18 regolazione eucarioti
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    18 regolazione eucarioti 18 regolazione eucarioti Presentation Transcript

    • Capitolo 18La regolazione dell’espressionegenica negli eucariotiPeter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.Ahttp://web.unife.it/progetti/genetica/Guido/index.php?lng=it&p=4
    • Domande 181. Ancora più che nei procarioti, negli Eucarioti molti genidevono rispondere (attivandosi o disattivandosi) e inmodo coordinato a variazioni ambientali: come vieneregolata l’espressione genica?2. Cosa succede ai geni che, in certi tessuti, non siesprimono mai?3. A che livelli può essere controllata l’espressionegenica?4. Che cosa sono i piccoli RNA, e che ruolo hanno nelcontrollo dell’espressione genica?
    • Figura 18.1Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.ANegli Eucarioti l’espressionegenica può essere controllata amolti livelli1234 56
    • Il controllo della trascrizione puòessere positivo o negativo
    • Meccanismi dicontrollo a livellodi inizio dellatrascrizione
    • Regolazione della trascrizione negliEucariotiA: Fattori trascrizionali (proteine)Operano in trans: sono molecole diffusibili1.Fattori generali di trascrizione o GTFSi legano al promotore  bassi livelli di trascrizione2.AttivatoriSi legano al DNA. Due domini: di legame e di attivazione alti livelli di trascrizione3. CoattivatoriSi legano ai GTF o agli attivatori  alti livelli di trascrizione4.RepressoriSi legano al DNA. Due domini: di legame e di repressioneMai legati a siti analoghi all’operatore  inibizione della trascrizione5. CorepressoriSi legano ai GTF o agli attivatori  inibizione della trascrizione
    • B: Sequenze regolatrici (siti del DNA)Attive solo in cis: sono siti del DNAPromotori (vicini), enhancer, silencer (lontani)Gli elementi del promotore hanno un ruolo nel determinare se avvieneo meno trascrizione al geneGli enhancer e i silencers determinano, legando specifiche proteineregolatrici, quanto alti saranno i livelli di trascrizione al geneN.B. Non c’è una proteina regolatrice per ogni gene (altrimenti, metàdel genoma produrrebbe proteine regolatrici per l’altra metà). Ognigene è regolato da uno specifico complesso di proteine regolatrici: lastessa proteina regolatrice regola, in combinazione con altre proteineregolatrici, la trascrizione di diversi geni
    • Figura 18.8Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A
    • Figura 18.2Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.ADominio C-Terminale della RNA P IIProteina che si lega al TATA-boxMeccanismo generaledi attivazione dellatrascrizione
    • Una malattia genetica: Intolleranza al lattosio(da Jobling et al, 2004)
    • FOETUSLow expressionINFANTHigh expressionADULTHigh expression“lactase persistence”ADULTLow expression“lactase non-persistence”Livelli di espressione della lattasi (LPH) a diversistadi di sviluppo (gene LCT)
    • Frequenza di individui in grado di digerire illatte (fenotipo persistenza della lattasi)
    • 1. Forti differenze fra popolazioni2. Conservato un lungo aplotipo ad alta frequenza
    • Enattah et al. Nature Genetics 30:233-237 (2002)Lattosio glucosio + galattosioLPHAnalisi del gene LCT (2q21) : nessuna variabilità associata all’intolleranza
    • Cromosoma 2Localizzazione dei siti regolatori che determinanola persistenza della lattasi
    • Regioni con la massima diversità aigeni per le proteine del latte bovineRegioni con la massima frequenza dipersistenza della lattasi
    • Figura 18.3Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.ADomini proteici che si legano al DNA
    • Tipico degli Homeo-box
    • Zinc-finger: struttura (C2H2)Ci sono zinc-fingers con struttura C4 (4 cisteine) e C6 (6 cisteine)
    • Zinc-finger: Il recettore dell’estrogeno, ERUn dimero di ER si inserisce nel solco maggiore del DNA,provocando l’apertura della doppia elica
    • Leucine-zipperDue eliche (Jun e Fos), tenute insieme da legamiidrofobici fra leucine
    • Figura 18.4Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.AEsempio 1: metabolismo del galattosio in lievitoCi sono tre geni strutturali adiacenti e due Upstream Activating Sequences (UASG)Questi geni non formano un operone, e hanno ciascuno il proprio promotoreCi sono inoltre, a distanza:GAL3: produce un enzima, Gal3p, che converte il galattosio in induttoreGAL4: gene regolatore; solo in assenza di glucosio produce il fattore di trascrizione Gal4pGAL80: gene repressore, il cui prodotto Gal80p, si lega a Gal4p e ne blocca l’attività
    • Figura 18.4Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.AEsempio 1: metabolismo del galattosio in lievitoIn assenza di glucosio, Gal4p forma dimeri che si legano alle UASG. Se però non c’ègalattosio, Gal80p si lega ai dimeri e impedisce loro di attivare la trascrizione
    • Figura 18.4Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.AEsempio 1: metabolismo del galattosio in lievitoIn assenza di glucosio e in presenza di galattosio, Gal3p converte il galattosio in uninduttore che si lega a Gal80p, permettendo così a Gal4p di attivare la trascrizione (NB indue direzioni diverse)
    • Figura 18.5Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.AEsempio 2: regolazione della trascrizione tramiteormoni steroideiSolo gli ormoni steroideientrano nella cellula eintervengono direttamentesul DNA, regolando latrascrizione
    • Figura 18.6Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.AGli ormoni steroidei si legano aspecifici SHR, SteroidHormone Receptors, e questocomplesso si lega allesequenze di regolazione deigeni controllati dall’ormoneEsempio 2: regolazione della trascrizione tramite ormonisteroideiER: recettore dell’estrogeno
    • Figura 18.7Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.AEsempio 2: regolazione della trascrizione tramite ormonisteroideiLe Chaperonine, fra cuiHsp90, sono normalmentelegate agli SHR, ma se nestaccano in presenza diormoni steroidei. Legato alrecettore, l’ormone entra nelnucleo, dove attiva latrascrizione.Tutti i geni-bersaglio regolatidallo stesso ormone hannouna sequenza di legame incomune.
