Genetica 05
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Genetica 05 Genetica 05 Presentation Transcript

  • Cap. 5 Espressione genica: la trascrizione pp.115-143
  • Sintesi 05
    • La sintesi proteica avviene in due fasi, trascrizione e traduzione
    • Il DNA viene trascritto in una molecola di RNAm
    • Il messaggero viene tradotto in un peptide
    • Per la traduzione sono indispensabili RNAr ed RNAt
    • Sequenze particolari segnalano i punti di inizio e termine di trascrizione e traduzione
    • Esperimento di Chambon sull’ovoalbumina di pollo
    • Molti geni eucarioti sono interrotti da sequenze trascritte ma non tradotte: introni. Le parti tradotte prendono il nome di esoni
    • Negli Eucarioti il trascritto iniziale matura attraverso l’eliminazione degli introni e altre modifiche biochimiche.
  • Cellula pro- ed Eu-cariote
  • L’RNA è chimicamente simile al DNA, ma:
    • E’ a filamento singolo, non a doppia elica
    • Contiene ribosio, non desossiribosio
    • Oltre ad adenina, citosina e guanina, contiene non timina, ma uracile
    • Perciò:
    • Vale il principio della complementarietà delle basi: la molecola di RNA viene sintetizzata sulla base di un tratto di DNA
    • Esistono geni che codificano per proteine; dalla loro trascrizione origina l’RNAm; esistono geni che codificano per RNAt e l’RNAr.
  • Schema della trascrizione non
  • Schema della trascrizione
    • Nei procarioti, un’unica proteina complessa, l’RNA polimerasi o RNA P, catalizza la trascrizione
    • In E. coli, RNA P è costituita da 2 subunità  , 2 subunità  e una subunità  . La subunità  può dissociarsi, separandosi dal core o nucleo dell’enzima. Diversi fattori  indirizzano la RNA P verso geni diversi.
    • Schematicamente, tre fasi:
    • Inizio. I siti del DNA che contengono i segnali d’inizio della trascrizione si chiamano promotori. La subunità  riconosce una regione del promotore, a cui si attacca. La doppia elica si denatura e  si stacca dal core della RNA P.
  • Schema della trascrizione 2. Allungamento. Il core della RNA P comincia a scorrere lungo l’elica “senso” del DNA; ribonucleotidi trifosfati vengono legati all’estremità 3’ libera della catena; l’energia di legame proviene dalla rottura dei legami fosforici. 3. Terminazione. Sequenze di terminazione, o terminatori, sono presenti alla fine di ogni messaggero. In certi casi una proteina, fattore  , li riconosce, vi si lega e provoca il distacco dell’RNAm. In altri casi è la RNA P stessa che li riconosce e si stacca
  • Quindi, schematicamente, un gene comprende: Elica stampo
  • Promotori in vari geni di E. coli : TATA box e regione –35 (sequenze consenso)
  • Come la replicazione, la trascrizione procede in direzione 5’-3’
  • Trascrizione in E. coli : inizio ed allungamento
  • Trascrizione in E. coli : terminazione Inverted repeats
  • Le RNA polimerasi
    • Nei procarioti, una sola RNA P si occupa della trascrizione di tutti i geni
    • Negli Eucarioti, diverse RNA P catalizzano la sintesi di:
    • mRNA, che in seguito verrà tradotto in polipeptide ( RNA P II )
    • rRNA, in segmenti di varie lunghezze che alla fine si aggregano a formare ribosomi ( RNA P I )
    • tRNA, che riconoscono la sequenza dell’mRNA e allineano gli amminoacidi corrispondenti ( RNA P III )
    • Ridondanza genica per RNA P I e RNA P III.
  • Inizio trascrizione negli Eucarioti (RNA P II, fattori d’inizio, enhancers)
  • Schema generale di mRNA al termine della trascrizione (Eu- e pro-carioti) AUG UGA Sequenza leader Sequenza codificante Sequenza terminale (non tradotta) (non tradotta) 5’ 3’
  • L’esperimento di Chambon Scopo: isolare un gene Problema: avere tante copie dello stesso tratto di DNA Metodo: isolare un mRNA, copiarlo con una trascrittasi inversa: cDNA. mRNA in una cellula Eucariotica specializzata e non specializzata
  • L’esperimento di Chambon Profilo degli RNA in una cellula Eucariotica Ovidutto di pollo, albumina messaggeri
  • L’esperimento di Chambon: ibridazione mRNA-DNA 1. mRNA prelevato dal citoplasma 2. cDNA 3. Anse nell’ibrido mRNA-cDNA 4. Il gene dell’ovalbumina è interrotto da introni
  • Il gene dell’ovalbumina e la maturazione (splicing) del suo messaggero
  • Maturazione dell’mRNA
    • Aggiunta di un cappuccio (G e 2 gruppi metilici) in 5’ (“capping”)
    • Rimozione enzimatica degli introni
    • Poliadenilazione in 3’ (aggiunta di poliA, 10-30 basi a valle della sequenza-consenso AAUAAA.
