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  • Introducción1.1. La preservación de alimentos mediante la utilización de productos naturales. Los consumidores actuales demandan cada vez más, alimentos sin sustanciasconservantes o antimicrobianas sintetizadas químicamente y asocian alimentos sanos yseguros con alimentos frescos o mínimamente procesados. Esto ha llevado a la búsquedade nuevas formas de preservación y al análisis de sus efectos sobre la estabilidadmicrobiológica de los alimentos (Buchanan & Phillips, 1990; Leistner 1992; 1995). La estabilidad microbiológica y por lo tanto la inocuidad de la mayoría de losalimentos procesados (tradicionales y nuevos), está basada en la combinación de diversosfactores (composición química bruta, pH, actividad de agua, temperatura de conservación,tratamiento tecnológico, etc). Estos factores controlan el desarrollo microbianopreviniéndolo, retardándolo y/o incluso inactivando a los microorganismos (Leistner,1995). La tecnología de manipulación de factores implica exponer a los microorganismos aun ambiente adverso y de esta manera inhibir su crecimiento al interferir, mediante lacombinación de los factores, con su homeostasis (Gould, 1988). La homeostasis es latendencia de los microorganismos a estabilizar su ambiente interno en respuesta a factoresexternos. Si el equilibrio interno es modificado por los factores de preservación (actividadde agua, pH, temperatura, aditivos) utilizados en la formulación del alimento, entonces losmicroorganismos dejarán de multiplicarse o reducirán su velocidad de reproducción,canalizando su energía a reestablecer el equilibrio, cuando esto no ocurre puede producirsela muerte del microorganismo. Los diversos factores de preservación tienen diferentesmecanismos de acción sobre los microorganismos (Leistner, 1995). Uno de los másútilizados para prolongar la vida útil de los alimentos (lapso de aptitud) es el agregado desustancias que retardan o inhiben la proliferación microbiana. El conocimiento de lainfluencia de las sustancias utilizadas así como los efectos de la combinación de lasmismas, puede permitir el desarrollo de procesos mínimos pero más efectivos para asegurarla estabilidad microbiológica de los alimentos. Ohlsson (1994) señala que los hábitos alimenticios de los consumidores de estadécada están cambiando e identifica aspectos como dieta y salud, conveniencia, seguridad eingredientes naturales como nuevas tendencias en el mercado de alimentos procesados. Enmuchos países se está consolidando el desarrollo y consumo de alimentos más “naturales”, 2
  • Introducciónminimamente procesado, libres de aditivos o al menos con cantidades reducidas de éstos(Giese, 1994), por lo que existe un peligro potencial en la seguridad de los alimentos alreducir parte de los factores utilizados habitualmente para su preservación (Russel &Gould, 1991). Giese (1994) y Davidson (1996) mencionan que la seguridad de los alimentosmejora significativamente con la incorporación de compuestos antimicrobianos, ya queestas sustancias se añaden a los alimentos para prevenir la descomposición de los mismos,por la actividad metabólica microbiana. Davidson (1996) define a los antimicrobianoscomo compuestos químicos presentes o añadidos en los alimentos, que retardan elcrecimiento microbiano o inactivan a los microorganismos y por lo tanto, detienen eldeterioro de la calidad y brindan seguridad al alimento en el cual se encuentran. El aspectomás importante de la pérdida de la calidad de los alimentos es el asociado con el deterioromicrobiano y en particular con la presencia y/o desarrollo de microorganismos patógenos.Esto ha llevado a investigar el uso y modo de acción de conservadores disponibles a fin deemplearlos de manera eficiente y a estudiar su aplicación al combinarlos con otras formastradicionales y noveles de preservación. Los principales antimicrobianos utilizados en alimentos actúan principalmenteinhibiendo y/o disminuyendo el crecimiento de los microorganismos, aunque algunospueden también desactivarlos (Russell & Gould, 1991; Gould, 1996). Las sustanciasempleadas como conservadores se usan esencialmente para prevenir el deterioro de losalimentos durante su almacenamiento y distribución, asegurando de esta manera, lainocuidad del producto durante el lapso de aptitud establecido. Por lo tanto, el principalobjetivo de ataque de estas sustancias serán aquellos microorganismos que puedandesarrollarse y deteriorar los alimentos. Además, dichas sustancias, se convertirían en unimpedimento para el crecimiento de los microorganismos patógenos y productores detoxinas (Gould & Russell, 1991; Davidson, 1996). Numerosos investigadores concuerdan con el hecho de que la evaluación deaditivos para alimentos debe basarse en un balance entre riesgos y beneficios. Por lo tanto,es fundamental que para cada aditivo, dichos riesgos y beneficios, estén identificados ydefinidos adecuadamente. Particularmente, en el futuro, serán aptos como aditivos aquellosque tengan o cumplan con varias funciones en los alimentos a los cuales se incorporan(Davidson & Branen, 1993). La búsqueda de nuevos compuestos químicos que puedanayudar a la conservación de alimentos se ha visto restringida por ciertos aspectos, 3
