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  • 1. Genética Bacteriana – in vivo Transformação Genética O que é transformação genética? Processo pelo qual o DNA na forma livre é incorporado 1. Transformação Genética por uma célula receptora 2. Transdução Resultado: esta célula pode vir a apresentar alterações genéticas 3. Conjugação Qual foi o evento que permitiu a descoberta da capacidade de transformação genética pelas bactérias? E qual foi sua conseqüência? Fred Griffith (1928) Genética Andrea Ghelfi Genética Andrea Ghelfi Fred Griffith 1928 DNA é o “Princípio Transformante” Quando ocorreu a demonstração e comprovação de que o DNA Fred Griffith 1928 e a “metamorfose” das células é o material genético das células e é responsável pela Streptococcus pneumoniae transformação bacteriana? Linhagens virulentas SIII (capsuladas) Dawson e Sai (1931) • Descobriram um método de transformar as células R em Linhagens avirulentas R (mutantes SII – sem cápsula) SIII no tubo de ensaio (sem o camundongo) DNA é o material genético das células Alloway (1932) • Tentou isolar e purificar o “princípio transformante” 1941 Griffith morre num ataque aéreo na Inglaterra! • Problema: difícil reprodução do experimento Genética Andrea Ghelfi Genética Andrea Ghelfi Teste de Flutuação de Luria e Delbrück (1943) Avery, MacLeod e McCarty (1944) Quais foram as duas hipóteses vigentes sobre o “princípio Quando ocorreu a demonstração e comprovação de que o DNA transformante”? é o material genético das células e é responsável pela transformação bacteriana? 1. O organismo é capaz de se adaptar a um ambiente Avery, MacLeod e McCarty (1944) modificado e de passar esta característica a seus • Isolaram o DNA, RNA, proteínas, lipídios e carboidratos descendentes Jean Baptiste Lamarck (1744-1829) das células tipo SIII e inocularam em placas contendo as 2. O organismo pode, com uma pequena probabilidade, células R • Somente o DNA foi capaz de transformar as células R em sofrer uma mutação qualquer, sendo a mutação SIII (virulentas) independente das condições ambientais. Genética Andrea Ghelfi Genética Andrea Ghelfi 1
  • 2. Genética Bacteriana – in vivo Transformação Genética Transformação Genética Competência O que é competência de uma célula? Captação do DNA Capacidade de captar uma molécula de DNA Integração do DNA transformante É regulada por proteínas responsáveis pela captação e Competência Induzida • Íons de Ca e baixa temperatura processamento do DNA • Eletroporação Genética Andrea Ghelfi Genética Andrea Ghelfi Transformação Genética - Competência Natural Transformação Genética - Competência Natural Quais são estas proteínas e como elas atuam? Exemplos de competência natural Proteínas de ligação do DNA, associadas à MP Bacillus: 20% das células se tornam competentes e assim Nucleases permanecem por várias horas As células produzem um peptídeo e tornam-se Streptococcus: 100% se torna competente, por poucos competentes quando este peptídeo atinge uma determinada minutos, durante o ciclo celular concentração Proteína ComA ativadora de vários genes Proteína ComP quinase sensora: reguladora de resposta Genética Andrea Ghelfi Genética Andrea Ghelfi Transformação Genética – Captação do DNA Sub-reino Eubacteria Como ocorre a Captação do DNA? Retém o Há diferenças entre as bactérias corante de Gram Na maioria dos casos, Gram- (na forma de fita simples) e Gram + (fita dupla) Como é a captação do DNA nas bactérias Gram – DNA fita dupla é degradado na forma de fita simples no espaço periplasmático Somente a fita simples é transportada ao citoplasma Genética Andrea Ghelfi Genética Andrea Ghelfi 2
  • 3. Sub-reino Eubacteria Sub-reino Eubacteria Parede Celular de Gram - Parede Celular de Gram + e o ácido teicóico Genética Andrea Ghelfi Genética Andrea Ghelfi Sub-reino Eubacteria Transformação Genética – Captação do DNA Peptideoglicano Gram + Peptideoglicano Gram - Como é a captação do DNA nas bactérias Gram + DNA é captado na forma de fita dupla A fita complementar é degradada no processo O que ocorre durante a transformação? Inicialmente, as células competentes ligam-se ao DNA de maneira reversível Posteriormente, a ligação torna-se irreversível Genética Andrea Ghelfi Genética Andrea Ghelfi Transformação Genética – Captação do DNA Transformação Genética – Integração do DNA O DNA transformante liga-se à superfície da célula por meio de uma Algumas características das célula competente? proteína de ligação ao DNA Aumento de 1000x na capacidade de se ligar ao DNA O fragmento de dupla fita é captado exógeno Ou uma nuclease passa a degradar uma das fitas enquanto a fita São incorporados fragmentos de DNA restante é captada • Há competição entre os fragmentos Após a captação, DNA associa-se a uma proteína RecA Protege da degradação de nucleases O DNA é integrado ao genoma por meio de recombinação São pequenos fragmentos, raramente são transferidos plasmídeos Genética Andrea Ghelfi Genética Andrea Ghelfi 3
  • 4. Transformação – Competência Induzida Transformação – Competência Induzida É possível induzir a competência de uma célula bacteriana? Choque Térmico Choque Térmico Elevada concentração de íons de Ca (CaCl2): desestabiliza Eletroporação a membrana celular Baixa temperatura: aumenta a porosidade da parede Este método permite a captação de DNA plasmidial Baixa eficiência, porém é mais barato Genética Andrea Ghelfi Genética Andrea Ghelfi Transformação – Competência Induzida Eletroporação As células são submetidas a um pulso elétrico que provoca a formação de poros na membrana Permite a passagem de DNA fita dupla Método mais eficiente que o choque térmico, porém mais caro. Depende do eletroporador Genética Andrea Ghelfi 4

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