Vigilancia y Caracterización por Genotipificación de Rotavirus en niños menores de cinco años en el Hospital Isidro Ayora: Resultados Preliminares
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Vigilancia y Caracterización por Genotipificación de Rotavirus en niños menores de cinco años en el Hospital Isidro Ayora: Resultados Preliminares Vigilancia y Caracterización por Genotipificación de Rotavirus en niños menores de cinco años en el Hospital Isidro Ayora: Resultados Preliminares Document Transcript

  • 25/03/2008 UNIVERSIDAD TÉCNICA PARTICULAR DE LOJA La Universidad Católica de Loja CENTRO DE BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR CBCM Vigilancia y Caracterización por Genotipificación de Rotavirus en niños menores de cinco años en el Hospital Isidro Ayora: Resultados Preliminares Paula Torres Bailón Orígenes de ROTAVIRUS RV En 1973 Ruth Bishop y colaboradores descubren RV en Australia. Biopsias de intestino delgado de niños que tenían diarrea severa de origen no bacteriano. Microscopía electrónica, electrónica, dichos virus presentaron apariencia de una rueda de carreta antigua. Bautizados con el nombre de rotavirus, del latín rota, rotavirus, rota, que quiere decir rueda. rueda. Desde entonces reconocidos como el principal agente etiológico de las gastroenteritis virales en las crías de un gran número de mamíferos y de aves.aves. Surge gran cantidad de información sobre las propiedades biológicas y epidemiológicas. 1
  • 25/03/2008 ROTAVIRUS RV RV principal causa de diarrea deshidratante severa en niños • 440,000 de muertes • 82% en países en vías de desarrollo Fuente: Parashar et al. Emerging Infectious Diseases 9(5): 565-72. Rotavirus causa Gastroenteritis Características Clínicas: Periodo de incubación de 1 a 3 d as e odo cubac ó días Fiebre (en algunos casos) Vómito Diarrea (hasta 8 evacuaciones/día) • Heces: • Acuosas • No sanguinolentas • Ausencia de leucocitos • Duración: 3–9 días. 3– Deshidratación moderada a severa Acidosis metabólica 2
  • 25/03/2008 Rotavirus causa Gastroenteritis Características Clínicas: Los síntomas de la enfermedad ocurren comunmente en niños de 3 meses a 2 años de edad. (Población de alto riesgo) La mayoría de infecciones por rotavirus pueden ser asintomáticas, asintomáticas, constituyendo reservorios para transmisión a individuos susceptibles. (Adultos) Rotavirus causa Gastroenteritis Transmisión Oro – fecal. Superficies inanimadas. Agua contaminada. Excresiones asintomáticas. Excresiones sintomáticas. Posiblemente por secreciones respiratorias ??? 3
  • 25/03/2008 Rotavirus causa Gastroenteritis Grandes brotes Exposición rápida y uniforme. La mayoría de los niños durante su primera etapa de vida han sufrido infección por RV. Cierto patrón estacional durante otoño invierno principalmente en países de clima templado. Dosis infecciosas: Niños contaminados excretan 100 billones de partículas p rotavirales por mL de heces. De 104 a 107 de partículas virales son suficientes para causar infección clínica. Los niños podrían eliminar virus y presentarse asintomáticos, asintomáticos, antes de llegar a estar enfermos. Los rotavirus presentes en materias fecales, podrían sobrevivir fecales, por días o semanas sobre superficies expuestas al ambiente. Patofisiología de la Gastroenteritis Rotaviral Ingestion of as few as 10,000 viral particles Infection and destruction of absorptive Intestinal villus cells, secretory (Crypt) NSP4, cells spared an enterotoxin? Decreased Diminished Net fluid excretion absorption of disaccharidase salt and water activity Carbohydrate Net fluid secretion malabsorption Osmotic diarrhea Metabolic acidosis Ischemia 4
  • 25/03/2008 Rotavirus (RV) Familia: Reoviridae Interés Género: Género: Rotavirus Tamaño: 60-85 nm Genoma: • ds RNA • Proteínas Estructurales VP: VP1,VP2,VP3,VP4,VP6,VP7 • Proteínas No Estructurales NSP: NSP1, NSP2,NSP3,NSP4,NSP5 Estructura: Icosaédrica Clasificación de RV Correlación poco definida de Genotipo y Serotipo P: 13 serotipos Grupos: A,B,C,D,E,F,G Subgrupos: I,II,I+II,no I, no II G: 15 serotipos Correlación Clara de Genotipo y Serotipo 5