    • RODOPSINAOPN1MELANOPSINAOPN4GLOBINA αHBAGLOBINA βHBBNo No Sì SìSì Sì No NoIn ciascun tessuto, alcuni geni nonvengono mai trascrittiCome avviene tutto ciò?
    • a. Ci sono enhancerstessuto-specifici
    • Figura 18.12Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.Ab. Geni inattivi sono metilatiContengono residui di 5-metil-citosinaIl contenuto di 5-metil-citosina è inversamente correlato al livello diespressione genicaSostituendo alla citosina un suo analogo non metilabile, la 5-azacitidina, siattivano geni normalmente inattivi
    • La metil-transferasi lega gruppi metilici allecitosine nei dinucleotidi CG; regioni del genomaricche di questi dinucleotidi si chiamano isole CpGRegioni metilate possono essere evidenziateperché la metilazione protegge dal taglio con MspIle sequenze bersaglio dell’enzima di restrizione,CCGGMetilazione dellacitosina nelle isole CpGdi mammifero
    • Il DNA non metilato scorre sul nucleosoma,rendendo disponibili promotore e siti diregolazione
    • Cromatina chiusa,cromatina apertaIl complesso SWI/SNF (switchsniff) è costituito da un numerovariabile di proteine (da 8 a 18)che allontanano i nucleosomi
    • La metilazione è una forma di cambiamento ereditabiledell’espressione genica, che non altera la sequenza delDNAUn altro esempio di fenomeno epigenetico è rappresentatodall’inattivazione del cromosoma X nei mammiferiFenomeni di questo tipo sono detti epigenetici.
    • Figura 18.14Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.ARegolazione a livello di maturazione dell’RNA: splicing alternativi
    • Lo strano caso delle petunieI fiori di petunia selvatici hanno coloreuniforme per l’espressione di un genecromosomico che codifica per il pigmento.Inserendo una seconda copia del gene,Jorgensen e colleghi contavano di ottenereuna colorazione più intensaLe petunie transgeniche così ottenute hannoinvece regioni non pigmentate; questofenomeno è stato chiamato co-soppressioneLa co-soppressione è dovuta all’intervento di corti RNA con funzione diregolazione, che inattivano entrambe le copie del gene per il pigemento: siaquella portata sul cromosoma, sia quella transgenica:Silenziamento genico
    • RNA interferenceLavorando su Caenorhabditis elegans, Fire e Mello dimostrano che gli mRNApossono essere distrutti da piccole molecole di RNA a doppia elica: miRNA(microRNA) e siRNA (short interfering RNA). (A. Fire et al., 1998, Nature391:806-811)miRNA e siRNA sono prodotti da tratti di genoma che non codificano perproteine.In natura, l’RNA interference porta al silenziamento genico, ed è utilizzatoda diversi organismi come difesa contro l’espressione di DNA virali
    • RNA interference
    • RNA interferenceNella regione UTR in 3’
    • Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.ARNA interference 1: miRNAI miRNA sono codificati da geni (oltre 500 nell’uomo) presenti nel genoma di tutti gliEucarioti multicellulari e di alcuni Eucarioti unicellulariI geni per i miRNA sono in parte localizzati nelle regioni intrageniche, e inparte all’interno di introniI miRNA vengono trascritti dalla RNA P II in un trascritto primario (Pre-miRNA o shRNA:Short Hairpin RNA) contenente un tratto di circa 70 nt che si ripiega a forcinaUn’endonucleasi (Drosha) taglia il Pre-miRNA lasciando un’estremità di 2ntsporgente all’estremo 3’
    • Figura 18.15Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.ARNA interference 2: miRNANel citoplasma, i Pre-miRNA vengono ulteriormente tagliati da un’endonucleasi, Dicer,formando filamenti in cui le due eliche sono imperfettamente appaiateDelle due eliche, una (filamento guida) diventerà il miRNA, l’altra (filamentopasseggero, o RNA*) noIl miRNA si lega con altre proteine (slicer o Ago1) formando un precursore delcomplesso miRISC (RNA Induced Silencing Complex)
