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  • 1. INMUNODIAGNOSTICO DR. CARLOS ESQUERRE AGUIRRE MEDICO PATOLOGO CLINICO HVLE
  • 2. INMUNOANALISISSON TECNICAS PARA DETECTAR Y CUANTIFICAR AG O AC.UN IE DEBE SER CONFIABLE, OPORTUNO Y EFICIENTE.
  • 3. InmunoanálisisLa gran especificidad de Ac, los hace de gran utilidad como reactivos para detectar, cuantificar y purificar AgDebido a que puede producirse Ac prácticamente frente a cualquier molécula, se les puede usar para estudiar cualquier tipo de molécula
  • 4. InmunoanálisisBasado en la presencia de un Ag o Ac, cuya cantidad puede determinarse por medio de una molécula indicadoraCuando la molécula indicadora es marcada con un radioisótopo, (Yalow y Berson, 1959) se puede cuantificar ultizando instrumentos que detectan la descomposición radioactiva. RIA
  • 5. InmunoanálisisCuando la molécula indicadora está unida covalentemente a una enzima, puede cuantificarse determinando la capacidad de la enzima de transformar un sustrato transparente en un producto coloreadoA este se le llama enzimoinmunoanálisis
  • 6. CLASIFICACION DE IE POR USO DE MARCADORSIN MARCA: PRECIPITACION, INMUNOELECTROFORESIS, NEFELOMETRIA, INMUNOTURBIDIMETRIA.CON MARCA: ISOTOPICOS Y NO ISOTOPICOS (ENZIMATICOS Y NO ENZIMATICOS)
  • 7. CLASIFICACION DE IE DE ACUERDO AL METODO DE DETECCION:COLORIMETRICOFLUORESCENTEQUIMIOLUMINISCENTE
  • 8. CLASIFICACION DE IE SEGÚN EL DISEÑO DEL SISTEMA DE REACCION:HOMOGENEO Y HETEROGENEOCOMPETITIVO O NO COMPETITVO
  • 9. NOMENCLATURASE HA RECOMENDADO LLAMAR:INMUNOENSAYO (RADIO, ENZIMO Y FLUOROINMUNOENSAYO) A AQUELLOS QUE SON DE DISEÑO COMPETITIVO.ENSAYO INMUNOMETRICO (INMUNORADIOMETRICO, ETC) PARA AQUELLOS NO COMPETITIVOS
  • 10. EMPLEO DE MARCADORES YNOMENCLATURA DE LOS IEEL ANALISIS TIPO I (EXCESO DE ANTICUERPO) ESTA BASADO EN MARCAR EL AC REACTIVO.EL TIPO II (EXCESO DE ANALIZADO), SE MARCA LA SUSTANCIA ANALIZADA.
  • 11. Coloides metálicos Látex Enzima MarcadoFluoróforo Radioisótopo Hematíes Partículas de colorante
  • 12. LIMITES DE DETECCION DEMARCADORES DE INMUNOENSAYOS MARCADOR FOSFATASA ALCALINA EUROPIO QUELATO YODO 125 ESTER DE ACRIDINIO RUTENIO
  • 13. CRITERIOS PARA SELECCIONARUN MARCADOR ENZIMATICO PUREZA SENSIBILIDAD FACILIDAD DE VELOCIDAD DE DETECCION AUSENCIA DE FACTORES QUE INTERFIERAN GRUPOS REACTIVOS POTENCIALES ESTABILIDAD IDONEIDAD PARA UN EIA HOMOGENEO
  • 14. Ventajas EIA frente a RIASe evita la exposición a radiacionesReactivos más establesNo se requiere instalaciones ni autorizaciones especialesMediciones rápidas y fácilmente automatizablesCosto
  • 15. ELISAElemento de captura en la fase sólida.Anticuerpo en el suero del paciente (+) o (-)Reacción con el conjugadoCambio de aspecto del substrato por acción de la Enzima.El cambio de aspecto del substrato es proporcional a lacantidad del elemento “puente” es decir el anticuerpo presenteen el suero del paciente positivo.El suero que no aporta el elemento puente (anticuerpo) , no mantiene a la enzima en el sistema y por lo tanto no seproducen cambios en el aspecto del substrato y es negativo
  • 16. ELISA (+) (-)Antígeno-Anticuerpo y conjugado antiglobulina - EnzimaCambio de color del substrato
  • 17. Respuesta Inmunológica Ag IgG Concentración relativa IgM Infección Días Semanas Meses Años Seroconversión
