacidi la terza base può oscillare liberamente. La degenerazione è, in definitiva, anche un sistema di difesa dalle mutazioni puntiformi spontanee che se colpiscono la terza base possono non alterare la sequenza aminoacidica e quindi la conformazione tridimensionale e l'efficienza della proteina. Il codice è universale.
  • 27. Colinearità tra geni e catene polipeptidiche  Un gene è una parte di DNA che codifica o per un tipo di RNA o per la sequenza primaria di una proteina con una funzione strutturale definita. La proteina può essere sia un enzima che una proteina con altre funzioni, compresi anche quelle strutturali. L’insieme dei geni determina il genotipo, l’espressione dei geni (proteine) determina il fenotipo. Tra un gene, il suo RNA e le catene polipeptidiche finali esiste colinearità.
  • 28. I tRNA (RNA transfer)  Le molecole che si incaricano di leggere i codoni e di trasportare i relativi aminoacidi sono i tRNA. Come si fede in figura, un tRNA ha un anticodone che legge l'mRNA in Direzione 5'→ 3', per cui cominciano la lettura col nucleotide libero in 3'OH.  Questi particolari RNA sono piccole molecole a singola elica, con tratti di doppia elica. Essi sono formati da quattro anse che li fanno somigliare ad un trifoglio.  L'ansa dell'aminoacido, in terminazione 3' contiene la tripletta CCA, ed è la zona in cui si lega l'aminoacido corrispondente all'anticodone da il nome all' ansa dell'anticodone.  I tRNA contengono basi insolite come la diidrouridina e la pseudouridina ( ψ ) nell'ansa TψC. oltre alla ribotimidina. Alcuni tRNA contengono anche zuccheri modificati. Vedi figura successiva
  • 29. I tRNA  Come detto i tRNA sono sintetizzati dalla RNA polimerasi III e nelle cellule sia procariote che eucariote e vi è almeno un tRNA per ciascun aminoacido. Mentre la struttura a trifoglio è una buona schematizzazione didattica del tRNA, la sua struttura tridimensionale vera somiglia più ad una L rovesciata e attorcigliata, come si vede nella seguente figura.
  • 30. La sintesi delle proteine  Con la sintesi delle proteine si conclude il flusso dell'informazione genetica. Le proteine sono quindi il prodotto dell'azione del gene e dalla loro funzionalità dipende l'efficienza della cellula e quindi di tutto l'organismo.  La sintesi avviene interamente nel citoplasma a livello di organuli chiamati ribosomi. I ribosomi sono complessi sovramolecolari complessi che possono essere liberi e sparsi nel citosol, come nei procarioti, oppure legati a quel complicato intreccio di canali e di cisterne delimitati da membrane che prende il nome di reticolo endoplasmatico rugoso per la presenza, appunto, dei ribosomi.  I ribosomi batterici sono composti dal 65% di rRNA e dal 35% di proteine e sono formati da due subunità, una minore di 30S ed una maggiore di 50S. L'associazione delle due subunità lascia una fessura attraverso la quale passa l'mRNA e lungo la quale il ribosoma si muove durante la sintesi delle catene polipeptidiche. I ribosomi delle cellule eucariote sono leggermente più grandi e le loro due subunità hanno coefficienti di sedimentazione di 40S e 60S. La sintesi delle proteine viene suddivisa in cinque stadi: 1. Attivazione degli aminoacidi 2. inizio sintesi 3. allungamento catena 4. fine sintesi 5. modificazioni post sintetiche a carico della catena polipeptidiche.
  • 31. Sintesi proteica 1° stadio : attivazione dell’aminoacido  Nella prima fase della sintesi proteica, che avviene nel citoplasma, i 20 diversi aminoacidi si legano tramite legame estere all'estremità 3' del loro tRNA ad opera di un enzima chiamato aminoacil-tRNA sintetasi.  l"attivazione" degli aminoacidi è ATP dipendente. Il gruppo carbossilico dell'aminoacido si lega dapprima al ribosio dell'ATP, addizione consentita dall' energia prodotta dall'idrolisi dell'ATP. In seguito si ha il trasferimento del gruppo amminacilico dall'AMP all'tRNA con la formazione dell' aminoacil-tRNA. L'aminoacido è così attivato ed è pronto per essere trasportato sulla catena polipeptidica in crescita dove avverrà la formazione del legame peptidico con l'aminoacido successivo.