  • Introducciónprincipalmente económicos. En estos términos, desarrollar un nuevo compuesto y lograrque éste sea aprobado tiene un costo significativamente elevado, sin contar además, eltiempo considerablemente extenso que demanda el proceso de aprobación. Para asegurarque el aditivo desarrollado no tiene ningún efecto negativo sobre la salud, se deben realizaruna serie de pruebas que incluyen: genotoxicidad, fertilidad, teratogenicidad, toxicidadsubcrónica, y toxicidad crónica, incluyendo carcinogénesis. Una prueba con resultadopositivo descalifica al compuesto para que éste pueda ser utilizado en los alimentos (Lück& Jager 1997). Estos obstáculos han conducido a la búsqueda de nuevos conservadores porotras vías. Una de las alternativas, es examinar compuestos que en la actualidad sonutilizados en la industria de alimentos con distintos propósitos, los cuales poseencomprobado potencial como antimicrobianos, están aprobados y son seguros en los nivelesutilizados. Dentro de estos compuestos se encuentran los llamados antimicrobianosnaturales (o productos naturales) presentes en plantas (Nychas, 1995, Davidson, 1996).1.2. Compuestos con actividad antimicrobiana presentes en plantas La búsqueda de nuevas alternativas para extender el lapso de aptitud de muchosproductos alimenticios ha reorientado la investigación hacia los productos naturales.Dentro de éstos existe un gran interés en el uso de los llamados antimicrobianos naturalescomo posibles susbtitutos de los tradicionalmente utilizados (Nychas, 1995) y existenvarios reportes en la bibliografía acerca de la actividad antimicrobiana de especies, hierbasy plantas o sus extractos (Hitokoto et al., 1980; Shelef, 1983; Jay & Rivers, 1984;Karapinar, 1985; Thompson, 1986; Graham & Graham, 1987; Beuchat & Golden, 1989). Las “defensas químicas” cuya función principal es proteger a la planta contra losherbívoros o las enfermedades son agrupadas bajo el término metabolitos secundarios. Enla tabla 1 se pueden observar algunos ejemplos de compuestos con actividadantimicrobiana producidos por plantas y descriptos por Duke (1985). Si bien se ha estimado que las plantas sintetizan cientos de miles de diferentescompuestos metabólicos secundarios y que todos los días son reportados otros nuevos, selos ha agrupado en cinco clases de acuerdo a la estructura química o según la forma en quela planta los produce. Los grupos más comunes son: 4
  • Introducción• Alcaloides: compuestos cíclicos que contienen nitrógeno. Están distribuidos extensamente entre muchas familias de plantas superiores, donde a menudo son producidos en las raíces (figura 1a). Su actividad en animales es diversa, pero muchos intervienen como neurotransmisores. Numerosos alcaloides son adictivos (Kutchan, 1995).• Glucósidos cianogenéticos: Son substancias orgánicas, tambien conocidas como heterósidos cianogenéticos, principios activos de diferentes familias botánicas (Rosaceae, Linaceae, Fabaceae, Euphorbiaceae, etc.). Químicamente, corresponden a estructuras heterosídicas: su genina, que biogenéticamente deriva de aminoácidos como fenilalanina, tirosina, leucina, isoleucina y valina, suele ser un aldehído o una cetona, generalmente el benzaldehído o la acetona, unidos al ácido cianhídrico en forma de hidroxinitrilo. La molécula de azúcar reductor se fija por la función hidroxílica para formar el heterósido. Ciertas plantas y animales tienen enzimas que hidrolizan y separan el azúcar liberando el cianuro, éste actúa directamente sobre las mitocondrias inhibiendo la producción de energía.• Glucosinolatos: Comprenden un pequeño grupo de compuestos también llamados heterósidos sulfocianogenéticos o heterósidos azufrados, son glucósidos que contienen tanto N2 como azufre y se biosintetizan a partir de diversos aminoácidos, lo que da lugar a diferentes estructuras químicas (figura 1c). Su distribución es limitada, se encuentran principalmente en la familia de las crucíferas (Brassicaceae), a las que proporcionan el olor y sabor característico.• Compuestos fenólicos: Definidos químicamente como anillos bencénicos con uno o más grupos hidroxilo, existen más de veinticinco mil estructuras llamadas fenólicas, muchas de las cuales son usados frecuentemente como conservantes por su acción antioxidante. En las plantas previenen la oxidación de las membranas y otros tipos de daños oxidativos. Como defensas, son de sabor desagradable, tóxicos e inhiben la digestión (figura 1b). Los colores azules y rojos de la mayoría de las flores son proporcionados por flavonoides, los robles y el té son ricos en polímeros fenólicos llamados taninos, el olor de la gaulteria es debido a un ácido fenólico (metilsalicilato). Ha sido demostrado que estos compuestos tienen efecto antimicrobiano (Toda et al., 1989) sobre un amplia gama de microorganismos, al parecer por su capacidad de acomplejar proteínas extracelulares y de la pared celular bacteriana. 5
