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how to manage samples during preanalytic phase of flow cytometry

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Grenoplepreanalytiquegcf Grenoplepreanalytiquegcf Presentation Transcript

  • MC Béné Grenoble, 19 Janvier 2010 GC Faure Grenoble 12/12/2011
  • IMMUNOPHENOTYPAGE EN CYTOMETRIE DE FLUX
    • Identifier les sous-populations leucocytaires
    • Evaluer leurs proportions
    • Evaluer leur nombre absolu
  • CONTRAINTES
    • Suspension cellulaire
    • Sans amas
    • Avec le moins de débris possible
    • Cellules viables sauf exception
    • Vérification des caractéristiques du cytomètre
    • Cellules marquées
    • Contraintes des fluorochromes
    • Choix des combinaisons
  •  
  • Quels échantillons?
    • Sang périphérique
      • EDTA optimal si <24 heures
      • Citrate ou héparine possibles
    • Moelle osseuse
      • Attention à la dilution
      • 2 mL maximum
      • Attention à la coagulation
    • Autres échantillons
      • Lavages broncho-alvéolaires
      • Liquide céphalo-rachidien
      • Liquides d’épanchement, d’ascite, de ponction
      • Cellules éluées de tissus
    • Lignées cellulaires
  • Cellules vivantes
    • On veut rester en suspension! (EDTA)
    • Facteurs nutritionnels
    • Prolifération anormale : on a faim!!
    • On était bien à 37°!!
  • Cellules vivantes
    • Déchets cellulaires : le vieux sang
    • On veut rester en suspension!
    • On était bien à 37°!!
    • Facteurs nutritionnels
    • Prolifération anormale: on a faim!
  • La suspension cellulaire
    • Sang, moelle
      • Ficoll vs. Lyse…
    • Les autres liquides
    • LBA, LCR, épanchements, ascites, lignées….
      • + Lavage
      • Numération
      • Ajustement
      • Cytospin
  • Ficoll et sélection cellulaire : une vieille énigme!!
      • Osmolalité 280 + 15 mOsm (sérum 275-300)
      • Densité 1.077 + 0.01
      • pH 6-7
      • Cellules normales vs. Cellules fragiles
      • Conditions de réalisation du ficoll
        • Température, Délais de manipulation, Lyse des GR résiduels?
        • Ficoll is a neutral, highly branched, high-mass, hydrophilic polysaccharide which dissolves readily in aqueous solutions .
        • In 1968, Bøyum described a method using low viscosity Ficoll™ and sodium metrizoate, of the proper density and osmotic strength, to isolate mononuclear cells (2) 2381 citations mais index h à 5! . Sodium metrizoate has been successfully substituted with sodium diatrizoate by numerous workers (3,4).
        • Ficoll is a registered trademark owned by GE Healthcare companies. [1]
        • http://www.scoop.it/t/immunology/p/725527997/ficoll-paque-plus-a-guide-to-isolating-mononuclear-cells-from-whole-blood
  • Autres méthodes de séparation et d’enrichissement
    • Percoll, Polymorphoprep
      • Le Percoll par Pertoft et al. comme outil permettant une meilleure séparation par densité 1 . Il est utilisé pour la séparation de cellules , d' organelles et/ou de virus par centrifugation à densité différentielle. Le Percoll est composé de particules de silicates colloïdales de 15-30 nm de diamètre (23% m/m dans de l'eau) qui sont recouverts de polyvinylpyrrolidone (PVP). Le Percoll est très bien adapté pour la mise en place de gradients de densité puisqu'il possède une faible viscosité comparé à ses alternatives, une faible osmolarité et une non toxicité vis-à-vis des cellules et de leurs constituants.
    • Gradients discontinus…
    • Cellules adhérentes sur plastique boîte de Petri
    • Rosettes
    • Séparations magnétiques
  • Lyse et sélection cellulaire : une autre énigme!!
    • Chlorure d’ammonium
    • Réactifs ( 10x: impératif pour conservation sinon carbonate d’ammonium )
      • Chlorure d’Ammonium 82.9 g
      • Bicarbonate de Potassium * 10.0 g
      • EDTA 0.37 g
      • Eau distillée non désionisée qsp 1.0 liter
    • Culot cellulaire + 1 ml NH4Cl 1X : maximum 2-3 minutes à température ambiante….
