TUGAS MATA KULIAH
TEKNIK PENELITIAN BIOKIMIA
(BIK 504)
OLEH :
SOGANDI
G851130241
PROGRAM STUDI BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIK...
Sandwich ELISA for Hemoglobin A2 Quantification and
Identification of β-Thalassemia Carriers
Surakit Kuntaruk, Thanusak Ta...
Gambar 1. Gambaran umum teknik ELISA
Dalam uji tersebut, antigen yang menarik bergerak oleh adsorpsi langsung
ke pelat uji...
Tahapan pada Indirect ELISA :
1. Coating plate ELISA
Coating dicapai melalui adsorpsi pasif antigen ke plate uji. Metode y...
dengan antigen spesifik. Peneliti menggunakan 0,05% Tween-PBS sebanyak 4
kali.
Gambar 3. Proses pembilasan mikrotiter
5. P...
menggunakan immunoglobin anti-tikus horseradish peroxidase (HRP) sebagai
konjugat antispesiesnya.
6. Langkah pencucian
Sel...
antibodi sekunder terkonjugasi untuk menghasilkan warna biru. Pada penelitian
ini reaksi dihentikan oleh 1 M HCl yang diuk...
pada saat terjadi interaksi antara antigen yang diinginkan dengan antibodi spesifik
tertaut enzim signal.
Kelebihan metode...
sedangkan antibodi sekunder seringkali disebut sebagai antibodi deteksi. Dalam
pengaplikasiannya, ELISA sandwich lebih ban...
Gambar 6. Format nonkompetitif immuno assay
Tahapan pada Sandwich ELISA :
1. Coating plate ELISA
Pada ELISA sandwich, pert...
Gambar 7. Proses pencucian plate
3. Penambahan Buffer Blocking
Buffer blocking yang ideal akan mengikat semua lokasi yang ...
6. Penambahan Enzim Konjugat Antibodi
Lalu, kedalam lubang mikrotiter dimasukkan larutan yang berisi antibodi
detektor, se...
intensitas warna yang diinginkan yang merupakan indikasi dari tingkat analit.
Pada penelitian ini reaksi dihentikan oleh 1...
multivalent serta sulitnya mencari dua jenis antibodi yang dapat berinteraksi
antigen yang sama pada sisi antigenic yang b...
Hasil
Produksi dan karakterisasi mAbs menjadi HbA2
Untuk mengubah mAbs menjadi HbA2, dua tikus Balb/c diimunisasi
dengan H...
Penilaian keandalan tingkat HbA2 ditentukan oleh sandwich dikembangkan
ELISA
ELISA yang dikembangkan telah digunakan untuk...
Sebagai kesimpulan, penelitian ini telah berhasil mengembangkan ELISA
sandwich untuk kuantifikasi HbA2. Teknik ini sederha...
Upcoming SlideShare
Loading in...5
×

Tugas elisa gandi

898

Published on

0 Comments
1 Like
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

No Downloads
Views
Total Views
898
On Slideshare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
0
Actions
Shares
0
Downloads
48
Comments
0
Likes
1
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

Transcript of "Tugas elisa gandi"

  1. 1. TUGAS MATA KULIAH TEKNIK PENELITIAN BIOKIMIA (BIK 504) OLEH : SOGANDI G851130241 PROGRAM STUDI BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2014
  2. 2. Sandwich ELISA for Hemoglobin A2 Quantification and Identification of β-Thalassemia Carriers Surakit Kuntaruk, Thanusak Tatu, Tiemjan Keowkarnkash, Watchara Kasinrerk © The Japanese Society of Hematology, 2010 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) adalah uji yang berdasarkan pada sebuah plate yang dirancang untuk mendeteksi dan mengukur zat seperti peptida, protein, antibodi dan hormon. Nama lain, seperti enzyme immunoassay (EIA), juga digunakan untuk menggambarkan teknologi yang sama. Dalam ELISA, antigen harus bergerak ke permukaan padat dan kemudian kompleks dengan antibodi yang terkait dengan enzim. Deteksi dilakukan dengan menilai aktivitas enzim terkonjugasi melalui inkubasi dengan substrat untuk menghasilkan produk terukur. Unsur yang paling penting dari strategi deteksi ini adalah interaksi antigen-antibodi yang sangat spesifik. ELISA biasanya dilakukan di 96-well (atau 384-well) plate polystyrene, yang secara pasif akan mengikat antibodi dan protein. Hal ini akan mengikat dan mengimobilisasi reagen yang membuat ELISA begitu mudah untuk dirancang dan dilakukan. Reaktan dari ELISA bergerak ke permukaan plate yang memudahkan untuk memisahkan ikatan dari bahan nonikatan selama pengujian tersebut. Kemampuan untuk membersihkan bahan nonspesifik terikat membuat ELISA sebagai alat yang ampuh untuk mengukur analit tertentu dalam sebuah preparat kasar. ELISA dapat dilakukan dengan sejumlah modifikasi pada prosedur dasarnya. Langkah kuncinya adalah imobilisasi antigen, dapat dilakukan dengan adsorpsi langsung ke pelat uji atau tidak langsung melalui antibodi capture yang telah melekat pada plate. Antigen tersebut kemudian dideteksi baik secara langsung (antibodi primer berlabel) maupun tidak langsung (antibodi sekunder berlabel). Format uji ELISA yang paling kuat adalah uji sandwich. Jenis uji capture disebut "sandwich" assay karena analit yang akan diukur terikat antara dua antibodi primer yaitu antibodi yang mengikat dan antibodi deteksi.