  • Introducción• Terpenos: Es el segundo grupo más importante de compuestos secundarios. Son muy diversos en estructura y actividad, aunque todos surgen del isopreno. La mayoría son volátiles e imparten el olor típico a coníferas, mentas y muchas otras especies herbáceas y arbustivas. Los triterpenoides, un subgrupo, incluyen muchos compuestos extremadamente amargos, como la curcibitacina de las calabazas y pepinos.Tabla 1: Principales tipos de compuestos antimicrobianos provenientes de plantas Toxicidad Nombre vulgar Nombre científico Compuesto Clase Actividada relativab Aceite de oliva Olea europaea Hexanal Aldehído General ¿? Ajo Allium sativum Allicina , ajoeno Sulfóxido General ¿? Polifenoles Virus, bacterias, Cáscara sagrada Rhamnus prusiana Taninos Antraquinonas hongos 1.0 Cebolla Allium cepa Allicina Sulfoxido Bacteria, Candida ¿? S. aureus Chamomilla Matricaria chamomilla Ácido antémico Ácido fenólico Helmintos 2.3 Clavo Syzygium aromaticum Eugenol Terpeno General 1.7 Eucaliptus Eucalyptus globulus Taninos Polifenoles Bacterias, virus 1.5 E. coli, Sporothrix, Ginseng Panax notoginseng Saponinas Staphylococcus, 2.7 Trichophyton Henna Lawsonia inermes Ácido gálico Ácido fenólico S. aureus 1.5 S. aureus, M. Liquoriza Glycyrrhiza glabra Glabrol Alcohol fenólico tuberculosis 2.0 Quinina Cinchona sp. .Quinina Alkaloide Plasmodium spp. 2.0 Te verde Camellia sinensis Catequinas Flavonoides General 2.0 Terpenos, alcoholes Ácido cafeico, timol, Virus, bacterias, Tomillos Thymus vulgaris taninos fenólico, hongos 2.5 polifenoles Valeriana Valeriana officinalis Aceite esencial Terpenos General 2.7 Cowan, 1999.a- “General” hace referencia a actividad sobre una multiplicidad de microorganismos: bacterias, hongos y protozoarios.b- 0 altamente seguro, 3 altamente tóxico”. El potencial y más extendido uso de muchos de estos antimicrobianos naturalesparece promisorio dada la demanda de los consumidores. Sin embargo, el reto es aislar,purificar, estabilizar e incorporar estos compuestos a los alimentos sin afectaradversamente la calidad sensorial y las características de seguridad de los productos(Beuchat y Golden, 1989). Además, la bioactividad de estos compuestos puede variardependiendo de la especie o hierba, tipo de microorganismo presente y alimentoinvolucrado (Giese, 1994). La actividad antimicrobiana de las especies y plantas se atribuyegeneralmente a compuestos fenólicos presentes en los extractos o aceites esenciales de lasmismas (Nychas, 1995; Shelef, 1983) y se reconoce que factores como contenido de grasa,poteínas, sales, el pH y la temperatura afectan la bioactividad de los compuestos fenólicos(Nychas, 1995; Tassou & Nychas, 1994). Entre los productos naturales más estudiados se 6
  • Introducciónencuentran los presentes en plantas, hierbas y especias y dentro de éstos los AEs de plantasaromáticas.a) Coniina Morfina Atropina Alcaloide piperidinico Alcaloide isoquinolico Alcaloide tropano Conium maculatum Papaver somniferum Hyoscyamus níger Atropa belladona Ácido cafeico Ácido fenólico Hipericina Apigenina Coffea canephora Quinonas Flavonesb) Hypericum perforatum Matricaria chamomilla Glucobrasicina Estructura básica Desulfoglucosinolatos de los Brassica olerucea glucosinolatosc)Figura 1: Estructura química de algunos compuestos con actividad antimicrobiana: a) Compuestos delgrupo de los alcaloides, b) diferentes compuestos del grupo de los flavonoides y c) compuestos del grupo delos glucosinolatos 7
  • Introducción1.3. Composición de los AEs Químicamente los AEs consisten en gran medida en mezclas de compuestossencillos llamados terpenos. La palabra terpeno deriva del nombre alemán de la esencia detrementina: terpentin. Existe una gran diversidad de AEs como las plantas que losproducen; en la tabla 2 se muestran algunas de los más conocidos, el lugar de origen de laplanta y el método de extracción más frecuente (Hili et al., 1997). Se han llegado a identificar en un AE hasta 300 componentes. Las plantas producenmayor cantidad de terpenoides que los animales y los microbios. La producción,acumulación, emisión y/o secreción de grandes cantidades de ellos depende de la presenciade estructuras anatómicas altamente especializadas (Croteau et al., 2000). Katayama y Nagai (1960) reconocieron a los compuestos activos de algunos aceitesesenciales como eugenol, carvacrol, timol y vainillina. Se ha reportado que algunos deestos compuestos fenólicos tienen un amplio espectro de efectividad contra losmicroorganismos, como el timol extraído del tomillo y del orégano, el aldehido cinámicoextraído de la canela y el eugenol extraído del clavo de olor.Tabla 2: Fuentes botánicas y geográficas de los AEs Método de Aceite Especie Parte de la planta País de origen extracción Anis Illicium verum Fruto China Arrastre de vapor Basil Ocimun basilicum Hierba India Arrastre de vapor Bergamota Citrus bergamia Cáscara Costa de Ivory Prensado Cardamomo Elettaria cardamomum Fruto Guatemala Arrastre de vapor Cilantro Couianrum sativum Fruto Rusia Arrastre de vapor Geranio Pelargonium graveolens Hierba Egipto Arrastre de vapor Jazmín Jasminiun oficinales Flores Marruecos Extracción con solvente Lavanda Lavendula hybrida Flores Francia Arrastre de vapor Pasto limón Cymbopogon citratus Hierba Nepal Arrastre de vapor Mejorana Thymus mastichina Hierba España Arrastre de vapor Patchouli Pogostemon patchouli Hojas EUA Arrastre de vapor Menta Mentha piperita Hierba India Arrastre de vapor Sándalo Santalum album Madera India Arrastre de vapor Tagettes Tagettes glandulífera Hierba Nepal Arrastre de vapor Árbol de te Malaleuca tenifolia Hojas Australia Arrastre de vapor Hili et al., 1997 En la figura 2a se observa el hemiterpeno isopreno que contiene cinco carbones(una unidad de isopreno C5H8), es un gas emitido en la atmósfera por muchas especies deplantas, donde juega un importante papel en la química del ozono. En el caso de los monoterpenos, éstos se subdividen a su vez en tres grupos:acíclicos, monocíclicos y bicíclicos. Un ejemplo de monoterpenos acílicos es el 8