  • 18. ELISAReacción antígeno-anticuerpo Antígeno Anticuerpo Ag - Ac
  • 19. Elisa : Reacciónmuestra - conjugado
  • 20. Elisa: Reacción del sustrato Cromógeno O2 TMB H 2O 2 H2O Tampón sustrato
  • 21. Bioelisa :Leyendas Anticuerpo Anticuerpo IgM de captura Antígeno Antígeno recubriendo el pocillo Anticuerpo IgG Conjugado
  • 22. Detección de IgG TMBFaseSolida Muestra Conjugado
  • 23. Detección de Antígeno TMB FaseSolida Muestra Conjugado
  • 24. Detección de IgM: Inmunocaptura TMB FaseSolida Muestra Conjugado
  • 25. Protocolo standard bioelisa:1.- Agregar muestra Lavado 37°C
  • 26. Protocolo standard bioelisa:2.- Agregar el Conjugado Lavado 37°C
  • 27. Protocolo standard bioelisa:3.- Agregar del Sustrato TMB H2O2 H2O2 TMB TMB Temp. Amb. TMB H2O2 H2O2 TMB
  • 28. Protocolo estándar bioelisa:4.- Agregar Solución deparada H2SO4
  • 29. Protocolo estándar bioelisa:4.- Lectura deAbsorbancias Fotocélula LECTURA DENSIDADES OPTICAS Cálculo de resultados Filtro de 450 nm Fuente de luz
  • 30. Agregar muestras y controles Incubación Lavado Dispensar Conjugado Incubación Lavado Dispensar Sustrato IncubaciónAgregar solución de parada Lectura a 450 nm
  • 31. Sensibilidad EspecificidadReproducibilidad Estabilidad Facilidad de uso Automatizable
  • 32. ElisaGuía de errores
  • 33. Causas de error en el ELISA Leer y entender el manual de usuarioMejor Programar el trabajoprevenir Preparar con tiempo el material
  • 34. Causas comunes de error en el Elisa Errores de dilución durante la preparación de controles y reactivos Rascado de la fase sólida durante la adición de muestras y/o reactivos Pipeteo Utilización de un tamaño de punta incorrecto Comprobar que la pipeta no esté bloqueada y que dispense correctamente Evitar contaminación cruzada con muestras y/o reactivos Utilize puntas nuevas cada vez
  • 35. Causas comunes de error en el Elisa Uso de instrumentación en mal estado. Asegurese que los instrumentos funcionen correctamente y estén calibrados. Uso de los kits todavía frios. Permita que los kits y las muestras adquieran la temperatura ambiente antes de ser utilizados Mezclar componentes de diversos lotes. Los reactivos están optimizados para cada lote de fabricación. Contaminación: Salpicaduras de muestras o reactivo durante cualquier paso intermedio de la técnica Uso de puntas recicladas Uso de viales sucios o mal secados en la preparación de los reactivos
  • 36. Causas comunes de error en el Elisa Calidad del agua destilada/desionizada. Parámetros como pH, iones, puede afectar la cinética de los Elisas. La pureza del agua es muy importante. No utilizar los reactivos del kit pasada su fecha de caducidad Retornar los kits a la nevera, entre 2-8°C inmediatamente después de usarlos. Muy importante: Conserve las tiras no utilizadas junto con la bolsita desecante, en la bolsa de plástico con cierre que se incluye en cada kit
  • 37. Errores en el ELISA Esquema de investigaciónNº Acción OK?1 Revisar el procedimiento y determinar si ha habido algún error u omisión2 Comprobar fecha de caducidad de los componentes Parámetros físicos: Tiempo3 Temperatura incubación Temperatura ambiente4 Equipo de laboratorio: Pipetas, lavador, lector5 Calidad del agua desionizada / destilada6 Preparación y conservación de los reactivos7 Los controles han funcionado según lo esperado ?8 Estaban los reactivos a temperatura ambiente?
