Tecnicas histologicas

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Tecnicas histologicas

  1. 1. UNCPBA Facultad de Ciencias Veterinarias Departamento de Ciencias Biológicas CURSO DE HISTOLOGÍA, EMBRIOLOGIA Y TERATOLOGIA GUIA DE ESTUDIO: TECNICAS HISTOLOGICAS AUTOR M.V.M Sc. RICARDO ALZOLA PROF. ADJUNTO AÑO 2001 Se llama técnica histológica a la serie de pasos que han de darse para obtener un preparado observable con el microscopio óptico. Es un proceso largo que abarca desde el momento en que se toma el material hasta que el preparado puede observarse. PASOS: 1.- Toma de material. 2.- Fijación 3.- Deshidratación 4.- Preparación para la inclusión 5.- Inclusión 6.- Modelado del bloque – catalogación 7.- sección con el micrótomo extendido de los cortes – pegado 8.- Coloraciones: de rutina o especiales
  2. 2. 1.- Toma de material: Introducción: Tratándose de un área de Histología el material ha de ser de un animal sano y normal. Si es posible debe extraerse de un animal vivo y anestesiado, en caso contrario, al menos han de extraerse él o los órganos sanos lo más rápidamente posible después de la muerte. La mayoría de las células consisten en una compleja membrana externa que rodea el protoplasma fluido, mezcla de soluciones de sales, proteínas, hidratos de carbono, lípidos, ácidos orgánicos y enzimas. Si las células no fueron fijadas, mu chas de estas sustancias se perderán por solución simple, por diálisis o por ingurgitación osmótica de las células en el proceso que debe preceder al corte y a la tinción. En la técnica histológica muchos componentes texturales se pierden durante los sucesivos pasos de la misma. Los componentes que perduran son en gran medida moléculas grandes que no se disuelven con facilidad en especial después de aplicar el fijador. Las moléculas grandes, particularmente aquellas que forman complejos con otras moléculas de gran tamaño, para producir compuestos macromoleculares, son las que mejor se conservan en un corte: Ej.: - Acidos nucleicos asociados con una proteína (nucleoproteína) - Proteínas intracelulares del citoesqueleto que forman complejos con otras proteínas. Comentario: - Proteínas extracelulares en grandes agregados insolubles asociados con otras moléculas vecinas similares, a través de enlaces cruzados (como sucede en las fibras colágenas) y los fosfolípidos de las membranas. Las proteínas y ácidos nucleicos “pequeños” como el ARN de transferencia en general se pierden durante la preparación de la muestra de tejido. Además pueden perderse moléculas grandes, por ej. estas pueden ser hidrolizadas por un pH desfavorable en las soluciones fijadoras. Son ej. de moléculas grandes, que desaparecen durante la fijación de rutina en fijadores acuosos: el glucógeno, proteoglucanos y glucosaminoglucanos. También suelen perderse los lípidos neutros. Al preparar muestras para su inclusión en parafina también se pierden moléculas pequeñas solubles o iones. Además y con el mismo propósito, la fijación debe hacerse muy cuidadosamente antes de proceder a la deshidratación. Muestreo: En cuanto la sangre deja de llevar oxígeno a los tejidos y de extraerles el anhídrido carbónico, las enzimas de las células que componen los tejidos comienzan a actuar y se produce la autólisis, las propias estructuras moleculares son deformadas, que es lo que precisamente se ha de evitar. Los tejidos y órganos se han de extraer considerando las siguientes prioridades: - Las glándulas exócrinas y endocrinas lo más rápidamente posible. - El páncreas y el riñón deben extraerse no más de 10 a 15 min. post-mortem. - Otros órganos tales como intestino delgado y/o grueso, estómago, hígado, se deben extraer no más allá de los 30 min. - Los músculos esqueléticos, huesos, piel, encéfalo, médula, ganglios nerviosos no deben extraerse más allá de 60 min. postmortem. Material de necropsia: El examen necrópsico debe ser realizado lo más rápidamente posible después de la muerte, si esto no es posible el animal debe ser colocado a 4° C. o sometido a embalsamamiento por vía arterial. 2
  3. 3. Procedimientos generales: Si se extraen varios órganos se debe tener cuidado en registrar cada trozo de órgano envolviéndolo en una gasa o bien pasando un hilo directamente por un extremo del órgano, mientras quede el extremo opuesto se coloca un trozo de cartulina resistente donde se escribe con lápiz las indicaciones (órgano, porción, etc.) del caso, todo esto es necesario si las muestras a extraerse son muchas pues luego se verá dificultado el reconocimiento. La cantidad de líquido fijador en microscopia óptica debe ser aproximadamente 10 a 20 veces el volumen de la muestra. Los fragmentos de órganos no deben ser mayores de 1 cm de espesor; deben ser tomados en ángulos rectos a la superficie de los órganos y deben ser suficientemente profundos para comprender los constituyentes anatómicos normales como por ej. cápsula, corteza, médula, etc. A veces pueden cortarse trozos de órganos de mayor tamaño, 2 o 3 cm y luego de algunas horas en fijador en que las piezas están más fáciles de manejar, se realizan cortes más pequeños de los mismos. ¿Cómo realizar las secciones? Los trozos de órganos tubulares se seccionan directamente con tijeras, los macizos han de ser “desprendidos” con las tijeras. Extraídos los órganos deben seccionarse en fragmentos, para esto se debe utilizar una hoja de afeitar o de bisturí (se utilizan a manera de serrucho sin presionar). Los bordes cortados con tijeras se seccionan y se desechan, porque comprimen los órganos y los deforman. 