  • Introducciónhidrocarburo mirceno que se encuentra en las esencias de las verbenáceas. El timol es elcaso de un compuesto cíclico fenólico y su isómero el carvacrol son los componentesprincipales de los tomillos y los oréganos.Otros ejemplos de monoterpenos cíclicos son elterpineol presente en el cedrón y el mentol (figura 2b) que es característico de algunasmentas (Zygadlo et al., 1994, 1995a; IPGRI, 1996). Los terpenos bicíclicos se pueden dividir a su vez en tres clases, según el tamañodel segundo anillo, siendo el primero siempre de seis carbonos. La α-tujona es el caso de 6+ 3, los pinenos presentes en las esencia de trementina tienen la conformación 6 + 4,mientras que el alcanfor se caracteriza por un anillo de 6 + 5 (figura 2c). Isopreno citronelol a) (monoterpeno) ß-mirceno Timol Carvacrol α-terpineol Mentol b) c) tujona Pineno Alcanfor Figura 2: Estructuras químicas de diferentes terpenos de acuerdo al número de carbonos y a su conformación espacial. a) unidad isopreno y el monoterpeno citronelol, b) monoterpenos acíclicos y cíclicos. c) terpenos bicíclicos. 9
  • Introducción1.4. Las micotoxinas: Hongos productores, y su incidencia en alimentos. Las micotoxinas son un grupo de sustancias con estructuras químicas muy diversas,formadas durante el metabolismo de hongos toxicogénicos. La biosíntesis de estoscompuestos ocurre fundamentalmente cuando el desarrollo del micelio se ha detenidodurante la fase estacionaria de crecimiento, y existe limitación de algunos nutrientes, enpresencia de un exceso de fuentes carbonadas disponibles (Sorenson, 1993). Estas toxinasson clasificadas como metabolitos secundarios, debido a que carecen en su mayoría defunciones conocidas para la fisiología del hongo que las produce. Actualmente se cree que estos compuestos podrían tener diferentes funciones en lasupervivencia de los hongos que les dio origen, inhibiendo el crecimiento de otrosmicroorganismos, participando como agentes que favorecen la simbiosis con plantas, oactuando como hormonas sexuales o factores inductores de diferenciación (Demain &Fang, 2000). Recientemente se han identificado relaciones genéticas entre la esporulación yla producción de micotoxinas (Calvo et al., 2002; Shim & Woloshuk, 2001). Algunosmetabolitos secundarios, incluyendo los antibióticos, estimulan la formación de esporas,las protegen en el medio ambiente y pueden favorecer o inhibir su germinación (Demain &Fang, 2000). Esta observación hace pensar en la posible relación beneficiosa para el hongo,entre la esporulación y el metabolismo secundario. Este último podría favorecer ladiseminación y supervivencia del micelio, proporcionando un mecanismo mediante el cualse reprima la germinación de esporas, cuando no existen condiciones ambientalesfavorables para su desarrollo. Aproximadamente cuatrocientas micotoxinas han sido aisladas y caracterizadasquímicamente hasta el presente, producidas fundamentalmente por especies de cuatrogéneros fúngicos: Aspergillus, Fusarium, Penicillium, y Alternaria (Etzel, 2002). A pesarde esto, no todas las especies incluídas dentro de estos géneros tienen la capacidad parasintetizarlas y, por otro lado, dentro de un género y especie fúngica productora demicotoxinas, puede haber cepas que presenten diferente capacidad toxicogénica (Magnoliet al., 1998; Magnoli et al., 1999). Estos hongos filamentosos son clasificados comoambientales, y algunos de ellos pueden comportarse como endofitos, e infectartempranamente a los cereales durante su cultivo en el campo. Debido a su diversidadquímica, las micotoxinas pueden disolverse en las fases lipídicas (fundamentalmente) oacuosas de los alimentos, y difundir al interior de ellos (Hussein & Brasel, 2001; Pitt,2000). En consecuencia, estas toxinas pueden ser encontradas principalmente en cereales, 10
  • Introducciónsemillas, frutas, y alimentos elaborados en base a estas materias primas; aún cuando enellos no se encuentren elementos fúngicos. El maíz (Zea mays L.) es uno de los cereales que durante su cultivo puede serafectado por un grupo considerable de enfermedades producidas por hongos, virus obacterias, presentándose cada año con diferente severidad, dependiendo de las condicionesambientales y del cultivar considerado (León, 1984). Si se tienen en cuenta solamente las enfermedades producidas por hongos, el vuelcopor podredumbres de la raíz, tallo, y espiga; pueden afectar la calidad del grano por laacumulación de micotoxinas (aflatoxinas, fumonisinas, tricotecenos, zearalenona, etc). Losprincipales hongos responsables de estas afecciones son: Diplodia maydis, D. macrospora,Fusarium avenaceum, F. verticillioides, Gibberella spp., Phytium aphanidermatum, yMacrophomina