Insulin

4,868 views

Published on

1 Comment
1 Like
Statistics
Notes
No Downloads
Views
Total views
4,868
On SlideShare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
1
Actions
Shares
0
Downloads
124
Comments
1
Likes
1
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

Insulin

  1. 1. TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNGSản xuất protein tái tổ hợp trên E.coli INSULIN
  2. 2. Nhóm:1. Trần Thị Huyền Trân 610031582. Huỳnh Thị Trúc 610032673. Lê Thị Thúy Quyên 610031184. Nguyễn Thị Kim Thao 610031325.Huỳnh Thị Thanh Trúc 610032686.Phan Mỹ Hoàng Mai 610030807.Trần Nguyễn Hương Trang 61003262
  3. 3. I/ Bệnh tiểuđường:
  4. 4. II/ Một số loại insulin trên thị trường:
  5. 5. Thời gian bắt Loại insulin Màu sắc Nguồn gốc Thời gian hết tác đầu tác dụng dụngTác dụng nhanh - Insulin Trong Người 30 phút (tiêm dưới 8h Actrapid HM Lợn da) - Insulinum maxirapid Tác dụng bán chậm Đục Người 1h 20h - Insulatard HM Lợn 18h - InsulinLente Loại pha trộn -Mixtar HM Đục Người 30 phút 20h 30/70 Tác dụng rất chậm Đục Bò 4h 30h -Utra – Lente
  6. 6. III/ Cơ sở khoa học của công nghệ sảnxuất insulin1. Cấu trúc phân tử insulin: Insulin người là 1 polipeptide Bao gồm: - Chuỗi A 21 aa - Chuỗi B 30aa. Có 1 cầu nối disulfur giữa 2 chuỗi A và 2 cầu nối giữa 2 chuỗi A và B. CTHH: C257H383N65O77S6. Trọng lượng phân tử: 5808
  7. 7. 2. Vai trò của insulin:
  8. 8. 2. Vai trò của insulin:  Insulin làm tăng tính hấp thụ của các acid amin.  Thúc đẩy sự sinh tổng hợp các acid béo trong gan
  9. 9.  Insulin làm tăng tính thấm của các ion kali, magie và phosphate vô cơ tạo điều kiện cho quá trình phosphoryl hóa và sử dụng glucose.
  10. 10. IV/ Công nghệ sản xuất insulin: Năm 1922, Fred Banting và Charles Best thuộc Đại học tổng hợp Toronto (Canada) thông báo họ đã tìm ra insulin và ứng dụng chất này trong điều trị bệnh tiểu đường ở người.
  11. 11. Nhược điểm:+Insulin từ động vật có cấu trúc không hoàn toàn giốnginsulin người.+ Hoạt động chức năng trong cơ thể kém hơn insulinngười.+ Khả năng hấp thụ kém.+ Có thể gây ra các phản ứng miễn dịch trong cơ thể.+ Trong quá trinh tách chiết không thể loại bỏ hết cáctác nhân gây bệnh ở động vật.+ Qui trình tách chiết đòi hỏi kỹ thuật cao.+ Chi phí đắt (cần lượng lớn tụy để sản xuất) => giáthành cao.+ Khó sản xuất lượng lớn với qui mô công nghiệp.
  12. 12. V/ Công nghệ sản xuất insulin táitổ hợp trên E.coli: 1. Sinh tổng hợp insulin tái tổ hợp theo phương pháp mini proinsulin (MPI):
  13. 13. Bước 1: bằng kỹ thuật tách gen sử dụng trong sinh học phân tử tách được gen mã hóa proinsulin người trên NST số 11
  14. 14. Bước 2: Tách và thiết kế plasmid tái tổ hợp- Cắt gen mã hóa proinsulin và plasmid bằng một loạigiới hạn. Nối bằng ADN ligase của phageT4.- Thiết kế các trình tự mã hóa cho các protein tín hiệugiúp vận chuyển insulin ra ngoài tế bào chất.- Nếu sử dụng mRNA tách được từ trên tiến hành nhưsau:+ Sao mRNA tinh khiết thành cDNA nhờ enzyme phiênmã ngược và nhờ các dNTP (trong phản ứng RT –PCR).+ Cài đoạn cDNA mã hóa insulin hoàn chỉnh vàoplasmid đứng sau một promoter mạnh. Biến nạpvector tái tổ hợp vào E.coli.