  3. 3. Gambar 1. Gambaran umum teknik ELISA Dalam uji tersebut, antigen yang menarik bergerak oleh adsorpsi langsung ke pelat uji atau dengan terlebih dahulu melekatkan antibodi capture ke permukaan plate. Deteksi antigen kemudian dapat dilakukan dengan menggunakan antibodi enzim-terkonjugasi primer (deteksi langsung) atau mencocokan satu set dari antibodi primer berlabel dan enzim-terkonjugasi sekunder (deteksi tidak langsung). Dalam penelitian ini peneliti menggunakan dua metode ELISA, yaitu metode Indirect ELISA dan Sandwich ELISA. Indirect ELISA Teknik ELISA indirect ini pada dasarnya juga merupakan teknik ELISA yang paling sederhana, hanya saja dalam teknik ELISA indirect yang dideteksi dan diukur konsentrasinya merupakan antibodi. ELISA indirect menggunakan suatu antigen spesifik (monoklonal) serta antibodi sekunder spesifik yang tertaut enzim signal untuk mendeteksi keberadaan antibodi yang diinginkan pada sampel yang diuji. Gambar 2. Gambaran umum teknik indirect ELISA
  4. 4. Tahapan pada Indirect ELISA : 1. Coating plate ELISA Coating dicapai melalui adsorpsi pasif antigen ke plate uji. Metode yang paling umum untuk lapisan plate melibatkan penambahan 2-10 pg/ml dari protein yang dilarutkan dalam buffer basa seperti phosphate-buffered saline (pH 7,4) atau karbonat- buffer bikarbonat (pH 9,4). Pertama mikrotiter diisi dengan larutan yang mengandung antigen spesifik, sehingga antigen spesifik tersebut dapat menempel pada bagian dinding lubang mikrotiter selama inkubasi dalam inkubator pada 370 C selama semalam. Dalam penelitian ini peneliti menggunakan 10μg/mL Hbs sebagai antigennya dengan buffer bikarbonat pH 9,6. 2. Langkah pencucian Selanjutnya mikrotiter dibilas untuk membuang antigen yang tidak menempel pada dinding lubang mikrotiter dengan cara mengisi dan mengosongkan sumur dengan buffer fosfat salin netral (PBS) yang mengandung 0,05% Tween 20 sebanyak 4 kali pembilasan. 3. Penambahan Buffer Blocked Buffer blocking yang ideal akan mengikat semua lokasi yang potensial untuk interaksi nonspesifik, buffer blocked efektif meningkatkan sensitivitas assay dengan mengurangi sinyal pengganggu dan meningkatkan rasio signal- to-noise. Tween 20 (0,05%) lebih efektif memblokir daripada protein yang diuji, bovine serum albumin (BSA 2%) merupakan buffer blocking. 4. Penambahan Antibodi Primer Langkah ini melibatkan penambahan pendeteksi antibodi (larutan sampel) yang diarahkan terhadap couting antigen. Larutan sampel yang mengandung antibodi yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang mikrotiter, sehingga terjadi interaksi antara antigen spesifik dengan antibodi yang diinginkan. Antibodi biasanya diencerkan dalam buffer blocked untuk mencegah penempelan protein nonspesifik, peneliti menggunakan larutan 2% BSA-PBS. Kemudian diinkubasi pada suhu 370 C selama satu jam. Selanjutnya, mikrotiter kembali dibilas untuk membuang antibodi yang tidak berinteraksi
  5. 5. dengan antigen spesifik. Peneliti menggunakan 0,05% Tween-PBS sebanyak 4 kali. Gambar 3. Proses pembilasan mikrotiter 5. Penambahan antibodi sekunder (konjugasi enzim antibodi) Langkah selanjutnya adalah penambahan antibodi sekunder, yang diencerkan dalam buffer block dan ditujukan terhadap antibodi primer. Diikuti dengan inkubasi sampai terjadi pengikatan antibodi sekunder dengan enzim- terkonjugasi. Pilihan antibodi enzim konjugasi ditentukan oleh tujuan dari pengujian tersebut. Antibodi tersebut diproduksi terhadap imunoglobulin (Ig) spesies di mana antibodi mendeteksi diproduksi dan disebut konjugasi anti- spesies. Dengan demikian, jika mendeteksi antibodi yang diproduksi pada kelinci, antibodi berlabel enzim akan menjadi anti-kelinci Ig di alam. Ini memungkinkan fleksibilitas yang lebih