2.- Fijación: Concepto: La fijación es una operación destinada a “matar” las células, conservándolas, cuanto sea posible en el estado en que están durante la vida. Introducción: Una buen a fijación debe: - inmovilizar la célula - conservar exactamente todas las partes constitutivas. - no hacer aparecer artificialmente otros detalles en la estructura. Tal fijación es por ahora imposible de realizar. Una acción rápida y enérgica del reactivo impide bien las alteraciones espontáneas postmortem, pero este modifica también la estructura celular. Los mejores fijadores son los que además de actuar rápidamente producen el menor numero posible de reacciones (modificaciones) secundarias o artificios, capaces de darnos una idea muy falseada de la morfología interna de la célula. Un tejido bien fijado mostrará células plenas, no vacuolizadas, ni hinchadas, ni arrugadas, sino presentando muchos detalles de estructura fina. ¿En qué consiste esencialmente la fijación? : Es verdad que la masa celular, formada de albuminoides, no puede ser conservada exactamente, sino es por un proceso que la solidifique. Esta solidificación se obtiene por coagulación o precipitación. La coagulación es producida por agentes físicos, la precipitación, siempre acompañada de modificaciones químicas, es producida por agentes químicos. 3
  4. 4. El verdadero papel de la fijación es el de producir una coagulación o una precipitación lo más completa posible de todos los albuminoides celulares, conservando la configuración corres- pondiente a su naturaleza amorfa (citoplasma), granulosa (gránulos de secreción), filamentosa (con - drioma), etc. Conservación morfológica de los Tejidos: Debe endurecerlos suficientemente para permitirles resistir sin deformarse, todas las manipulaciones subsiguientes (deshidratación, inclusión, cortes, etc.). La fijación debe producir al mismo tiempo la insolubilización de los elementos constitutivos de la célula y de los tejidos. Es pues necesario que los detalles de estructura, conservados por el fijador no sean destruidos enseguida por la acción de los líquidos de lavado o de las soluciones colorantes. Esta insolubilización puede ser producida por la deshidratación, coagulación y principalmente por la combinación química del reactivo fijador con los albuminoides celulares. Preparación para la coloración: Ciertas combinaciones formadas entre fijadores y tejidos tienen la propiedad de combinarse con ciertas materias colorantes, estas así pueden mordentar los tejidos y permitir coloraciones específicas. Función del equilibrio físico: Cuando hablamos de fijación debemos tener en cuenta las reglas del equilibrio físico que se relacionan con las membranas permeables. Desde el punto de vista físico, la fijación es la penetración de un producto extraño a través de una membrana permeable, es ante todo un fenómeno de ósmosis. La rapidez de la difusión está en razón directa con la concentración de la sustancia que se difunde, conviene regular esta concentración de manera que la célula pueda conservar lo más intacta posible su forma, volumen y contenido, asegurando una penetración rápida y completa. La rapidez de la penetración está en función directa a la concentración y en función inversa del peso molecular de las sales; esta es mayor para los cuerpos minerales que para los cuerpos orgánicos. Cuando una pieza es sumergida en un fijador, pueden suceder tres cosas: - La pieza cae al fondo, en este caso el fijador es hipotónico, y la fijación tiene bastantes probabilidades de ser incompleta e irregular. - La pieza permanece flotando en la superficie, el fijador es hipertónico, muy denso y las células se contraerán. - La pieza se sumerge, pero queda por encima del fondo del recipiente, hay equilibrio físico y la fijación será buena si los ingredientes del fijador fueron bien elegidos. Cualidades de los fijadores: El fijador ideal sería aquel que conservase la célula en un estado idéntico al estado viviente, este fijador en realidad no existe, por eso debemos buscar una serie de cu alidades en el fijador a utilizar que nos acerquen lo más posible al fijador “ideal”. Cualidades: - Potencia o poder de penetración: al menos en lo que concierne a los tejidos de manera que el líquido pueda fijar muy bien las zonas más profundas e igualmente las capas superficiales. - El fijador debe producir una coagulación total de los albuminoides, pero esto no quiere decir que la coagulación haya de ser violenta e instantánea, por el contrario, conviene que la coagulación sea en cierto modo fraccionada para evitar las contracciones. 4