    • Figura 18.15Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.ARNA interference 3: miRNAIl complesso miRISC matura grazie ad Ago1, che provoca il rilascio del filamentopasseggeroIl complesso miRISC riconosce l’mRNA bersaglio, vi si lega (nella 3’UTR) e ne provoca ladegradazione
    • RNA interference 4: siRNAI siRNA non sono codificati dal genoma nucleare, ma si originano come RNA a doppiaelica di 19-21 ntAttraverso passaggi analoghi a quelli visti permiRNA (ma Slicer è rappresentato da unaproteina diversa, Ago2) si forma un precursoredel complesso RISC, e poi un siRISCIl complesso siRISC riconosce l’mRNA bersaglio,vi si lega e ne provoca la degradazioneMa, se non sono codificati nel genoma, cheorigine hanno gli shRNA in questo caso?
    • RNA interference 5: siRNAFra le molecole di shRNA non codificate dal genoma nucleare ci sono gli intermedi direplicazione di genomi virali a RNA, o trascritti ad elica singola che contengonoinverted repeats e perciò possono ripiegarsi a forcinaI complessi siRISC riconoscono regionicomplementari negli RNA da cui sono derivati,e portano alla loro inattivazione: sonoconservati perché proteggono dall’infezionevirale
    • In sintesi
    • GENE 5’ UTR3’ UTRSITI REGOLATORImRNA 3’ UTR5’ UTR AAAAACi vogliono più fattori per iniziare la trascrizione di ogni geneCi vogliono più miRNA per silenziare ciascun mRNA
    • RNA interference: un filmhttp://www.nature.com/focus/rnai/animations/index.html
    • Controllo dell’espressione genica attraverso meccanismiche regolano il catabolismo di RNA e proteineLa degradazione degli mRNA può avvenire tramite meccanismi dipendentidall’adenilazione, cioè digerendo la coda di poliA fino a renderla non funzionale.Segue la rimozione del cap, dopo di che l’mRNA viene degradato a partiredall’estremità 5’.La degradazione degli mRNA può avvenire anche tramite meccanismiindipendenti dall’adenilazione, al momento non ben compresi.
    • Sintesi 181. Negli Eucarioti l’espressione genica può essere controllata a molti livelli2. Nella regolazione della trascrizione intervengono sequenze regolatrici amonte del gene (promotori, enhancers, silencers) e molecole diffusibili(fattori di trascrizione, attivatori, coattivatori, repressori, corepressori)3. Queste molecole sono proteine che stabiliscono contatti col DNA grazie adomini funzionali del tipo helix-turn-helix, zinc finger e leucine zipper4. In organismi complessi, molti geni sono disattivati tramite metilazione dellacitosina e altri fenomeni epigenetici5. Esistono varie forme di controllo post-trascrizionale, di cui il principalerichiede l’intervento di microRNA e siRNA: RNA interference6. L’RNA interference causa un silenziamento post-trascrizionale dei geni,attraverso un’accelerata degradazione dei loro messaggeri7. Ci sono infine meccanismi che regolano il catabolismo di RNA e proteine,agendo sulla loro velocità di degradazione
    • Looking for speech genesBishop (2002)In the portions of the genome that differ betweenchimpanzee and human, can we find a gene or genesthat are crucial for language?Speech genes?
    • Famiglia KE con una grave forma di dislessia(incapacità di sviluppare un discorso articolato)Mutazione nel gene FOXP2
    • Risonanza magnetica in membri della famiglia KE
    • Sequenza della proteina nei Primati e nel topo
    • Albero evolutivo di FOXP2Abbiamo trovato il gene per il linguaggio?
    • Gene expression comparisons
    • Looking for speech genes:gene expression comparisonsEnard et al. (2002)
    • We have largely the same genes as chimpanzees, and thesegenes do the same things in much of our bodies, but not in thebrain (Enard et al. 2002)Species-specific gene expression patterns: Largechanges in gene expression in the human brain.
    • We have largely the same genes as chimpanzees, and thesegenes do the same things in much of our bodies, but not in thetestis (Khaitovich et al. 2005)Species-specific gene expression patterns: Smallchanges in gene expression in the human brain.