besar dalam penggunaan konjugat anti- spesies dalam kekhususan yang berbeda dari konjugasi dapat digunakan untuk mendeteksi Ig tertentu yang mengikat dalam pengujian tersebut. Misalnya, konjugat anti-spesies bisa menjadi anti-IgM, IgG1, IgG2 dan sebagainya. Enzim dapat dihubungkan dengan protein seperti streptavidin jika antibodi primer adalah berlabel biotin. Enzim yang paling umum digunakan (HRP) dan alkaline phosphatase (AP). Enzim lain telah digunakan juga, tetapi mereka belum diterima secara luas karena pilihan substrat terbatas. Ini termasuk β- galaktosidase, acetylcholinesterase dan katalase. Dalam penelitian ini, peneliti
  6. 6. menggunakan immunoglobin anti-tikus horseradish peroxidase (HRP) sebagai konjugat antispesiesnya. 6. Langkah pencucian Selanjutnya mikrotiter dibilas lagi untuk membuang antibodi sekunder tertaut enzim signal yang tidak berinteraksi dengan antibodi spesifik dengan buffer fosfat salin netral (PBS) yang mengandung 0,05% Tween 20 sebanyak 4 kali pembilasan. 7. Penambahan substrat Substrat sangat penting untuk deteksi dan visualisasi dalam teknik ELISA. Pada tahap akhir ELISA indirect, ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal, lalu enzim yang tertaut dengan antibodi sekunder spesifik yang telah berinteraksi dengan antibodi yang diinginkan akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi. Langkah ini melibatkan penambahan larutan substrat yang cocok untuk enzim konjugasi antibodi. Tujuannya adalah untuk memungkinkan pengembangan reaksi warna melalui katalisis enzim. Sebuah pilihan substrat yang tersedia untuk melakukan ELISA dengan HRP atau AP konjugasi. TMB (3, 3 ', 5, 5'-tetrametil benzidin) merupakan substrat yang paling umum digunakan untuk horseradish peroksidase enzim (HRP). Substrat dari alkaline phosphatase (AP), 4- Methylumbelliferyl fosfat (MUP) dan pNPP (p Nitro-fenil-fosfat) tidak beracun dan relatif stabil. Dalam penelitian ini peneliti menggunakan substrat TMB (3,3', 5,5'-tetrametil benzidin) Pemilihan substrat tergantung pada sensitivitas uji yang diperlukan dan instrumentasi tersedia untuk sinyal deteksi (spektrofotometer, fluorometer atau luminometer). 8. Larutan penghenti reaksi Reaksi dibiarkan berjalan untuk jangka waktu tertentu setelah reaksi dihentikan dengan mengubah pH sistem. Larutan penghenti digunakan untuk mengakhiri reaksi enzim substrat dalam teknik ELISA setelah mencapai intensitas warna yang diinginkan yang merupakan indikasi dari tingkat analit. Misalnya untuk substrat TMB bereaksi dengan horseradish peroxidase (HRP)
  7. 7. antibodi sekunder terkonjugasi untuk menghasilkan warna biru. Pada penelitian ini reaksi dihentikan oleh 1 M HCl yang diukur pada pembacaan 450 nm. Kuantifikasi Spektrofotometer yang dirancang khusus untuk dapat melalui sumur mikrotiter baik secara tunggal atau dalam baris. Beberapa pembaca plat ELISA yang tersedia, dengan meningkatnya tingkat kecanggihan. Beberapa di antaranya menyediakan pengukuran densitas optik sementara beberapa tabulasi data menerapkan analisis statistik. Kompatibilitas dengan komputer kecil, dan ketersediaan program yang sesuai untuk memproses hasil dan mengubah pembacaan densitas optik ke konsentrasi protein adalah hal-hal tambahan yang penting untuk dicari ketika memilih instrumen. Sebagian besar pembaca ELISA dapat diatur untuk mengukur absorbansi warna yang dihasilkan oleh reaksi enzim-antibodi terkonjugasi pada substrat masing-masing pembaca lempeng yang bekerja dengan sebuah sinar jenis tertentu dari cahaya pada masing-masing sampel dalam lempeng sumur mikro. Mode deteksi yang umum untuk tes lempeng adalah absorbansi, intensitas fluoresensi, luminescence, waktu diselesaikan fluoresensi dan fluoresensi polarisasi. Sebuah sumber