  5. 5. La rapidez de acción de un fijador debe tener por objeto el de “matar” lo más pronto posible las células. La precipitación total, por el contrario, debe producirse adecuadamente de modo que no se produzcan contracciones. “La muerte de la célula debe ser inmediata y su coagulación debe ser mediata”. Agentes fijadores: Los agentes fijadores pueden ser de orden físico o de orden químico. Agentes Físicos: - Frío: No puede ejercer ninguna acción fijadora a temperaturas que no pasen de 0° C. Endurece los tejidos y suspende las alteraciones celulares debidas a la necrosis y a la autodigestión. Este agente no sería más que una ayuda. La congelación de los tejidos frescos parece ser a priori, un detestable procedimiento histológico. El aumento de volumen de los líquidos que los llenan y la formación de agujas de cristales no puede evitar la producción de verdaderos deterioros. Su única ventaja es la de no precipitar los albuminoides y de no alterarlos. - Calor: Ejerce una acción muy diferente según se aplique a objetos secos o húmedos. La fijación por agua hirviendo o por diversos fijadores en ebullición presta servicios para invertebrados y búsquedas histoquímicas. Agentes químicos: - Ácido acético: Incoloro, cristalizable por debajo de 17° C. Aumenta el contraste entre núcleo y citoplasma. Forma parte de la mayoría de las mezclas fijadoras como fijador de la cromatina. - Ácido ósmico: Se presenta bajo la forma de cristales amarillentos. Se obtiene comercialmente en pequeños tubitos de vidrio sellados, contienen cantidades que varían de 0.1 a 1 g. El manejo de este cuerpo presenta dificultades, es muy volátil y emite sin cesar vapores extremadamente irritantes. Es un enérgico oxidante por lo cual es reducido rápidamente por trazas de materia orgánica, por lo que se debe tener especial precaución para preparar las soluciones. El título habitual es de 1 a 2 %, puede prepararse en agua destilada o en ácido crómico. Desde el punto de vista morfológico, fija sin precipitar, impidiendo además la precipitación por el alcohol durante la deshidratación. Mata rápidamente las células y fija bien el citoplasma y el condrioma pero no muy bien el núcleo. El osmio es un buen fijador de sustancias grasas y de la mielina. Es poco difusible y por consiguiente poco penetrante de manera que las capas superficiales de las piezas están superfijadas mucho antes que el reactivo haya llegado al interior. - Ácido pícrico: Pequeños cristales amarillentos que se emplean en soluciones acuosas saturadas o en soluciones alcohólicas. Solubles en frío en agua, mayor solubilidad con temperatura. Es un reactivo muy penetrante que no se lo emplea solo, sino formando parte de mezclas, como en el líquido de Bouin. El ácido pícrico es un excelente fijador, sobre todo desde el punto de vista tintorial. Se fija con intensidad sobre los citoplasmas, facilita todas las coloraciones. Contrae pero endurece poco. 5
  6. 6. - Alcohol metílico: Reactivo importante en la técnica de frotis desecados. - Alcohol etílico: Puede servir como fijador el alcohol absoluto o el de 96 °. El alcohol 100, puede dar excelentes fijaciones, por ej. para el sistema nervioso o frotis desecados. Disuelve los lípidos, precipita el glucógeno sin fijarlo y da con los nucleoprótidos un precipitado hidrosoluble. Es poco penetrante, fija mal los núcleos y poco los citoplasmas. - Bicloruro de Mercurio: Pequeños cristales blancos muy venenosos, solubles en agua, en frío (7%) en ebullición (54%), muy soluble en alcohol (32%). En solución acuosa precipita enérgicamente los albuminoides, principalmente los del núcleo. Estas propiedades se exaltan por la adición de ácido acético, que vuelve más penetrante el fijador. Una vez terminada la fijación es necesario eliminarlo de los tejidos para evitar la formación de cristales. - Bicromatos: Los bicromatos alcalinos, (Potasio, sodio, Magnesio, Estroncio, Zinc) fijan bien los citoplasmas pero destruyen los núcleos. Los bicromatos de Bario, Calcio, Cobre, fijan bien las mitosis pero no los citoplasmas. El más empleado de los bicromatos es el de Potasio, gruesos cristales de color rojo anaranjado, fácilmente solubles en agua (12.4%). - Formaldehído: Este cuerpo es un gas cuya solución acuosa lleva el nombre de formalina o de formol. Toda vez que hablemos de formol puro tendremos en vista la solución comercial al 40%. El formol es el fijador más utilizado, a causa de su bajo precio y la facilidad de su empleo. Es un fijador importante a causa de su poder coagulante y su notable capacidad de penetración. El formol comercial es un líquido incoloro, que emite vapores irritantes. A veces los vapores del formol pueden producir accidentes febriles, bronquitis, queratitis. Resulta muy desagradable manejar piezas embebidas en formol a causa de las violentas punzadas que no se tarda en sentir en los ojos, la acción