03 dna replicazione

Domande 3
Come avviene la replicazione del DNA?
Quali enzimi sono necessari?
Quali sono le differenze fra procarioti ed Eucarioti?

La replicazione del DNA è semiconservativa

Colture di cellule di porcellino d’India Aggiunta di 5-BUdR, analogo della timina, con minore tendenza a legarsi al colorante fluorescente Due cicli di replicazione: 1.TT, TT TU, UT 2. TU, UT TU, UU Cromosomi arlecchino Prova citologica della replicazione semiconservativa

Tre fasi nella replicazione del DNA
Inizio
Allungamento della catena
Fine

Allungamento della catena: Le DNA Polimerasi
Possono aggiungere un nucleotide all’estremità 3’ libera di una catena di acido nucleico, se dispongono di nucleotidi trifosfati
Possono rimuovere un nucleotide all’estremità 3’ o 5’ di una catena di acido nucleico
Non possono iniziare la replicazione se non dispongono di una catena con l’estremità 3’ libera
Non possono legare fra loro due frammenti di DNA

Le DNA P di Escherichia coli

Nella replicazione di Escherichia coli
DNA stampo (elica singola) + primer + dATP, dCTP, dGTP, dTTP
una DNA polimerasi
DNA a doppia elica Energia di legame
5’---(n-nucl)---3’ + dXTP  5’---(n+1-nucl)---3’ + energia
La DNAP III :
Allunga la doppia elica in direzione 5’—3’
Controlla l’appaiamento fra basi, e se è imperfetto rimuove l’ultimo nucleotide aggiunto (attività proof-reading)
La DNAP I :
Degrada l’RNA nella doppia elica in direzione 5’—3’
Allunga la doppia elica, estendendo il frammento in direzione 5’—3’ e rimpiazzando l’RNA stampo
La DNA PII ripara il DNA danneggiato

Figura 3.3 Allungamento della catena di DNA

Correzione di bozze: Meccanismo d’azione delle DNA P III batteriche (attività esonucleasica 3’ -> 5’)

Figura 3.4 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A
Proteina iniziatrice (DnaA)
SSB (single-strand
binding proteins
Elicasi (DnaB e DnaC)
Primasi = RNA P
Inizio della replicazione La replicazione del DNA inizia con la produzione di RNA

Inizio della replicazione: elica leading e elica lagging

La replicazione procede nelle due direzioni a partire dalla forcella Frammenti di Okazaki

La “bolla replicativa”

I superavvolgimenti sono un problema per la replicazione di cromosomi circolari 100 superavvolgimenti

Azione della topoisomerasi

Schema dei passaggi enzimatici nella replicazione di E. coli
La topoisomerasi fa rilassare il filamento
La proteina iniziatrice si lega a ori-C
Due elicasi (una per ciascuna forca replicativa) denaturano e svolgono un tratto della doppia elica
Le single-strand binding proteins stabilizzano il DNA ad elica singola, senza coprire le basi
La RNA polimerasi (primasi) si lega all’elicasi e sintetizza un innesco di circa 30 paia di basi
La DNA P III lo estende da 5’ a 3’
Ad ogni passaggio la DNA P III rimuove gli appaiamenti sbagliati (proof-reading)
La DNA P I degrada l’innesco ed estende il frammento adiacente, procedendo da 5’ a 3’
La ligasi salda i filamenti adiacenti, senza aggiungere alcun nucleotide

Due eccezioni ΦX174: DNA a singolo filamento DNA P DNA P

Due eccezioni Mosaico del tabacco: RNA DNA P * * DNA polimerasi RNA dipendente! (trascrittasi inversa) DNA P

Ciclo cellulare in Eucarioti e procarioti (ore) Organismo M G1 S G2 Totale E. coli 1 Lievito 20’ 25’ 40’ 35’ 2 Piante 1 8 12 8 29 Uomo 1 8 10 5 24 Velocità di replicazione: E. coli : 50000 basi al minuto Drosophila : 2600 basi al minuto Topo: 2200 basi al minuto Il genoma umano è circa 1000 volte più grande di quello di E. coli

Quando tutto il DNA è stato replicato, per legare fra loro i frammenti ci vuole la ligasi La ligasi catalizza la formazione di un legame fosfodiestereo

Negli eucarioti superiori DNA P α: sintesi del primer DNA P β: riparazione del DNA nucleare DNA P γ: replicazione, solo nei mitocondri DNA P δ: sintesi dell’elica lagging DNA P ε: sintesi dell’elica leading* * Finora dimostrato solo nel lievito SPECIE Dimens. genoma N repliconi velocità replicazione/min E. coli : 4,2 Mb 1 50000 Drosophila : 140 Mb 3500 2600 Topo: 3200 Mb 25000 2200

In sintesi, negli eucarioti superiori

Telomerasi Le regioni terminali dei cromosomi (telomeri) contengono sequenze ripetute: Ciliati ( Tetrahymena ): n(TTGGGG) Flagellati ( Trypanosoma ), uomo: n(TTAGGG) L’enzima telomerasi contiene un tratto di RNA complementare alla sequenza ripetuta e lo usa come primer per replicare l’estremità telomerica 5’: è una DNA P – RNA dipendente

Negli eucarioti, sintesi e degradazione di cicline , prodotte da geni-orologio regolano il ciclo cellulare

Riassunto 3
La replicazione del DNA è semiconservativa : un’elica serve da stampo e viene mantenuta invariata, l’altra viene sintetizzata ex novo.
La replicazione richiede l’intervento di enzimi: RNA e DNA polimerasi, ligasi, elicasi e topoisomerasi, e di altre proteine
Nei procarioti la replicazione procede da un unico punto iniziale, negli eucarioti ciascun cromosoma ha varie origini di replicazione da cui iniziano sintesi simultanee
Nella replicazione dei genomi lineari, ha un ruolo importante la telomerasi

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03 dna replicazione

by Genetica, Ferrara University, Italy

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