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  • Human Whole Blood Translocation experiment
    O:\2009 Data\050209 G2A1 whole blood DM NFkB 6color
    050209 G2A1 whole blood DM + LPS 6C 60X_17_48nofs_1.daf
    050209 G2A1 whole blood DM 6C 60X_17_48nofs_1.daf
    Background and purpose
    NFkB translocation is an important indicator of blood cell activation, and is an important therapeutic target for the treatment of autoimmunity, cancer, and infectious diseases. To date, it has not been possible to robustly measure NFkB translocation directly in whole blood leukocytes. Here we show a simple method of quantifying NFkB activation in immunophenotypically-defined whole blood leukocytes using the ImageStream
    Method
    1 – stimulate whole blood with 100 ng/mL LPS
    2 – stain for surface markers on ice
    PE-CD14, PE-TR-CD45, AF647-CD16, APCAF750-CD3
    3 – Fix/lyse/perm and stain for NFkB (FITC) and DAPI
    4 – ImageStream: collect 20,000 events at 60X
    5 – Analyze leukocyte subsets for NFkB translocation
  • How many cells are needed – this slide illustrates the confidence in interpreting the extent of nuclear translocation in a sample exhibiting incomplete activation.
    These are LPS stimulated human monocyte line THP-1 stained with FITC NFkB (green) and 7-AAD (nuclear dye, red). Histogram plots the per cell ‘degree of translocation’ score for the sample. As described in detail later, this is the ‘Similarity’ score for the NFkB / 7-AAD image pair.
  • Transcript

    • 1. Plate-forme de Recherche Clinique en CYTOMIQUE  Biomarqueurs cellulaires innovants  CPER: Innovations thérapeutiques et Technologies de la Santé (ITTS-CIC-B)  Plateau technique au sein du Pôle Laboratoires du CHUN (Pr F Plenat) dédié à la recherche clinique et translationnelle  Mutualisation des compétences  Complémentarités humaines et technologiques  Ouverture régionale et interrégionale  Ensemble type « Flow cytometry core facility »  Cytométrie en flux multiparamétrique  Cell Search Veridex  Image Stream System (Amnis)  Charte et soumission IBiSA
    • 2. Cytométrie de flux multiparamétrique  Navios (Beckman Coulter)  Software Kaluza  CMF 3 lasers 10 couleurs  Laboratoire d’Immunologie (Pr GC FAURE, Pr MC BENE, Dr M de CARVALHO)  Service d’Hématologie biologique (Pr T LECOMPTE, Dr V LATGER)  Unité de thérapie cellulaire et tissulaire (Pr JF STOLTZ, Pr A DALLOUL)  Anatomopathologie (Pr F PLENAT, Dr K MONTAGNE)
    • 3. Cancéropole Cytométrie de flux multiparamétrique Evénements rares et populations discrètes  Onco-Hématologie  NoE European Leukemia Net  STIC DHOS Maladie résiduelle (LAL, LAM)  Maladie Résiduelle LLC  Myélodysplasies  Projet INCA SIGLAM  Phase périphérique des LMNH  Réponse immunitaire anti-tumorale et thérapie cellulaire  Tregs, cellules dendritiques, cellules NK  Microparticules et cellules endothéliales
    • 4. Cytométrie de flux multiparamétrique (2) MC Béné, au nom du GEIL, GTLLF, GOELAMS Moelle normale Maladie résiduelle valorisation démarche détection et quantification d’événements rares au sein des « bermudes » CD34 CD45 CD13 SSC
    • 5. Cytométrie de flux multparamétrique (2)  Réponse immunitaire anti- tumorale spécifique (M de Carvalho, P Eschwege + …)  Antigènes candidats (cancer prostate)  Problématique: événements rares + caractérisation multiparamétrique phénotypique et fonctionnelle de sous populations cellulaires  Signatures cytokiniques  Transfert de l’expérience acquise dans la réponse spécifique anti-mycobacterium tuberculosis et anti-adenovirus
    • 6. Cytométrie de flux multiparamétrique (3)  Microparticules, thrombose et cancer (V Latger- Cannard, Th Lecompte)  Standardization of platelet-derived microparticle counting using calibrated beads and a Cytomics FC500 routine flow cytometer : a first step towards multicenter studies?  Robert S, Poncelet P, Lacroix R, Arnaud L, Giraudo L, Hauchard A, Sampol J, Dignat- George F.  J Thromb Haemost. 2009 Jan;7(1):190-7. Epub 2008 Oct 18.