sobre la mucosa olfatoria, es tal vez menos sensible, pero más durable y la olfación puede terminar por quedar notablemente disminuída. Conviene no poner los dedos en contacto con las soluciones que contienen formol porque la epidermis se fija rápidamente y endurece de manera poco agradable, además de poder ocasionar dermatitis alérgicas por contacto. Para manejar piezas que han permanecido en formol sin sufrir los inconvenientes mencionados, se las lava con agua y luego se las introduce en agua ligeramente amoniacal, así se suprime todo olor. El formol de comercio casi siempre contiene una cantidad más o menos considerable de ácido fórmico. Esta impureza daña muchas veces la fijación, produce precipitación en los tejidos, destruye las células mucosas y daña seriamente los citoplasmas por lo que es necesario emplear siempre formol neutro. Es conveniente adoptar una convención para formular el título de las diluciones: El porcentaje mirará siempre la solució n comercial de 40%, para preparar una solución al 5% se mezcla 5 cc. de formol con 95 cc. de agua. La solución comercial presenta a veces una alteración particular que se manifiesta por un aspecto lechoso y por la formación de precipitado blando más o menos abundante, el frío interviene mucho en este fenómeno. 6
  7. 7. Estas transformaciones se explican por la existencia de tres isómeros: a.- El formol con una molécula de formaldehído, b.-el paraformol con dos moléculas, c.- el trioximetileno con tres moléculas. El formol y el paraformol coexisten en las soluciones límpidas, bajo la influencia del frío o por otras causas, se polimerizan y dan trioximetileno, insoluble, que forma un precipitado blanco. Teóricamente el formaldehído es un no-electrolito, por consiguiente incapaz de formar sales, pero sí de formar compuestos de adición. El formol solo, puro o diluido es un mal fijador, produce hinchamiento de los tejidos y vacuoliza las células o bien les da un aspecto de sobrefijados, disminuye los contrastes entre citoplasma y núcleo. La adición de ácido acético, corrige el defecto del formol y aumenta notablemente la coloreabilidad del núcleo. En los órganos muy vascularizados el formol a veces forma precipitados negruzcos muy incómodos, que pueden pasar por pigmentos. Para eliminarlos pueden tratarse los cortes con potasa. El formol forma parte de gran cantidad de mezclas fijadoras y es uno de los mejores fijadores para el sistema nervioso y para las mitocondrias. Mezclas Fijadoras: Las mezclas fijadoras se utilizan para técnicas de rutina o para técnicas especiales. Las mezclas fijadoras son combinaciones de agentes fijadores, cada uno de los cuales es por si solo insuficiente para dar una fijación que respondaa todas las exigencias. q de von Tellyesniczki: A base de bicromato de potasio ácido acético y agua destilada (3 g, 5 cc, 100cc). el bicromato conserva bien el citoplasma. El ácido acético conserva bien los núcleos. Las muestras no deben ser mayores de 0.5 cm de diámetro. El tiempo de fijación no debe superar los dos días, al término del mismo debe hacerse un lavado en agua corriente de 24 h. q de Bouin: Para hacer esta mezcla es conveniente tener una solución saturada de ácido pícrico. Componentes: solución saturada de ácido pícrico 15 cc, formol 40% 5 cc, ácido acético 1 cc. Es uno de los mejores fijadores para el estudio del glucógeno; penetra rápidamente a los tejidos, es un buen fijador general, salvo para el riñón. Es muy adecuado para las coloraciones de Masson y Mallory. Produce poco encogimiento. Según el tamaño de la pieza la fijación requiere de 1 a 24 h. El líquido completo es una solución estable. Este fijador produce lisis de los glóbulos rojos y disminuye la cantidad de hierro férrico demostrable. Los tejidos no deben permanecer por más de 12 a 24 h. pues sino se vuelven duros y quebradizos. Una vez terminada la fijación se debe pasar directamente a la deshidratación con alcohol 80°. q De Carnoy: Los componentes de esta mezcla son los siguientes: alcohol etílico, cloroformo, ácido acético glacial (60 ml, 30 ml, 10 ml ). Este fijador es muy adecuado para pequeños fragmentos tisulares, por ej. obtenidos por raspado, que se fijan bien en 30 min. a 2 h. También inicia la deshidratación, es un bu en fijador para el glucógeno, los núcleos se tiñen bien. Como inconvenientes podemos citar que produce lisis y encogimiento importante. Disuelve los lípidos y la mielina. Fija bien el glucógeno. 7