phaseolina (United States Department of Agriculture, 1980). Además, laspodredumbres del almacenamiento pueden desarrollarse en la espiga o en el maíz pos-cosecha, y fundamentalmente son producidas por especies de Aspergillus niger, A. flavus,A. parasiticus, y A. ochraceus; y por algunas especies de Penicillium, las que se presentansolas o en combinación con otras especies, principalmente del género Fusarium spp. Lainfección por estos hongos se puede producir en el campo durante las últimas etapas delcultivo, o durante el almacenamiento (León, 1984; Resnik et al., 1995; United StatesDepartment of Agriculture, 1980). Una vez recolectado y acondicionado, el grano de maíz puede ser utilizado condiferentes fines. Una parte de la producción se destina a satisfacer la demanda del mercadointernacional, y el remanente se consume en el mercado interno. Durante los últimos años,nuestro país presentó una tendencia a adquirir el perfil de exportador, debido al notablecrecimiento de la producción, y del escaso incremento del consumo interno, generándoseuna disponibilidad de mayores saldos exportables. En la última década Argentina exportóprácticamente el 50% del volumen total del maíz producido (García & Della Valle, 2003). Según datos proporcionados por el Instituto Nacional de Estadística y Censos, laproducción total de cereales en nuestro país creció en los últimos años un 57,5%; conrespecto a datos de la campaña 1995-1996, cosechándose en el 2001 un total de 34.852.000toneladas, y constituyendo el maíz un 45% del total de cereales producidos (INDEC, 2004).El incremento en la producción de cereales en Argentina se evidencia, además, al analizarla participación de nuestro país en el mercado mundial de cereales, pasando de un 2% a 11
  • Introduccióncomienzos de la década del noventa, a un 12,3% del total comercializado mundialmentedurante la campaña 1997-1998. Por otra parte, el maíz destinado al mercado interno puede ser utilizado para losdiferentes tipos de molienda, como simiente, para el consumo humano o animal, todos bajola forma de grano; y para la constitución de reservas forrajeras, es decir silaje (García &Della Valle, 2003). La población o el consumidor es cada día más exigente respecto de la calidad de losalimentos elaborados, y en el orden internacional los países importadores interponennuevas barreras al ingreso de mercaderías, reduciendo los índices de tolerancia desustancias que contaminan el grano y los subproductos de su industrialización, tales comolas micotoxinas, insectos y agroquímicos. Las concentraciones de toxinas fúngicas en loscereales están íntimamente relacionadas con las fluctuaciones de precios en los mercadosinterno y externo. La especulación sobre la cotización de cereales, y del maíz en particular,está normalmente asociada a largos tiempos de almacenamiento de los mismos, utilizandogeneralmente infraestructura inadecuada. En consecuencia, el maíz puede sufrir infeccionesadicionales con hongos ambientales micotoxicogénicos, aumentando de manera importantesus niveles de micotoxinas, con respecto a las concentraciones existentes inmediatamentedespués de la cosecha (Munkvold, 2003). En Argentina existe escasa reglamentación actualizada sobre los límites máximospermitidos de micotoxinas en alimentos para el consumo humano o de animales. Actualmente algunas disposiciones internacionales regulan estrictamente los nivelespermitidos de estos contaminantes, afectando directamente el comercio internacional y, porlo tanto, a productores y proveedores (Jukes, 2004; Resnik et al., 1995). Desde el punto de vista toxicológico, la infecciones del maíz por Aspergillus spp. yFusarium spp., adquieren la mayor importancia en la salud humana y animal (Peraica et al.,1999).1.5. Los géneros Aspergillus y Fusarium: Micotoxinas sintetizadas por estos hongos. El género Aspergillus fue descripto por primera vez hace aproximadamente 300años. Es extremadamente común en productos almacenados en regiones tropicales ysubtropicales, principalmente granos, nueces y especias; como agente que participa en sudescomposición (Hocking, 1997). 12
  • Introducción Aspergillus flavus está ampliamente distribuido en la naturaleza, puede sintetizaraflatoxina B1 (AFB1) (figura 3a), aflatoxina B2 (AFB2), y ácido ciclopiazónico; perosolamente una proporción de 30-40% de las cepas aisladas, son toxicogénicas (Abarca etal., 2000). A. parasiticus sintetiza AFB1, AFB2, aflatoxina G1 (AFG1) y aflatoxina G2(AFG2). Su distribución a nivel mundial está más limitada, aunque el porcentaje deaislamientos de A. parasiticus aflatoxicogénicos es muy elevado (Hocking, 1997). De acuerdo a Nelson et al. (1983), el género Fusarium se agrupa en 12 secciones.Las especies toxicogénicas más comunmente encontradas en alimentos están incluídas enlas secciones Liseola (F. verticillioides, F. proliferatum, F. nygamai y F. subglutinans),Sporotrichiella (F. sporotrichioides y F. poae), Gibbosum (F. equiseti), y Discolor (F.graminearum y F. culmorum) (Bullerman, 1997). Gibberella fujikuroi (Sawada) es elteleomorfo de muchas de las especies de anamorfos conidiales en el género Fusariumsección Liseola, incluyendo F. verticillioides (Sacc.) Niremberg (ex F. moniliformeSheldon), F. subglutinans (Wollenweber y Reinking) Nelson, Toussoun y Marasas; y F.proliferatum (Matsushima) Niremberg (Nelson et al., 1983). Según el concepto de especiesbiológicas, F. verticillioides y F. proliferatum pertenecen a las poblaciones deapareamiento A y D, respectivamente. Aunque F. verticillioides y F. proliferatum son los principales productores defumonisinas, existen especies dentro de Liseola u otras secciones que también puedensintetizarlas, pero en menor grado. Hasta la actualidad se han descripto por lo menos 14fumonisinas, las que han sido clasificadas en grupos A, B, C, P y H (JECFA, 2001), siendola fumonisina B1 (FB1) (figura 3b) la más importante por su incidencia en alimentos, y porlos efectos tóxicos producidos en animales y humanos. a) b) Figura 3: Estructuras químicas de AFB1 (a) y de FB1 (b). 13
  • Introducción Teniendo en cuenta las diferentes infecciones fúngicas que puede sufrir el maízdurante su cultivo y almacenamiento, la coinfección por Aspergillus spp. y Fusarium spp.y, consecuentemente, la existencia simultánea de AFB1 y FB1, puede ser una situacióncomún en el maíz destinado al consumo humano y animal.1.6. Las micotoxicosis. Las micotoxinas presentan un amplio rango de toxicidad, relacionadoprincipalmente con la actividad que tienen estos compuestos por sí mismos, la vía deadministración, el tiempo de exposición, el sexo, la cepa y la edad de la especie animalafectada (Hengstler et al., 1999). Cuando estas toxinas ingresan al organismo de losanimales y humanos se inducen micotoxicosis agudas, subcrónicas, o crónicas; según ladosis y el tiempo de exposición a estos compuestos. Las primeras se producen cuando altasdosis de micotoxinas ingresan al organismo en un lapso de unas pocas horas, pudiendocausar la muerte del individuo. En la actualidad raramente se registran casos demicotoxicosis agudas en humanos por el consumo de alimentos contaminados con nivelesaltos de micotoxinas, encontrándose casos fundamentalmente en algunos países endesarrollo. Por el contrario, frecuentemente se observan síntomas de intoxicación agudaluego de la administración terapéutica de alcaloides del ergot (Etzel, 2002). Los otros tiposde intoxicación, en los que ingresan al organismo cantidades menores de toxinas duranteunos pocos meses (subcrónicas) o por varios meses o años (crónicas), representan elmayor problema para la salud humana y animal en el mundo. Es posible que lasmicotoxinas presentes en los alimentos, sean responsables de más muertes humanas que losmicroorganismos transmitidos a través de estos (Pitt, 2000). Entre los primeros datos de intoxicación humana por micotoxinas se encuentran losbrotes agudos de ergotismo causados por alcaloides ergóticos del hongo Clavicepspurpurea, que alcanzaron proporciones de epidemia, conocida como “el fuego de SanAntonio”, mutilando y causando la muerte a miles de personas en Europa, durante la EdadMedia. Las víctimas estaban expuestas a la dietilamida del ácido lisérgico (LSD), sustanciaalucinógena que se producía durante el horneado del pan elaborado con trigo contaminadopor el cornezuelo del centeno (Peraica et al., 1999). La acción letal de algunos de estosmetabolitos secundarios hizo que sean utilizados con fines de bioterrorismo. Uno de losprimeros usos de las micotoxinas como armas biológicas se registró en el siglo VI aC, 14
  • Introduccióndonde los Asirios envenenaban a sus enemigos con centeno contaminado con ergot (Etzel,2002). En lo que respecta a salud y producción animal, el interés general por lasmicotoxinas aumentó en 1960, cuando se declaró en animales de granja en Inglaterra unamicotoxicosis aguda transmitida por el pienso, denominada enfermedad X de los pavos,comprobándose posteriormente que era causada por las aflatoxinas (Peraica et al., 1999). Conjuntamente con el consumo de tabaco, la dieta es probablemente uno de losfactores más importantes en la etiología del cáncer humano (Ferguson, 2002), siendovehículo de una amplia variedad de carcinógenos químicos genotóxicos o epigenéticos.Estos carcinógenos químicos pueden tener acción directa, ejerciendo el efecto tóxico sinsufrir previamente biotransformaciones, o comportarse como pro-carcinógenos, los cualesson bioactivados en el organismo mediante reacciones "detoxificantes". En el caso de pro-carcinógenos que ingresan por vía oral, la bioactivación ocurre fundamentalmente enhígado, siendo éste el principal órgano blanco de acción (deBethizy & Hayes, 2001). El cáncer, segunda causa de muerte en la actualidad en los países desarrollados, esun grupo de enfermedades de origen multigénico y multifactorial; resultado de dosprocesos sucesivos: el aumento descontrolado de la proliferación de un grupo de célulasque da lugar a un tumor o neoplasia; y la posterior adquisición de capacidad invasiva, queles permite la diseminación en el organismo y la formación de metástasis (Lodish et al.,2001).1.7. Mecanismos de acción tóxica de fumonisina B1 en humanos y animales. Las fumonisinas, descriptas por primera vez en 1988 (Bezuidenhout et al., 1988),son un grupo de al menos 14 amino-polialcoholes formados esencialmente por una cadenaalifática de 20 carbonos con dos cadenas laterales hidrofílicas unidas mediante enlaces tipoéster. En maíz, la biosíntesis ocurre luego de la infección del grano por cepastoxicogénicas, principalmente en la fase tardía de madurez en el campo, cuando los granostodavía tienen altas actividades de agua. Con menor importancia, las fumonisinas puedenencontrarse en otros alimentos como sorgo, espárragos y arroz. Si existen condicionesdesfavorables de almacenamiento, luego de la cosecha pueden incrementarseconsiderablemente los niveles de estas micotoxinas (JECFA, 2001). Las fumonisinas estánampliamente distribuidas en la naturaleza, siendo la FB1 considerada como la más 15