cahaya menerangi sampel menggunakan panjang gelombang tertentu (dipilih oleh filter optik, atau monokromator), dan detektor cahaya yang terletak di sisi lain dari langkah-langkah awal (100%) cahaya yang disebarkan melalui sampel, jumlah cahaya yang ditransmisikan biasanya akan berhubungan dengan konsentrasi molekul terikat, ini disebut deteksi penyerapan. Kisaran aplikasi deteksi intensitas fluoresensi jauh lebih luas daripada saat menggunakan deteksi absorbansi, tapi instrumentasi biasanya lebih mahal. Kelemahan metode indirect ELISA Membutuhkan waktu pengujian yang relatif lebih lama daripada ELISA direct karena pada ELISA indirect membutuhkan 2 kali waktu inkubasi yaitu pada saat terjadi interaksi antara antigen spesifik dengan antibodi yang diinginkan dan antara antibodi yang diinginkan dengan antibodi sekunder tertaut enzim signal, sedangkan pada ELISA direct hanya membutuhkan 1 kali waktu inkubasi yaitu
  8. 8. pada saat terjadi interaksi antara antigen yang diinginkan dengan antibodi spesifik tertaut enzim signal. Kelebihan metode indirect ELISA 1. Terdapat berbagai macam variasi antibodi sekunder yang dijual bebas. 2. Immunoreaktivitas dari antibodi yang diinginkan (target) tidak terpengaruh oleh penautan enzim signal ke antibodi sekunder karena penautan dilakukan pada wadah berbeda. 3. Tingkat sensitivitas meningkat karena setiap antibodi yang diinginkan memiliki beberapa epitop yang bisa berinteraksi dengan antibodi sekunder Sandwich ELISA untuk Kuantifikasi HbA2 Teknik ELISA nonkompetitif yaitu yang menggunakan dua antibodi (primer dan sekunder). Pada teknik ELISA nonkompetitif, antibodi kedua (sekunder) akan dikonjugasikan dengan enzim yang berfungsi sebagai signal. Teknik ELISA nonkompetitif ini seringkali disebut sebagai teknik ELISA sandwich. Gambar 4. Gambaran umum teknik Sandwich ELISA Pada dasarnya, prinsip kerja dari ELISA sandwich mirip dengan ELISA direct, hanya saja pada ELISA sandwich, larutan antigen yang diinginkan tidak perlu dipurifikasi. Namun, karena antigen yang diinginkan tersebut harus dapat berinteraksi dengan antibodi primer spesifik dan antibodi sekunder spesifik tertaut enzim signal, maka teknik ELISA sandwich ini cenderung dikhususkan pada antigen yang memiliki minimal 2 sisi antigen (sisi interaksi dengan antibodi) atau antigen yang bersifat multivalent seperti polisakarida atau protein. Pada ELISA sandwich, antibodi primer seringkali disebut sebagai antibodi penangkap,
  9. 9. sedangkan antibodi sekunder seringkali disebut sebagai antibodi deteksi. Dalam pengaplikasiannya, ELISA sandwich lebih banyak dimanfaatkan untuk mendeteksi keberadaan antigen multivalent yang kadarnya sangat rendah pada suatu larutan dengan tingkat kontaminasi tinggi. Hal ini disebabkan ELISA sandwich memiliki tingkat sensitivitas tinggi terhadap antigen yang diinginkan akibat keharusan dari antigen tersebut untuk berinteraksi dengan kedua antibodi. Gambar 5. Diagram skematik kompetitif immuno assay
  10. 10. Gambar 6. Format nonkompetitif immuno assay Tahapan pada Sandwich ELISA : 1. Coating plate ELISA Pada ELISA sandwich, pertama mikrotiter diisi dengan larutan yang mengandung antibodi penangkap, sehingga antibodi penangkap tersebut dapat menempel pada bagian dinding lubang mikrotiter. Dalam penelitian ini antibodi penangkapnya menggunakan anti-HbA2 mAb ThalA2-1 sebanyak 10 μg/ml yang dilarutkan dalam buffer karbonat/bikarbonat pH 9,6 pada suhu 40 C dan didiamkan selama semalam. 2. Tahap pencucian Selanjutnya mikrotiter dibilas untuk membuang antibodi penangkap yang tidak menempel pada dinding lubang mikrotiter dengan cara mengisi dan mengosongkan sumur dengan buffer fosfat salin netral (PBS) yang mengandung 0,05% Tween 20 sebanyak 4 kali pembilasan.