  8. 8. 3.- Deshidratación: Concepto: Los tejidos contienen grand es cantidades de agua, tanto intracelular como extracelular, que debe ser eliminada y reemplazada por parafina. Detención de la fijación: Una vez transcurrido el tiempo de fijación deseado es preciso detenerlo rápidamente. El fijador que rodea la pieza p uede ser eliminado por lavado en: a.- agua b.- alcohol a.- Es imprescindible hacerlo después de la fijación con ácido crómico, bicromato de potasio y ácido ósmico. Se hace en agua corriente de 2 a 24 h. b.- Piezas que han estado en alcohol, ácido pícrico o formol, se llevan directamente al alcohol 70 o 80%, llevándose así a cabo el lavado y el inicio de la deshidratación. La deshidratación se realiza por medio de un reactivo anhidro pero ávido de agua. Puede utilizarse la acetona o el alcohol etílico (es el más utilizado). La deshidratación se hace en forma progresiva con sucesivos baños de alcohol, cada vez menos hidratados 70° – 80° – 90° – 96° – 100°. Tiempos de permanencia en cada líquido: Alcohol 70 las piezas pueden perman ecer varios días. Alcohol 96 2 baños en un lapso de 24 h. Alcohol 100 3 baños de una hora c/u. Como han de introducirse las piezas: Las piezas se han de envolver en gasa a manera de bolsitas, colocarlas en cartulina, etc. pero siempre suspendidas. Para la deshidratación deberán emplearse frascos anchos y de cierre hermético. Los recipientes deben ser agitados periódicamente para que la mezcla de alcohol y agua sea lo más perfecta posible. En cada etapa la cantidad de deshidratante debe ser superior a 10 veces el volumen del tejido por deshidratar. Una mala deshidratación es siempre perjudicial por lo que es necesario controlar el resultado de la misma. Los disolventes utilizados antes de la parafina son el xileno, benceno, tolueno, butilo, si la pieza ha sido mal deshidratada los líquidos se tornan opalinos. 4.- Preparación para la Inclusión: El aclaramiento o desalcoholización permite que el alcohol de los tejidos sea reemplazado por un líquido (solvente) que disuelva la parafina con la cual el tejido va a ser impregnado. La parafina es un hidrocarburo sólido, con escasa elasticidad que ha de penetrar a los tejidos, ocupando hasta sus últimos intersticios. Para lo cual ha de licuarse mediante temperatura. Solventes: Benceno – xileno – tolueno – cloroformo – fenol en alcohol – carbolxilol – etc. La palabra aclarar proviene de que además de eliminar el alcohol muchas de estas sustancias tienen la propiedad de trasparentar los tejidos. Xileno: es un excelente agente aclarante pero tiende a hacer que los tejidos sean excesivamente duros y quebradizos y esto nunca deben dejarse en este líquido más de 3 horas. 8
  9. 9. El xileno es inadecuado para el encéfalo y los ganglios linfáticos, pues los hace demasiado quebradizos, para estos órganos es mejor utilizar cloroformo. Tolueno: tiene las mismas propiedades generales que el xileno pero resulta mejor porque endurece mucho menos los tejidos. Cloroformo: resulta excelente para el tejido nervioso, ganglios linfáticos y emb riones pues produce poco encogimiento y no endurece mucho los tejidos. ¿Cómo se realiza el aclaramiento? : Las piezas se trasladan a un frasco que contenga el volumen adecuado del solvente (30 veces). Si cuando las piezas son colocadas en el solvente se observa que están formando nubosidades opalinas y que estas no desaparecen de inmediato, quiere decir que la deshidratación no ha sido completa. Debe volverse al alcohol absoluto. ¿Cuándo esta terminado este paso? La finalización de este paso es tarea de la vista, si las piezas se han vuelto diáfanas, trasparentes, lo está. Las piezas pueden ser trasladadas a la parafina. 5.- Inclusión: La parafina es un hidrocarburo no cíclico. A la temperatura ambiente es sólido. La temperatura suave la disuelve por c ompleto. Una temperatura mayor de 65° llega a disolverla, produciéndose vapores de olor desagradable, inflamables y también tóxicos. Hay parafinas que funden a distintas temperaturas, para la mayoría de los trabajos pueden utilizarse las que lo hacen a 56-58°. En la estufa debe haber cuatro vasijas con parafina ya disuelta. En cada vasija ha de haber un volumen suficiente como para cubrir por completo las piezas que se han de colocar. Es conveniente que cada vasija posea su número de orden 1, 2, 3 y 4. El recipiente número 1 debe tener parafina ya fundida a la que se mezclará una pequeña cantidad de solvente, el 2 y 3 deben contener parafina pura, que poco a poco ira adquiriendo algo de solvente cuando las piezas vayan pasando por ellas. El 4 debe tener parafina completamente pura. Tiempo de cada baño: Depende un poco del tamaño de cada pieza. En cada recipiente pueden estar de 2 a 3 h. Lo que se ha hecho hasta ahora mediante los baños de parafina se conoce con el nombre de impregnación. La inclusión consiste en encerrar cada pieza dentro de un bloque de parafina pura. Pasos de la inclusión: Se ha de preparar tantos moldes cuantas piezas han de incluirse. Se extrae una pieza, se la libera de la envoltura de gasa, se la ubica en el fondo del molde, orientándola para saber luego por donde ha de ser cortada. Sobre la pieza puesta en el molde se vierte parafina fundida, pura de la cuarta vasija. Se deja el molde sobre una superficie plana y fría, se espera que la falta de calor solidifique toda la parafina, formándose así un bloque. Mientras se trabaja en una pieza las demás deben estar en la estufa. Los moldes: Los hay de varias clases: barras de Leukart, cajas de papel, hormas de metal. Barras de Leukart: Consisten en un par de barras de metal, dobladas en á ngulo recto a manera de escuadras. A su vez cada rama de la escuadra tiene un ángulo recto en el extremo. Esta disposición permite que una barra se aplique contra la otra, como permite deslizamiento es posible agrandar o achicar el molde conforme las neces idades. 9