  • Introducciónabundante y la más tóxica de las fumonisinas (Thiel et al., 1992). Las concentraciones deesta toxina en maíz pueden variar desde unas pocas ppb, hasta niveles alrededor de 160ppm (Chu & Li, 1994; Shephard et al., 1996). La estabilidad de FB1 durante el procesamiento de los alimentos es afectada porvarios factores, incluyendo la humedad del producto, la concentración y localización de latoxina, la presencia de aditivos, y el tipo de matriz del alimento (Jackson & Bullerman,1999). Las fumonisinas son muy estables al calor, ocurriendo destrucción significativa deestas toxinas cuando se alcanzan temperaturas superiores a 150 °C, aunque la eficiencia delproceso disminuye a medida que se utilizan mayores tiempos de calentamiento (JECFA,2001). Los estudios realizados hasta el presente sugieren que FB1 no es genotóxica, perotiene una importante acción promotora de cáncer hepático, según se ha demostrado por lainducción de focos γ-glutamil transpeptidasa y GST positivos en hígado de ratas (Voss etal., 2002). En 1993 la Agencia Internacional para la Investigación en Cáncer ha clasificadoa las fumonisinas como compuestos probablemente carcinogénicos para humanos (Grupo2B) (IARC, 1993b). En ratas y en otros animales utilizados en investigación, cuando FB1 ingresa por víaoral, aproximadamente un 4% de la dosis administrada es absorbida en intestino. Luego sedistribuye a la mayoría de los tejidos desapareciendo rápidamente del plasma, yeliminándose del organismo de acuerdo a un modelo bi o tricompartamental (Martinez-Larranaga et al., 1999). La proporción del gasto cardíaco que recibe cada órgano tiene unaimportancia fundamental cuando se pretende entender por qué hígado y riñón son losprincipales blancos de acción de FB1. Estos dos órganos retienen la mayoría de la toxinaabsorbida (Martinez-Larranaga et al., 1999), siendo en algunos casos más importante laretención en hígado, y en otras situaciones se acumula principalmente en riñón. No existenevidencias, tanto en estudios in vitro como in vivo, de que FB1 sea metabolizada. Lamicotoxina absorbida es posteriormente excretada por bilis. Cuando llega a intestino eshidrolizada posiblemente por enzimas microbianas, perdiendo uno o ambos ácidostricarboxílicos laterales; encontrándose en materia fecal la toxina y los productos de lahidrólisis. Mientras que no existen evidencias de que FB1 sea metabolizada por el complejocitocromos p, algunos estudios in vivo e in vitro han demostrado que esta micotoxina puedemodificar la actividad de este complejo enzimático (Spotti et al., 2000). 16
  • Introducción Para explicar los efectos tóxicos de FB1 en animales se han propuesto variosmecanismos, dos de los cuales cuentan con mayor respaldo de evidencia experimental, y esposible que estén estrechamente relacionados. En uno de ellos, la FB1 produce la inhibiciónde la ceramida sintetasa, una enzima clave en el metabolismo de los esfingolípidos. En elotro mecanismo, una variación en las proporciones de ácidos grasos y fosfolípidoscelulares induciría cambios en la síntesis de eicosanoides, prostaglandinas, leucotrienos yotros derivados oxigenados. La disrupción del metabolismo de esfingolípidos produce desbalances en elcontenido de fosfoglicerolípidos, ácidos grasos y colesterol. Según estas hipótesis FB1causa directa o indirectamente, un espectro amplio de cambios en el metabolismo lipídico yen las vías bioquímicas de las células. Ambas situaciones tienen como consecuenciaalteraciones en la señalización mediada por lípidos, y en reacciones metabólicasimportantes para el crecimiento, diferenciación y muerte celular. (Mobio et al., 2000;Pinelli et al., 1999). Fumonisina B1 posee similitud estructural con algunos sustratos de ceramidasintetasa, produciendo inhibición competitiva de la enzima. La esfinganina (Sa), una baseesfingoide formada durante la síntesis de novo de esfingolípidos, y la esfingosina (So)producida durante el reciclaje fisiológico de esfingolípidos celulares; son los sustratosnaturales de la enzima ceramida sintetasa (JECFA, 2001). Tanto en estudios in vivo comoin vitro, se observó que la inhibición de esta actividad enzimática por acción de FB1 tienecomo consecuencia un incremento rápido de las concentraciones intracelulares de Sa y, enmenor grado, de So (IPCS, 2000). Este aumento en los niveles de Sa produce una inversiónen la relación Sa/So intracelular, que puede ser detectada en sangre periférica y orina,debido a que Sa puede difundir libremente a través de la membrana plasmática. En estesentido, se ha estado evaluando la posibilidad de utilizar la relación Sa/So presente endiferentes muestras biológicas como biomarcador de exposición a fumonisinas (Qiu & Liu,2001). La respuesta a la exposición a FB1 depende del tipo celular afectado, persistiendopor más tiempo el desbalance lipídico en hepatocitos y en células renales (IPCS, 2000). Wang et al. (1999) realizaron un aporte muy importante para la micotoxicología delas fumonisinas. En un modelo experimental en ratas observaron que, luego de inducirse eldesbalance de lípidos celulares con una dosis de FB1, niveles diez veces inferiores fueronsuficientes para sostener este efecto en el tiempo. En otras palabras, los efectos tóxicos que 17