    • 7. Cell Search Veridex®  Combinaison de méthodes  Immunologiques spécifiques  Séparation immunomagnétique  Quantification en imagerie photonique automatisée  Standardisation et automatisation de la phase préparative  Très grande sensibilité (5 évts/tube de 7,5mL) soit #10-7  outil de choix pour l'étude des cellules endothéliales circulantes en recherche clinique.  Validation antérieure en recherche clinique pour les cellules tumorales circulantes pour des études pronostiques.  Capacités d’isolement des cellules en vue d’études moléculaires complémentaires
    • 8. Projets Cell Search Cancéropole et au-delà…  Cellules Tumorales Circulantes (CTCs)  Sein (CIC Cancérologie CHU-CLCC E Luporsi – GSK/NOVARTIS – INCA?)  Poumon  AO Cancer 2009 Région Lorraine, Nancy Y Martinet, JM Vignaud comparaison ISET STIC Nice, Strasbourg P Oudet, M Beau-Faller  Prostate (Nancy Urologie: J Hubert, P Eschwege; Paris: S Loric LIBM)  Validation clinique en réseau interrégional, national, voire européen (IMI?)  Cellules Endothéliales Circulantes (CECs)  Thérapies antiangiogéniques  Inflammations: sepsis (CPRC S Gibot)  Neuroectodermoses: Sclérose tubéreuse de Bourneville (J Hubert, Necker)
    • 9. Cell search CTCs (1)  CERONC – Poumon (Y Martinet, E Quoix, M Beau-Faller, P Oudet)  Evaluation de l’intérêt clinique de la détection des cellules tumorales circulantes dans le cancer bronchique métastatique  Avec ajout de marqueurs d’intérêt (X)  Isolement des cellules en vue d’études moléculaires  CERONC – Prostate (P Eschwege, J Hubert, D Peiffert)  Evaluation préthérapeutique
    • 10. Cell Search CECs (2)  Projet Sepsis  CPRC CHU Nancy (Pr S Gibot, GCF)  Quantification des CEC  Isolement des CECs pour études moléculaires  Projet STB (Sclérose Tubéreuse de Bourneville)  Evaluation des CECs comme biomarqueurs d’angiogénèse pour l’évaluation et le suivi des tumeurs vasculaires rénales  Demande en cours ASTB, PHRC maladies rares (GCF, Pr J Hubert, Necker – D Joly, Lyon – O Rouvière)
    • 11. Imagerie en flux Image stream X AMNIS®  Le système AMNIS®, système d’imagerie en flux combinant cytométrie en flux et imagerie photonique  Observation directe, de la localisation précise, cellule par cellule, des marqueurs fluorescents utilisés pour identifier: membrane, organites intracellulaires, noyau.  Parmi les applications réalisables en simultané  Marquages membranaires multiples et colocalisation de marqueurs de surface  Marquages nucléaires (FISH en suspension)  Translocation nucléaire, apoptose  Etudes fonctionnelles  Coopérations cellulaires (synapse immunologique)
    • 12. Image stream X AMNIS Applications…. etc  Biologie cellulaire – Immunologie  Cancérologie Cycle Cellulaire Signalisation Cellulaire Analyse Morphologique Mort cellulaire Dommage de l’ADN Interactions cellulaires
    • 13. Plate-forme de recherche clinique en CYTOMIQUE  Biomarqueurs cellulaires innovants  CPER: Innovations thérapeutiques et Technologies de la Santé (ITTS-CIC-B)  Plateau technique au sein du Pôle Laboratoires du CHUN (Pr F Plenat; REDIF: Pr Th Lecompte; CIC-B Pr GC Faure) dédié à la recherche clinique  Mutualisation des compétences  Complémentarités humaines et technologiques  Ouverture régionale et interrégionale  Ensemble type « Flow cytometry core facility »  Cytométrie en flux multiparamétrique  Cell Search Veridex  Image Stream System (Amnis)  Charte et soumission IBiSA
    • 14. R3 MONOMONOMONO T CELLT CELLT CELL MONOMONOMONO T CELLT CELLT CELL 1e50 1e4-1e3 1e3 1e6 Intensity_A-750 CD3 1e5 1e6 1e4 -1e3 0 1e3 Intensity_PECD14 9_BF 6_SSC 7_DAPI 2_FITC NFkB 3_PE CD14 4_PETR CD45 11_AF647 CD16 12_A750 CD3 325 718 969 1246 9_BF 6_SSC 7_DAPI 2_FITC NFkB 3_PE CD14 4_PETR CD45 11_AF647 CD16 12_A750 CD3 316 943 1142 3592 Monocytes T cells NF-kB translocation in whole blood subsets

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