  • 32. Sintesi proteica 2° stadio: inizio sintesi  Inizio sintesi. La sintesi proteica comincia con la lettura del codone d'inizio sintesi AUG che specifica per un residuo di metionina (met) ammino- terminale (formil-metionina nei batteri fMet) Il tRNA per la metionina (fMet) avrà l'anticodone UAC.  L'innesco della sintesi proteica necessita di tre proteine chiamati fattori d'inizio (IF-1, IF-2, IF-3). Seguire la figura:  I ribosomi presentano nelle loro subunità due siti, il sito P (peptidilico) e sito A (aminoacilico).  La subunità ribosomiale minore (30S) si lega ai fattori d'inizio IF-1 e IF-3 e su di essa ha luogo il legame con l'mRNA in direzione 5'→ 3'. Sul ribosoma esiste una cosiddetta sequenza consenso (sequenza di Shine-Dalgarno) che immobilizza l'RNA ribosomiale al mRNA indirizzando il codone d'inizio AUG nella posizione giusta per l'inizio della traduzione: nel sito P. Osservare che solo il fMet-tRNA si posiziona nel sito P, tutti gli altri si posizioneranno nel sito A. Come si vede in figura i siti P ed A contengono lo "spazio" per l'alloggio di una tripletta per sito.  A questo punto al sito P si addiziona il tRNA portante la metionina "attivato" dall'IF-2 legato al GTP. Si ha il corretto appaiamento dell'anticodone che scorre in direzione 3'→ 5'al codone dell'mRNA. Successivamente a questo voluminoso complesso si aggiunge la subunità 50S (3) e tutti i fattori d'inizio si staccano dal ribosoma.  Tutto è pronto per la sintesi.
  • 33. Sintesi proteica 3° stadio: allungamento  Dopo che si è insediato il primo tRNA e quindi il primo aminoacido, la metionina o la formilmetionina, si passa alla fase dell'allungamento della catena che consiste nella formazione dei legami peptidici del nuovo aminoacido con quello preesistente. Così la crescita della catena presuppone che la metionina resti il primo aminoacido. Durante l'allungamento entrano in azione i fattori d'allungamento che sono tre proteine solubili nel citosol.  Il secondo aminoacil-tRNA, legato ai fattori d'allungamento, entra nel sito A del ribosoma intero.
  • 34. Sintesi proteica 3° stadio: allungamento (dettaglio)  Il legame peptidico si forma per trasferimento del gruppo ammino- terminale della formilmetionina sul nuovo aminoacido. Si forma il legame peptidico che impegna il gruppo carbossilico della metionina e quello amminico del 2° aminoacido. Si ottiene così un dipeptide e un tRNA "scarico", nel sito P.  I legami peptidici sono sono catalizzati dall'enzima peptidil transferasi.  A questo punto il ribosoma si sposta lungo l'mRNA in direzione 3' di un solo codone con conseguente traslocazione del complesso portante il dipeptide sul sito P. Il sito A si libera per essere "letto" da un nuovo tRNA portante l'aminoacido del nuovo codone. Come si vede nella subunità 50S è presente un altro sito, E (exit), che è il sito d'uscita dei tRNA deacilati.
  • 35. Sintesi proteica 4°stadio: terminazione della sintesi  Il ciclo continua fino a che l'mRNA non presenta sul sito A un codone UAA, UAG o UGA, codoni di fine lettura.  Nei batteri intervengono tre fattori di rilascio che provvedono ad idrolizzare il legame terminale del peptidil-tRNA, il rilascio del polipeptide e la dissociazione delle subunità dei ribosomi, pronti così a cominciare una nuova sintesi.
  • 36. Esperimento di Meselson e Sthal  Torna indietro