  • Maturazione (splicing) del messaggero
  • Meccanismo della rimozione di un introne nei complessi di splicing N=qualunque base R=purina Y=pirimidina
  • Maturazione (splicing) del messaggero: in una fase transitoria, un’Adenina forma tre legami fosfodiesterei
  • Splicing alternativi
  • Splicing alternativi: un gene fa tante proteine
  • Splicing alternativi: α-tropomiosina (ratto) esoni costanti
  • Evoluzione degli introni: due ipotesi Precoce Gli introni erano una caratteristica essenziale dei primi organismi. La loro assenza nei batteri sarebbe dovuta ai tempi più brevi di divisione cellulare, e dunque al maggior numero di generazioni durante le quali il genoma batterico si è evoluto, perdendo (quasi) tutti gli introni ancestrali.   Tardiva Gli introni non erano presenti nei primi organismi. Sarebbero arrivati di recente negli Eucarioti, nel corso dell’aumento di complessità che ha creato la necessità di sviluppare meccanismi di controllo coordinato dell’espressione genica.
  • Editing del messaggero
    • Inserzione o delezione post-trascrizionale di nucleotidi, conversione chimica di una base in un’altra
    • Risultato: Il messaggero maturo ha una sequenza di basi che non corrisponde esattamente a quella del DNA che la codifica
    • Dove si osserva: in Tripanosoma ; nei genomi mitocondriale e plastidiale di molte piante superiori; nei Mammiferi, in vari tessuti dove sono possibili splicing alternativi
  • Maturazione (splicing) nella cellula Eucariote
  • Confronto fra pro- ed Eu-carioti
  • Trascrizione ai geni per l’RNA in E. coli : unità di trascrizione, ridondanza genica Sette regioni rrn Maturazione!
  • Trascrizione ai geni per l’RNA in Eucarioti: unità di trascrizione, ridondanza genica 1250 serie di geni Maturazione
  • tRNA: basi modificate, regioni funzionali gradiente di saccarosio
  • tRNA: basi modificate, regioni funzionali
  • tRNA: maturazione
  • Riassunto 05
    • Il DNA viene trascritto in una molecola di RNAm
    • Il messaggero viene tradotto in un peptide
    • Nei procarioti una sola RNA P catalizza la trascrizione, negli Eucarioti intervengono diverse RNA P specializzate in mRNA, rRNA e tRNA
    • Sequenze particolari segnalano i punti di inizio e termine di trascrizione e traduzione
    • Molti geni eucarioti sono interrotti da sequenze trascritte ma non tradotte: introni. Le parti tradotte prendono il nome di esoni
    • Negli Eucarioti il trascritto iniziale matura attraverso l’eliminazione degli introni e altre modifiche biochimiche.
    • Sia in Eucarioti che in procarioti, gli rRNA e tRNA subiscono un processo di maturazione
  • Farmacogenetica e farmacogenomica Le discipline che studiano come individui con diverse caratteristiche genetiche rispondono ai farmaci 1. Farmacogenetica: individuazione di geni candidati, loro caratterizzazione molecolare 2. Farmacogenomica: tipizzazione di centinaia o migliaia di geni e 2.1. Studio funzionale o 2.2. Studio associazione fenotipo/variante allelica sull’RNA sul DNA
    • Quali varianti alleliche sono associate ai diversi fenotipi (risposta e non-risposta al farmaco)?
  • Scopo della Farmacogenetica: individuare la componente genetica delle diverse risposte ai farmaci e comprenderne il funzionamento Prevista risposta al farmaco : scarsa o nulla Previsto rischio di tossicità del farmaco Prevista risposta al farmaco : buona Stessa diagnosi diminuire la dose o usare un farmaco differente usare un farmaco differente
  • geni target geni DME (Drug-Metabolising Enzymes) geni per le proteine di trasporto Tre classi di geni
  • trascrizione mRNA traduzione P450 CYP2D6 (debrisochina idrossilasi) Substrati del P450 Cyp2D6
    • β-bloccanti
    • Antiaritmici
    • Antidepressivi triciclici
    • Antipsicotici
    • Analgesici
    • Antistaminici
    • MPTP (Parkinson inducing neurotoxin)
    Attività enzimatica RH+O 2 +NADPH + H + ROH + H 2 O + NADP +
    • 3 geni altamente omologhi
    • - CYP2D8P pseudogene ( ~ 5.1 Kb)
    • - CYP2D7P pseudogene ( ~ 4.2 Kb)
    • - CYP2D6 gene funzionale ( ~ 4.3 Kb)
    • similarita’ fra 2D6 e 2D7 : 97% circa
    • similarita’ fra 2D6 e 2D8 : 92% circa
    ~ 31 Kb 2D8 2D7 2D6 tel cen I II III IV V VI VII VIII IX
  • 2D8 2D7 12Kb del 2D8 2D7 12Kb dup macroriarrangiamenti *5 = delezione genica *?xN = duplicazione genica 2D8 2D7 2D6 2D6 2D6
  • Diversità globale al gene CYP2D6 (Sistonen et al. 2006)
  • Frequenze genotipiche al locus CYP2D6 in Asiatici ed Europei (Shimizu et al. 2003)