  10. 10. Las cajas de papel : Se construyen con una tira de cartulina delgada o con papel resistente. Son muy económicas con respecto a las barras dado que aquellas son sumamente caras. Hormas de metal: Se pueden hacer de dos maneras circulares o cuadradas . Las circulares se hacen cortando transversalmente “rodajas” de caños de metal o de plástico, las cuadradas se hacen cortando láminas de aluminio o de hojalata que se doblan sobre un molde de madera, los extremos libres pueden soldarse. Ambos tipos de hormas carecen de piso, por lo que es necesario colocarlas al hacer la inclusión sobre una superficie lisa (ej. un azulejo) 6.- Modelado del bloque – catalogación: La forma de los bloques deben ser preferentemente de pirámide truncada. Las caras opuestas han de resultar paralelas entre sí, lo mismo que las aristas. Catalogación: Cada pieza lleva un hilo con una tarjeta donde se indica de qué órgano o porción del mismo se trata. Esta medida es la base para catalogar los bloques. La catalogación puede hacerse de diferentes maneras de acuerdo a las necesidades particulares. Siempre se tendrá en cuenta que en la misma conste, animal, fijador, fecha, código, bloques, etc. 7.- Sección con el micrótomo – extendido de los cortes – pegado: Como la finalidad de todos estos pasos es poder observar los tejidos con el microscopio, es necesario reducir las piezas histológicas a delgadas secciones. Las secciones finas y parejas se obtienen con el micrótomo. Este aparato consiste básicamente en una base pesada que soporta una superficie por la que se desliza una cuchilla, un tornillo que acerque el material y lo ponga al alcance del filo de la navaja, de modo que siempre su avance ofrezca la misma medida del material. Como el tipo de micrótomo más utilizado es el de deslizamiento, las indicaciones se harán siempre con referencia a este tipo. El bloque se debe pegar en un taco de madera, de la siguiente forma: se calienta una espátula en la llama de un mechero, la que se aplica a la cara inferior del bloque, que se sostiene algo inclinado sobre el taco de madera, a fin de que algunas gotas de parafina fundida caigan sobre su cara superior, una segunda aplicación de la espátula calentada contra la parafina, disolverán otra porción de parafina, que no será necesario dejar caer sobre el taco, y el bloque se aplica y presiona entonces contra el taco y luego se deja enfriar. El micrótomo lleva una pieza que posee una morsa, entre sus ramas se coloca el taco de madera y luego se aprietan con el tornillo de presión hasta que este muy firme. Es conveniente que la navaja del micrótomo ya este colocada en el cepo de la pieza portacuchilla. Una vez colocado el bloque se hace deslizar la cuchilla hasta que su filo esté ubicado sobre el bloque. La pieza portabloque posee una cremallera que permite bajar o subir el bloque, que deberá hacerse contactar con el filo de la navaja. La cara inferior de la cuchilla no debe ser paralela a la cara del corte. 10
  11. 11. ¿Como se regula el espesor de los cortes? Se hace mediante un tornillo micrométrico, sus pasos de rosca son muy estrechos. Al avanzar, empuja el bloque portamaterial por una rampa oblicua al plano de deslizamiento de la cuchilla. Para hacerlo avanzar hay una palanca lateral, una especie de brazo y un tope. Elegido el espesor que se desea dar a los cortes, se desliza la cuchilla. Se hace el primer corte. Este si ha salido entero, se recoge con un pincel húmedo y se deposita en la superficie del agua contenida en una bandeja o cubeta. Es mejor que sea agua fría. Los cortes que naturalmente salen ondulados se extienden y alisan por completo mediante el agregado a la bandeja de agua tibia. Pegado de los cortes: Para la mayor parte de los preparados de histología normal, la técnica exige que los cortes estén fijos. El portaobjeto debe estar limpio, para recoger cortes se toma un portaobjeto seco, se deposita en su centro una gota pequeña de albúmina de Mayer, se extiende esta gota con el borde externo del dedo meñique. La gota debe quedar extendida por completo, formando una película sumamente delgada, casi invisible. Ahora se lleva el porta al agua de modo que su cara untada esté arriba. Se coloca esta cara por debajo de un corte sin defectos. El corte puede ser sujetado por un pincel. Se levanta el porta y se extrae del agua junto con el corte en el centro del porta. Todavía el corte está libre, para que se adhiera hay que hacer evaporar el agua y coagular la película de albúmina de Mayer mediante calor, esto se consigue llevando el porta a una estufa a 37 0 40 °, durante unos 30 min como mínimo. 8.