  15. 15. Chủng E.coli: BL21 DNA mã hóa 8 – 12 aa TNF-α và His10 được(DE3) tổng hợp hóa học.Gen: T7 RNAPPromoter lacUV5 Cắt bằng NdeI và BamHI Plasmid T2 Chèn vào downstream T7 promoter Biểu hiện trong pET-3a Cắt bởi endonuclease Thu pT2
  16. 16. Gen mã hóa cho proinsulin ngườiPlasmid PCRpT2-hPI (5 DNA overlapping, mỗi đoạn 65 – 68 base như mẫu) Cắt bằng BamHI và HindIII Chèn vào pT2 pT2-hPI
  17. 17. Plasmid pT2M2PI:Plasmid Gen mã hóa M2PI đem PCRpT2M2PI: (gen proinsulin người làm mẫu DNA) Cắt bằng BamHI và HindIII Chèn vào pT2 pT2M2PI
  18. 18. Bước 3: Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli nhờ phương pháptrộn với dung dịch ion Ca hoặc tạo lỗ xung điện. Sau quá trình biếnnạp cần chọn lọc những dòng vi khuẩn mang gen mong muốn.Bước 4: Các vi khuẩnchuyển gen sau đó đượcđưa vào lên men.Nuôi chúng trong nồi lênmen sử dụng phươngpháp nuôi cấy liên tục,các chất dinh dưỡngđược bổ sung thườngxuyên để đảm bảo sựtăng trưởng của vikhuẩn theo hàm số mũ.Sau 20 phút có hàngtriệu vi khuẩn đượcnhân lên qua nguyênphân. Chỉ sau 1 thờigian ngắn, sinh khốităng lên rất nhanh vàgen insulin được tổnghợp
  19. 19. Môi trường: Luria – Bertani- 1% (w/v) peptone- 0,5% (w/v) cao nấm men- 1% (w/v) NaCl- 0,1% (w/v) NaOH (v/v)- duy trì 200 mg/l ampicilline
  20. 20. Sơ đồ biểu hiện mini proinsulin trong plasmid pT2M2PI
  21. 21. Bước 5: Tiền tinh sạchSau khi lên men cần tách tế bào vàkhử trùng nhiệt.+ Dùng enzyme lizozyme phá vỡmàng tế bào sau đó dùng hỗn hợpchất tẩy rửa để tách lớp màng lipit+ Bằng phương pháp ly tâm lọc vàtách được proinsulin.
  22. 22. Bước 6: Hoạt hóaHoạt hóa proinsulin vitro (sau tinhsạch ở dạng mạch thẳng) bằng cáchxử lý dung dịch đệm, giúp nó đạtcấu trúc bậc 4 (tạo phản ứng xoắncuộn), sau đó dùng enzyme đặchiệu trypsin để phân cắt proinsulin.Khi đó sản phẩm thu được mới cóhoạt tính cần thiết.
  23. 23. Phản ứng xoắn cuộn+ 50mM glycine buffer  mini proinsulintinh sạch (50 µM, 0.375 mg/l)+ 2-mercaptoethanol  phản ứng cuộnxoắn(bằng 2 lượng mini proinsulin) (18h, 4oC) ↓+ H3PO4 đến pH 2.5  Dừng phảnứng ↓ Tinh sạch (Reverse-phase HPLC) ` ↓ So sánh peak với mini proinsulin xoắn cuộn với insulin
  24. 24. Bước 7: Hỗn hợptinh sạch chỉ còncó insulin+ Bằng phương phápsắc ký, tách, vàphương pháp miễndịch gắn enzyme.
  25. 25. 2. Sinh tổng hợp insulin theo phương pháp 2 chuỗi:
  26. 26. Nguồn:http://www.bvdkquangnam.vn/tin-tc/thong-tin-thuc/267-insulin-va-cong-ngh-sn-xut-insulin-bng-dna-tai-t-hp-.htmlhttp://vi.scribd.com/doc/93630047/G5-miniproinsulinhttp://thuviensinhhoc.com/chuyen-de-sinh-hoc/cong-nghe-sinh-hoc/5296-san-xuat-thuoc-bang-cong-nghe-dna-tai-to-hop.html

×