  • 38. ¿Por qué falsos positivos? Espacios libres Antígeno HIV cubiertos por la soluble fijado en Albúmina la placa bovina IgG contra Albúmina bovina IgG específica contra HIVHIV Positivo verdadero Falso positivo
  • 39. ¿Por qué falsos positivos?HIV Positivo verdadero HIV Falso positivo
  • 40. RADIOINMUNOANALISIS Así como en el sistema ELISA usamos una enzima y valoramos los cambios en el aspecto del substrato , en el RIA nos valemos de un ISOTOPO RADIOACTIVO unido a sistemas de anticuerpos . Las lecturas se hacen por una valoración de la cantidad de radiación emitida , la que es proporcional a la concentración del analito estudiado .
  • 41. RADIOINMUNOANALISISVALIDACION: CONSISTE EN COMPARAR SU RENDIMIENTO CON OTRO DE REFERENCIATRANSFERIBILIDAD:TIEMPO DE REALIZACION:SUSTANCIA PROBLEMA MARCADA.
  • 42. RADIOINMUNOANALISISLOS METODOS RIA OFRECEN UN CONSIDERABLE ATRACTIVO POR SU EXTREMA SENSIBILIDAD, SU RELATIVA FACILIDAD DE CREACION Y SU COSTO RELATIVAMENTE BAJO.
  • 43. COMPONENTES DELSISTEMA RIASUSTANCIA: AG NO MARCADO.AG MARCADO.AC.MEDIO DONDE OCURRE LA REACCION.ISOTOPOS COMO TRAZADORES: 3H Y 125 I.
  • 44. QUIMIOLUMINISCENCIAEl principio de la prueba es similar al de ELISA es decir una reacción de antígeno y anticuerpo .Esta reacción se objetiva por la producción de luz a partir de una molécula de alta energía que es descompuesta por actividad enzimática.La cantidad de luz producida es proporcional al analito investigado.
  • 45. VENTAJAS DE LAQUIMIOLUMINISCENCIA PRESENTAN UN GRAN INTERVALO LINEAL. BAJO LIMITE DE DETECCION. ELEVADA ESPECIFICIDAD Y RAPIDEZ. LA MAYORIA SON PROCEDIMIENTOS DE UN PASO. NO ES NECESARIO LARGAS INCUBACIONES. ESTABILIDAD DE COMPUESTOS LUMINISCENTES
  • 46. FACTORES QUE AFECTANLAS MEDICIONES QLCEL PH ES UNA VARIABLE IMPORTANTE.LAS REACCIONES SON DEPENDIENTES DE LA TEMPERATURA.LOS COMPONENTES SERICOS COMO ADENINA Y NUCLEOTIDOS DE PIRIDINA. (LAVADOS).LA LUZ AMBIENTAL
  • 47. ELECTROQUIMIOLUMINISCENCIAUTILIZACION DE MARCADORES NO ISOTOPICOS MUY ESTABLES.LA ELEVADA DETECTABILIDAD.EL AMPLIO INTERVALO DE MEDIDALA FACIL SEPARACION DE LA
  • 48. NECESIDADESEMERGENTES EN LOSANALISISMENORES LIMITES DE DETECCION.DETECCION DE ANALITOS DE BAJO PM.MAYOR ESPECIFICIDAD.VELOCIDAD DE PROCESAMIENTO DE GRAN NUMERO DE MUESTRAS.DIAGNOSTICOS RAPIDOS.