  • Introducciónpuede tener un alimento que contiene bajas concentraciones de FB1, pueden sersubestimados si quienes los consumen han estado previamente expuestos a mayorescantidades de esta micotoxina. Aunque existen áreas geográficas donde la exposición humana a fumonisinas esmuy elevada, no hay constancia confirmada de una toxicidad aguda por estas toxinas enseres humanos (JECFA, 2001), y no se ha podido determinar su dosis letal en animales deexperimentación. Las fumonisinas han sido descubiertas por los efectos crónicos inducidos enanimales de granja. Las primeras publicaciones referidas a FB1 fueron realizadas porinvestigadores sudafricanos en 1988, que aislaron y caracterizaron la toxina a partir de F.verticillioides MRC 826 (Bezuidenhout et al., 1988; Gelderblom et al., 1988). Durante losaños siguientes se pudo confirmar que estas micotoxinas eran las responsables de laleucoencefalomalacia equina (Marasas et al., 1988), que ya había sido descripta por Butleren 1902, y del Síndrome de edema pulmonar que produjo la muerte de miles de cerdos enEE.UU. en 1989. Además, en modelos experimentales en animales, la intoxicación conFB1 indujo alteraciones en los parámetros nutricionales de cerdos y de ratas (Casado et al.,2001; Dilkin et al., 2003). Sydenham et al. (1990) observaron una relación directa entre la exposición a altosniveles de FB1 y una mayor incidencia de cáncer de esófago en la población de Transkei,Sudáfrica. Observaciones similares fueron realizadas por Chu y Li (1994) en China, y porDoko y Visconti (1994) en Italia. Los resultados epidemiológicos en los últimos añosparecen reforzar este concepto, pero en la actualidad no se conoce exactamente de quémanera FB1 participa en la instalación de los procesos neoplásicos.1.8. Bioactividad de compuestos de origen vegetal sobre la toxicogénesis de algunascepas fúngicas. Más de 1340 plantas son conocidas por ser fuente potencial de compuestosantimicrobianos, pero pocas han sido estudiadas científicamente (Wilkins & Board, 1989).Algunos autores han examinado los efectos de los compuestos aislados de AEs de plantasaromáticas sobre cultivos fúngicos para encontrar fungicidas naturales. Un númeroimportante de los constituyentes de estos AEs ha demostrado tener capacidad inhibitoriasobre el desarrollo de las cepas fúngicas (Chao & Young, 2000). Aparentemente existiríauna relación directa entre la estructura química del componente más abundante en el AE y 18
  • Introducciónsus efectos antifúngicos. Generalmente la capacidad inhibitoria del AE podría ser atribuídaa la presencia de un núcleo aromático, conteniendo un grupo polar funcional (Farag et al.,1989). Alrededor de 30.000 compuestos aislados de AEs de plantas aromáticas contienengrupos fenólicos y éstos compuestos son los más utilizados por la industria de losalimentos (Meeker & Linke, 1988). De los AEs mencionados anteriormente, un númerosignificativo de publicaciones ha documentado la actividad antimicrobiana del AE de pastolimón, palo rosa, canela, clavo de olor y orégano sobre diferentes especies microbianas.Mishra & Dubey (1994) informaron que el AE de pasto limón (Cimbopogon citratus) actuócomo un fungistático efectivo sobre 47 cepas de hongos filamentosos, además estos autoresdescriben que los efectos de este AE sobre Aspergillus flavus son, en algunos casossuperiores a fungicidas de síntesis comerciales como el Agrosan, oxicloruro cúprico etc.También en A. flavus, se demostró el efecto inhibitorio sobre el crecimiento y laproducción de aflatoxinas de los AE de clavo (Syzygium aromaticum) y la canela(Cinnamomum zeylanicum) (Bullerman et al., 1977; Montes-Belmont & Carvajal, 1998;Sinha et al., 1993). La actividad inhibitoria del AE de orégano (Origanum vulgare) sobre elcrecimiento de A. flavus, A. ochraceus y A. niger ha sido evaluada previamente por Pasteret al (1995) demostrando resultados significativo sobre el crecimiento y la toxicogénesis.Soliman & Badea (2002) reportaron la actividad antifúncia y antitoxicogénica del AE detomillo (40% de timol) sobre A. flavus, A. parasiticus, A. ochraceus y F. verticillioides. Engeneral varios autores concuerdan en que las concentraciones utilizadas para detener eldesarrollo fúngico en un sustrato como las semillas almacenadas, son relativamente altas yque deberían desarrollarse experimentos con el objetivo de encontrar la dosis óptima paralas especies fúngicas que contaminan una especie de cereal en particular. También existecoincidencia en que los componentes minoritarios de los AEs juegan un rol importante enla bioactividad sobre los microorganismos y sobre la estabilidad de los AEs. 19