08 genomica

Domande 8
In che modo possiamo isolare un tratto di DNA?
In che modo possiamo clonarlo, e perché occorre farlo?
Come si determina la sequenza di un tratto di DNA, o di un cromosoma, o di un intero genoma?
Come si identificano e come si descrivono i geni e le altre regioni importanti del genoma?

Studiare proteine e DNA comporta problemi tecnici differenti Si possono separare alleli proteici che differiscono perché più basici o più acidi, grazie alla loro diversa capacità di migrare in campo elettrico Ma tutto il DNA ha la stessa carica elettrica Con l’elettroforesi si possono solo separare frammenti di DNA di diversa grandezza (i più piccoli sono più mobili) È possibile trattare il DNA in modo da ottenere da tutte le cellule un frammento della stessa regione, e riconoscerlo?  Enzimi di restrizione

Sequenze palindrome riconosciute da diversi enzimi di restrizione

Risultati della digestione con diversi enzimi di restrizione del genoma mitocondriale di due specie di ape Melipona

Figura 8.4 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A
Si possono incorporare tratti di DNA
Eucariote in plasmidi batterici, o
vettori di clonaggio .
I vettori contengono:
Una sequenza ori;
Un marcatore (qui: amp R ) che consenta di seelzionare le cellule batteriche contenenti il vettore;
Uno o più siti unici di taglio per enzimi di restrizione, dove verrà incorporato il DNA Eucariote
Clonaggio del DNA in vettori plasmidici

Figura 8.5 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A La β galattosidasi, se integra e funzionante, scinde un analogo del galattosio presente sul terreno e provoca la colorazione in blu della colonia batterica Vettore di clonaggio pBluescript II Dimensioni < 15 kb

Banche genomiche Una banca genomica o library è un insieme di cloni che contiene, o si spera contenga, tutto il DNA di un cromosoma o di un genoma

Polymerase Chain Reaction (PCR): come ottenere tante copie dello stesso DNA Kary Mullis

La PCR produce, attraverso n cicli di denaturazione, annealing ed estensione, 2n copie della molecola di DNA

Figura 8.9 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A 1. Sequenziamento del DNA tramite estensione del primer Il DNA stampo viene denaturato, il primer si appaia alla sequenza complementare, presente in una sola delle eliche DNA stampo + primer + desossinucleotidi trifosfati + di desossinucleotidi trifosfati Frederick Sanger Premio Nobel 1958, 1980

Figura 8.10 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Quando sono incorporati nella nuova sequenza, i didesossinucleotidi impediscono che venga aggiunto un nuovo desossinucleotide, e interrompono la reazione Ciascun tipo di didesossinucleotide viene marcato con un fluorocromo che, se stimolato, emette luce a diversa λ

Figura 8.11 (a) Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Replicando molte copie (milioni) dello stesso tratto di DNA con una opportuna miscela (1/100) di didesossinucleotidi e desossinucleotidi, si ottengono frammenti in cui la reazione si è interrotta all’altezza di ogni posizione

Figura 8.11 (b)(c) Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Il sequenziatore automatico riconosce le λ delle fluorescenze associate ad ogni didesossinucleotide, e produce un grafico in cui il colore di ciascun picco indica la base nella sequenza

Riassumendo 1. Taglio con enzimi di restrizione. Il genoma, o un singolo cromosoma, o parte di un cromosoma, viene ridotto in piccoli frammenti 2. Clonaggio . I frammenti vengono trasferiti su vettori plasmidici o cromosomi artificiali, così creando una banca genomica 3. PCR. Vengono prodotte molte copie dei cloni di DNA da sequenziare 4. Sequenziamento. La sequenza dei nucleotidi di un’elica, o di tutte e due, viene determinata sintetizzando l’elica complementare e utilizzando didesossinucleotidi 5. Assemblaggio. Sequenze di cloni diversi si sovrappongono, e allineandole con metodi bioinformatici si ottengono sequenze più lunghe

Figura 8.9 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A 2. Pirosequenziamento del DNA tramite estensione del primer Il DNA stampo viene replicato; quando un nucleotide viene incorporato, si libera una molecola di pirofosfato che attiva gli enzimi e provoca il rilascio di una radiazione luminosa. La radiazione è correlata col nucleotide presente. DNA stampo legato a una microsfera + primer + solforilasi, luciferasi, apirasi; desossinucleotidi trifosfati aggiunti e rimossi ripetutamente uno alla volta

Con il sequenziamento a shotgun, si sequenziano i cloni di una library di BAC e li si allinea sfruttando le regioni di sovrapposizione Craig Venter

Allineando e confrontando più genomi si individuano polimorfismi di singolo nucleotide, o SNPs (Single-Nucleotide Polymorphisms)

Come si identificano i geni?
Metodi biomolecolari: Isolando gli mRNA, sintetizzando un’elica di DNA complementare con la trascrittasi inversa e poi sequenziando il DNA copia
Metodi bioinformatici: Cercando Open Reading Frames (ORF), cioè regioni che iniziano con un’AUG e terminano, dopo un numero di basi multiplo di 3, con un codone di stop

Sintesi 8
Gli enzimi di restrizione permettono di tagliare il DNA ottenendo da diverse cellule gli stessi frammenti
Le tecnologie del DNA ricombinante permettono di integrare tratti di DNA in vettori o cromosomi artificiali, da cui possono essere escissi
Si ottengono molte copie di un tratto di DNA attraverso la PCR
Esistono diverse tecniche per ottenere la sequenza di un frammento di DNA; le principali sono l’estensione del primer con l’uso di didesossinucleotidi e il pirosequenziamento
Se si fa in modo di ottenere cloni sovrapposti, il loro allineamento consente di ottenere sequenze via via più lunghe
Una volta ottenuta una sequenza più o meno completa, si può scegliere di caratterizzare solo alcuni siti noti per essere polimorfici, o SNP
Geni funzionali possono essere identificati con approcci biomolecolari (a partire dall’mRNA) o bioinformatici (individuando ORF)

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08 genomica

by Genetica, Ferrara University, Italy

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