- Coloraciones de rutina y especiales: Las manipulaciones siguientes son inmediatamente previas al proceso de coloración. Para que el corte pueda ser coloreado debe estar completamente libre de parafina y suficientemente hidratado. Los colorantes son cuerpos químicos disueltos en agua destilada o a veces el alcohol. La parafina no se mezcla con ellos, como aquella ha penetrado en el interior de las células estas no podrán ser teñidas. Desparafinación de los cortes: Para realizar la desparafinación de los cortes los mismos son introducidos en un frasco de boca ancha que contenga xileno. Lo ideal es hacer dos baños de aproximadamente 10 min. c/u, de esta forma se asegura una perfecta desparafinación de los cortes. El xileno puede utilizarse varias veces. En los pasos siguiente el xileno debe ser eliminado porque sino la hidratación del corte será imposible. Se elimina mediante el alcohol etílico. Se realizan sucesivos lavados en alcohol 100°.96° y 70°. Una vez realizados los baños con alcohol se puede proceder a la hidratación de los cortes. La hidratación es una operación necesaria. Debe eliminarse el resto de alcohol que hay en el corte. Se realiza sumergiendo los mismos en un frasco que contenga agua destilada, durante dos o tres min. De esta forma el corte estará listo para comenzar algún proceso de coloración. Teoría de la coloración: Se sabe que las imágenes producidas por absorción, en preparaciones coloreadas, son mucho más fáciles de interpretar que las imágenes de difracciones dada por preparaciones no coloreadas, además los diversos elementos de los tejidos poseen poco más o menos el mismo índice de refracción lo que hace que el reconocimiento sea una tarea difícil. Estos dos argumentos hacen comprender la necesidad de las coloraciones para el estudio morfológico de células y tejidos. 11
  12. 12. Un colorante es un cuerpo coloreado que puede comunicar su color a otro cuerpo. La mayor parte de los colorantes artificiales (y aún los naturales como la hematoxilina), derivan de cuerpos incoloros, por ej. de carburos aromáticos. La coloración es la propiedad que tienen ciertos cuerpos de ejercer una absorción selectiva sobre la luz. Dicho de otra manera un cuerpo se ve de tal color porque trasmite por trasparencia o por difusión las radiaciones complementarias de las que él absorbe. Tipos de coloraciones: Directas: se producen por inmersión en el baño colorante. Indirectas: en este tipo de coloración, el colorante no puede actuar directamente, el objeto que ha de colorearse debe ser tratado de antemano por otra sustancia que lo prepare para admitir el colorante, esta se llama mordiente. Clasificación de los colorantes: Puede hacerse desde el punto de vista químico (por su naturaleza) o desde el punto de vista histológico (por su uso). Desde el punto de vista químico los colorantes se agrupan conforme a su constitución. Desde el punto de vista histológico se los clasifica en naturales y artificiales. Colorantes naturales: En todos ellos hay un principio colorante producido por la naturaleza que luego la técnica del hombre ha sabido extraer, componer y hacerlo efectivo. Hematoxilina: La hematoxilina es una sustancia capaz de colorear, extraída de la madera de un árbol conocido como árbol de Campeche, originario de Centroamérica. La hematoxilina se expende en polvo, el cual es cristalino, casi incoloro o algo amarillento a veces más oscuro. La hematoxilina, como tal, aunque esté disuelta en agua o en alcohol de 96° o de 100°, es incapaz de colorear, para poder hacerlo, debe sufrir una oxidación. La hematoxilina oxidada es hemateína y bajo este cambio físico -químico y la unión con una base es capaz de colorear. La base es conocida como mordiente, hay muchas bases que actúan como tal, la más conocida es el alumbre que puede ser de potasio, hierro o cromo. El mordiente es un intermediario entre el colorante y el tejido y en general entre dos cuerpos que químicamente carecen de afinidad. De alguna manera activa las moléculas del tejido y forma con ellas una unión firme y estable. Con el colorante forma un precipitado que presenta una fuerte coloración y es, además insoluble en agua y otros líquidos. Este tipo de precipitado coloreado se llama “laca”. Los mordientes deben ser ácidos nunca básicos. Orceína: Es un principio colorante extraído de ciertos líquenes. Es un ácido débil. Utilizando una mezcla en que el ácido acético actúa como mordiente se utiliza para colorear cromosomas. También colorea las fibras elásticas. Colorantes artificales: Algunos son colorantes del núcleo y otros del citoplasma. Son sales producidas de la unión de una base y un ácido. 12