    • … . Ou jusqu’à 10 minutes….
    • Centrifuger immédiatement à 200 g 5 minutes et enlever complètement le liquide de lyse
    • Remettre en suspension
    • NE CONVIENT PAS POUR DES ETUDES FONCTIONNELLES ULTERIEURES
  • Autres méthodes de lyse
    • Réactifs hypoosmotiques : eau ou Zapoglobine
      • Hémolyse complète
      • Altération des globules blancs si contact prolongé
    • Acide acétique 3% dans l’eau
      • Hémolyse complète
      • 70% de perte des globules blancs
    • Réactifs du commerce
      • Composition mal connue
      • Acide/base
      • Anhydrase carbonique, plus sélectif
      • Avec ou sans fixation en paraformaldéhyde
    • Lyse avec ou sans lavage
      • Immunoglobulines, chaînes légères
      • Préservation de l’ensemble des leucocytes
  • Les marquages
    • Surface, Cytoplasme, Noyau
    • Quelques rappels de biologie cellulaire…
  • La membrane
    • Une structure moléculaire complexe
    Ac palmytique Azote Ac Oléique Oxygène Phase aqueuse/oxygène Phosphore H Heller et al. J Phys Chem 1993
  • La membrane
    • Glycosylées
    • Transmembranaires
    • Gpi
    • Associées
    • Mobiles….
    Une phase fluide et des protéines
  • Marquages membranaires
    • Anticorps vs molécules membranaires
      • Une affaire de taille
      • Une affaire d’accessibilité
        • Marquages multiples…
      • Une affaire de charge
      • Une relation dynamique…
    CD23 CD20 CD45 CD22 Leu13 CD81 CD19 CD21 CD79a/b sIgM CD40
  • Patching et capping
  • Patching et cappping (2)
  • Récapitulatif
  • Quelle surface cellulaire?
    • Cellules isolées
    • Agrégats
    • Exosomes
    • Microparticules
    • Plaquettes
  • Les cellules qui se cachent
    • Hypergamma protéines de l’inflammation
    • On a changé de densité
    • On s’est collées au tube
    • On est camouflées dans les mucines
    • Laissez nous nous réveiller
  • Fixations non spécifiques?
    • Récepteurs Fc
    • Lymphocytes B FR+?????
    • Ratio F/P des fluorochromes
    • Saturation en anticorps
    • Bactéries
  • Cellules fixées
    • Après le marquage
      • Paraformaldéhyde
        • Neutralisation virale
        • Conservation du marquage
    • Avant le marquage
      • Prélèvements anatomopathologiques
      • Certains épitopes n’y survivent pas
      • Cellules en suspension : cytoplasme
  • Le cytoplasme
    • Pas une mer intérieure!!!....
    • … . Un vrai labyrinthe plein de pièges
      • Membranes des organelles
      • Accessibilité
      • Fixations non spécifiques
  • La perméabilisation
    • Quels perméabilisants?
      • Saponine
      • Digitonine
      • Paraformaldéhyde
      • Formol
      • Triton
    • Attention on change de taille!!
  • Perméabilisants du commerce
    • Fix & Perm
    • Perméafix
    • Intrastain
    • E-biosciences
  • Et le noyau???
    • Anticorps
    • Intercalants
  • Mortes ou vives?
    • Taille/Structure
      • Nécrose : diminution SS et FS
      • Apoptose : d’abord FS
    • Membrane
      • Exclusion de colorants : IP
      • Inclusion de colorant : FDA (fluorescein diacetate)
      • Exposition de la P.sérine : Annexine V
    • Cytosquelette
      • F-Actine avec la phalloïdine-FITC
    • Organites intracellulaires
      • Rh123 et mitochondries vivantes (charge et potentiel transmembranaire)
      • Acridine orange et lysosomes (pompe à protons)
  • Immunofluorescence indirecte ou directe Première incubation Lavage Deuxième incubation + Lavage Incubation des cellules avec l’anticorps ou le mélange d’anticorps Pas de lavage nécessaire Marquages concomitants membranaires et intracellulaires Marquage membranaire + lavage Perméabilisation Marquage intracellulaire
  • Au total
    • Penser à ses cellules
    • Elles sont vivantes
    • Elles sont pleines de ressources
    • Les observer est magique!