  • 25/03/2008 NOMENCLATURA Cepa Wa RV Humano: G1P1A[8] G Tipo P Tipo Grupo G1 P1 A [8] # # # G Tipo Serotipo Genotipo Genoma 11 segmentos dsRNA Patrón Corto 0.6 y 3.3 Kb Patrones Electroforéticos de 1 migración en PAGE 2 3 Patrón Largo 4 Patrón Corto 5 Patrón Super corto 6 7 8 Método detección de RV 9 10 11 Laemmli, Laemmli, 1970 Pereira et al., 1983 al., Patrón Largo 6
  • 25/03/2008 PROTEÍNAS DE ROTAVIRUS Segmento Producto Localización Características y función Genómico Proteico 1 VP1 Core RNa polimerasa, unión al ssRNA, unión a VP3 2 VP2 Core Unión al dsRNA, requerida para la actividad replicasa de VP1 3 VP3 Core Guaniltransferasa, metiltransferasa, unión a ssRNA, unión con VP1 4 VP4 Cápside externa p Hemaglutinina, antígeno neutralizante, p g g potenciación infectividad por proteasa, virulencia, putativa región de fusión, adhesión a la célula, induce protección 5 NSP1 No estructural Básica, anillo de zinc, unión al ssRNA 6 VP6 Cápside Interna Hidrofóbica, trimérica, antígeno de subgrupo 7 NSP3 No estructural Ácida, dimérica, unión extreme 3`del mRNA viral, interacción con el F4G1, inhibe traducción del huésped 8 NSP2 No estructural Básica, oligomérica, unión al ssRNA, NTPasa 9 VP7 Cápside externa Glicoproteína integrada en la membrana del RER, trimérica, antígeno neutralizante, 2 regiones hidrofóbicas NH2 terminales, unión al Ca2+, induce protección 10 NSP4 No estructural Glicoproteína transmembrana del RER, participa en morfogénesis, enterotoxina, induce protección 11 NSP5 No estructural Básica, fosfoproteían, unión al ssRNA, proteína quinasa, interacción con NSP2 y NSP6 NSP6 No estructural Interacción con NSP5, presente en viroplasmas y en la mayoría de cepas Villena C, Vigilancia Ambiental Molecular de Rotavirus Grupo A Humano Genoma VP4 P VP7 G Genotipos Comunes G P 1 [8] 2 [4] 3 4 7
  • 25/03/2008 Vigilancia Hospital Isidro Ayora Áreas Consulta Externa Emergencia Pediatría Laboratorio Registro de Datos Prueba diagnóstico de RV Toma de muestras Negativa Positiva Estudios Moleculares Caracterización Toma de muestra Kit RV - Identificación Inmucroma tográfico RV + Estudios Moleculares 1ra. Fase Extracción RNA Kit para extracción RNA Electroforesis en PAGE Tinción con plata + Electroferotipos 1. Reverso 1 R transcripción RT - PCR Para G G1,G2,G3,G4,G9 2. Amplificación 2da. Fase Para P P[4],P[6],P[8],P[9],P[10] Agarosa - Tinción Positivas para Comprobación genotipo GyP SECUENCIACIÓN 3ra. Fase Análisis Epidemiológico Molecular 8
  • 25/03/2008 Resultados Preliminares: Vigilancia ROTAVIRUS FRECUENCIA PORCENTAJE 78.7% Negativo Negativo 303 78.7% Positivo 82 21.3% TOTAL 385 100% 21.3% Positivo F 47.5 % EP E-P EDA 59.76% 79.3% CE P 14.63% 25.61% Otro Dx 20.7% M 52.5% Importancia de los datos de Vigilancia Enfermedad Diarreica Aguda EDA en la ciudad de Loja Ministerio de Salud Publica Causa Periodo Casos por Edades (años) <1 1a4 5 a 14 No definida Enero-Diciembre 2005 4368 8692 1949 Enfermedad Diarreica Aguda EDA Hospital Regional Isidro Ayora Vigilancia de Rotavirus Causa Periodo Casos por Edades (años) <5 Rotavirus Julio-Octubre 2005 82 9
  • 25/03/2008 Resultados Preliminares: Caracterización MP 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 Alto Peso Molecular 4 5 6 Tamaño Mediano 7 8 Triplete Característico 9 10 11 Más Pequeños Casos Positivos Electroferotipo: Rotavirus Patrón Largo 82 31 MP: Marcador de Peso Molecular 100 pb 2,3,4,8,9,10: Electroferotipos Patrón Largo Gracias Público Presente. Mi E i d T b j d l CBCM-UTPL Equipo de Trabajo del CBCM-UTPL. Autoridades Compañeros Estudiantes EBQF-UTPL EBQF- Diana Villacis Jeimy Ruiz Andrea González Doris Macas Gabriela Cevallos Ma. Isabel Vivanco 10