  13. 13. Colorantes para el núcleo: su base es la que se combina con los ácidos nucleicos, por lo tanto ésta es la coloreada. El ácido es el incoloro. Colorantes para el citoplasma: el ácido del colorante es el que se combina con el citoplasma. La base es la incolora. Colorantes artificiales más comunes: vesubina, tionina, azul de toluidina, azul de metileno, fucsina básica, violeta de metilo, verde de metilo, anaranjado de acridina. Se ha dividido a los colorantes según su afinidad que presentan con el núcleo o con el citoplasma: • colorantes nucleares o básicos su componente colorante activo es una base coloreada. • Colorantes citoplasmáticos o ácidos: su componente activo es un ácido coloreado. • Colorantes neutros. La mayor p arte de los colorantes que se utilizan son sales. Los colorantes básicos son sales cuya base es coloreada y su ácido es incoloro, Ej. azul de metileno—clorhidrato de tetrametiltionina o sea es una sal formada por la combinación de la tetrametiltionina (base coloreada) de azul de metileno con el ácido clorhídrico. Reaccionan con los grupos fosfato de los ácidos nucleicos (DNA-RNA), los grupos sulfato de los glucosaminoglucanos y los grupos carboxilo de las proteínas. Los colorantes ácidos llevan una base que es incolora combinada con un ácido coloreado, Ej. eosina—eosinato de potasio (base incolora) combinada con el ácido eosínico (tetrabromofluoresceína) que es coloreado. Los colorantes neutros tanto el ácido como la base son coloreados Ej. eosinato de azu l de metileno- azur de metileno. Los componentes que se tiñen con colorantes ácidos se dicen que son acidófilos (filamentos citoplasmáticos, la mayor parte del citoplasma no especializado, y las fibras extracelulares). Cualquier componente de los tejidos que reaccione con un colorante básico se dice que es basófilo (heterocromatina, nucleolos, ergastoplasma, matriz del cartílago). Proceso de coloración: Tomaremos como base para la descripción de este proceso a la coloración de hematoxilina y eosina considerada como la “coloración de rutina”. Coloración de hematoxilina y eosina: Desparafinar los cortes: realizar dos baños de xileno de 10 a 15 min. c/u. Eliminamos el solvente por sucesivos baños en: alcohol de 100°, 96°, 70° de 1 a 2 min. c/u. Hidratación de los cortes: en agua destilada durante 1 a 2 min. Tinción nuclear: en hematoxilina durante 2 a 12 min. de acuerdo a la formula utilizada. Viraje de la hematoxilina: en agua corriente hasta desprendimiento total del color (3 a 5 min.). Lavado en agua destilada o corriente. Coloración citoplasmática: eosina al 0.5% o en una mezcla de eosina/floxina al 0.5% durante 15 a 30 seg. Lavado en agua destilada. Deshidratar, aclarar y montar. Los pasos de la deshidratación pueden ser suplidos dejando secar el corte en estufa a 37° por 15 a 20 min. 13
  14. 14. Coloraciones especiales: Las coloraciones especiales comprenden un conjunto de tinciones o impregnaciones utilizadas para poner de manifiesto o resaltar determinadas estructuras de los tejidos. Para tejido conectivo: Fibras colágenas: Tricrómico de Van Gieson: las fibras colágenas se observan de color rojo. Tricrómico de Gomori: se observan de color rojo. Tricrómico de Masson: las fibras colágenas se observan de azul. Fibras Elásticas: Método de Gomori: las fibras elásticas se tiñen de púrpura oscuro. Orceína: se tiñen de púrpura. Fibras reticulares: Método de Gomori para la impregnación argentica de la reticulina: las fibras reticulares se observan negras. Tejido adiposo: Sudan black: el tejido adiposo se observa de color negro. Sudan IV-rojo Escarlata: - grasas neutras: se observan de color rojo vino. - lipoides: rojo anaranjado - fosfolípidos: se tiñen poco o nada. Carbohidratos y mucopolisacáridos: Acido Peryódico de Schiff (PAS): los mucopolisacáridos básicos o neutros se observan de color rojo. Azul alcian: los mucopolisacáridos ácidos se observan de color azul. Coloración para el estudio neurohistoquímico: Coloración de la sustancia de Nissl- método de la tionina fenicada: los grumos de Nissl y núcleos aparecen teñidos de color azul profundo. Luxol fast blue-PAS-hematoxilina: la mielina se observa azul brillante Modificación de la técnica de Glees-método de Marsland, de impregnación argéntica a cortes de parafina: células nerviosas, neurofibrillas y células de la glia en diversas tonalidades de negro, fondo de color habano. BIBLIOGRAFÍA • Celani M. S., Fernández Surribas J., von Lawzewitsch I. Lecciones de Histología Veterinaria. Volumen I Microscopia y Técnicas Histológicas. I. Ed. Hemisferio sur S. A. 3ra. Ed. 1984. • Jaulmes Ch., Jude A., Querangal J., Delga J. Práctica de Laboratorio. Toray/Masson. 1970. • Luna L. G. Edited. Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. Mc Graw Hill Book company. 3 ed. 1992. 14
  15. 15. • Lynch M., Raphael S., Mellor L., Spare P., Inwood M. Méetodos de laboratorio. 2da. Ed. Interamericana. México. 1972. • Martoja R., Técnica de Histología Animal. Toray-Masson S. A. Barcelona ¡ra. Ed. 1970. • Policard A., Bessis M., Locquin M. Traité de Microscopie Instruments et Techniques. Masson et Cie , Editeurs. Paris. 1957. • Roveda N. Histología del Sistema Nervioso y Técnicas de su preparación. Cabaut y cia. Editores Bs. As. 1909. • Stohr P. H. Manuel technique d’Histologie. Paris G. Steinheil, Editeur. 1904 15

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