  •  
  • Amélioration des techniques de cytométrie
    • Utilisation de CD45
    • Marquages multicouleurs
      • 3 couleurs, 4 couleurs, 5 couleurs, 6 couleurs, 8 couleurs, 10 couleurs et plus….
      • Choix des anticorps, des fluorochromes, des combinaisons
      • Stratégies de fenêtrage
    • Recherche des combinaisons les plus sensibles, les plus stables
  • Les nouveaux fluorochromes
    • Augmentation de la gamme de PMT
    • Augmentation de la gamme de longueur d’onde
      • Avec l’utilisation de plusieurs lasers
      • Par mise à profit de l’effet tandem
    • Sensibilité accrue à la lumière
      • Flacons noirs
      • Manipulations extemporanées et rapides
      • Incubation dans le noir ( + 4°C)
      • Lecture immédiate ou protection ++ contre la lumière
  • Attention aux tandems
    • Certains sont fragiles
      • Lumière
      • Température
    • Dans un système à plusieurs lasers le receveur peut être excité directement par un autre laser
    • Exemple
      • PE-Cyanine 5
      • Excitation respective à 488 m et … nm
      • Normalement
  • Réglages des PMT et compensations
    • Un équilibre subtil
    • Penser à jouer sur les PMT quand des compensations semblent « impossibles »
    • Dans les combinaisons complexes, ce n’est pas toujours le fluorochrome qu’on croit qui « bave » : afficher TOUTES les combinaisons possibles
      • Eh oui, en 5 couleurs ça fait 10 biparamétriques, en 6 couleurs 15 et en 10 couleurs 45!!
    • Attention aux compensations avec des billes fluorescentes
      • Elles ne se comportent pas comme des cellules
      • Elles ne sont pas co-marquées
    • Les suspensions cellulaires sont très pléiomorphes
      • Auto-fluorescence différente
      • Récepteurs Fc sur certaines cellules
      • Un bon réglage doit porter sur toutes les sous populations présentes dans l’échantillon
  • Règle d’or d’une bonne compensation Les cellules négatives ont la même MFI sur un axe donné Elles sont préférentiellement dans la première décade
  • Bad!!!
  • Bad!!
  • Analytique : post acquisition
    • Générer les histogrammes d’intérêt
    • Garder quelques histogrammes « de base » pour contrôle
    • S’assurer de la chronologie des fenêtrages en cascade
    • Utiliser des codes couleur itératifs
    • Jongler avec les modes d’affichage
    • Pour les analyses fréquentes utiliser toujours la même stratégie/le même protocole
  • Multimarquages… ….standardisation nécessaire
  • Cartographie des suspensions cellulaires en hématologie : le scattergramme SSC/CD45 Stetler Stevenson Wood Stachursky Xu Cherian GTLLF
  • Stratégie GTLLF : d’abord les cellules matures
    • Identification positive des cellules matures de la moelle osseuse
    • Code couleur
    • CD45 bright : lymphocytes
    • CD14/CD11b : monocytes
    • CD16/CD11b : granulocytes (NK, B)
    • Le reste : «   bermudes   »
  • Analyse CD45 SSC FSC SSC CD14 SSC CD16 SSC CD45 CD11b
  • Analyse
  • Marquages complexes : retour à la cartographie
    • Détermination systématique de seuils de positivité
      • Backgating
      • Crossgating
      • Walkgating
  • Stratégie Granulober CD45 SSC FLn SSC CD45 SSC FLx FLy CD45 SSC CD45 SSC CD45 SSC FLx FLy FLx FLy
  • CD11b/CD117/CD34 Gating CD11b+ Gating CD117+ Granulober FLx FLy CD45 SSC CD45 SSC CD45 SSC FLx FLy FLx FLy
  • FLn SSC Stratégie FL3+ FL2+ FL1+ FLn+ Granulober CD45 SSC CD45 SSC CD45 SSC CD45 SSC FL1 FL2 CD45 SSC FL1 FL3 FL2 FL3
  • Gating CD13 Gating CD34 Gating CD33 Crossgating II.12 CD45 SSC CD45 SSC FL1 FL2 CD45 SSC FL1 FL3 FL2 FL3 FL3 + FL2 + FL1 +
  • Walkgating
  • Walkgating
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