  11. 11. Gambar 7. Proses pencucian plate 3. Penambahan Buffer Blocking Buffer blocking yang ideal akan mengikat semua lokasi yang potensial untuk interaksi nonspesifik, buffer blocked efektif meningkatkan sensitivitas assay dengan mengurangi sinyal pengganggu dan meningkatkan rasio signal- to-noise. Tween 20 (0,05%) lebih efektif memblokir daripada protein yang diuji, bovine serum albumin (BSA 2%) merupakan buffer blocking. Dalam penelitian ini menggunakan BSA 2%. 4. Penambahan larutan antigen Larutan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang mikrotiter, sehingga terjadi interaksi antara antibodi penangkap dengan antigen yang diinginkan. Dalam penelitian ini dengan penambahan HbA2 yang telah dimurnikan dengan konsentrasi dari 3.125 sampai 100 μg/ml yang ada dalam hemolisat sampel. Kemudian diinkubasi selama 1 jam pada suhu 370 C. 5. Tahap pencucian Selanjutnya mikrotiter dibilas untuk membuang antigen yang tidak berinteraksi dengan antibodi penangkap pada dinding lubang mikrotiter dengan cara mengisi dan mengosongkan sumur dengan buffer fosfat salin netral (PBS) yang mengandung 0,05% Tween 20 sebanyak 4 kali pembilasan.
  12. 12. 6. Penambahan Enzim Konjugat Antibodi Lalu, kedalam lubang mikrotiter dimasukkan larutan yang berisi antibodi detektor, sehingga pada lubang mikrotiter tersebut terjadi interaksi antara antigen yang diinginkan dengan antibodi detektor. Dalam penelitian ini menggunakan FITC-conjugated anti-HbA2 mAb ThalA2-2 dengan konsentrasi 10 μg/ml dan diinkubasi pada pada suhu 370 C selama satu jam untuk membiarkan FITC-conjugated yang telah dilabel dengan antibodi berikatan dengan molekul HbA2. 7. Tahapa pencucian Selanjutnya mikrotiter dibilas lagi untuk membuang antibodi detektor yang tidak berinteraksi dengan antibodi spesifik. 8. Penambahan substrat Substrat sangat penting untuk deteksi dan visualisasi dalam teknik ELISA. Pada tahap akhir ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal, lalu enzim yang tertaut dengan antibodi sekunder spesifik yang telah berinteraksi dengan antibodi yang diinginkan akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi. Langkah ini melibatkan penambahan larutan substrat yang cocok untuk enzim konjugasi antibodi. Tujuannya adalah untuk memungkinkan pengembangan reaksi warna melalui katalisis enzim. Sebuah pilihan substrat yang tersedia untuk melakukan ELISA dengan HRP atau AP konjugasi. TMB (3, 3 ', 5, 5'-tetrametil benzidin) merupakan substrat yang paling umum digunakan untuk horseradish peroksidase enzim (HRP). Substrat dari alkaline phosphatase (AP), 4- Methylumbelliferyl fosfat (MUP) dan pNPP (p Nitro-fenil-fosfat) tidak beracun dan relatif stabil. Dalam penelitian ini peneliti menggunakan HRP- conjugated rabbit anti-FITC antibody yang telah ditambahkan kedalam plate dan pewarnaan dengan TMB substrat (3,3', 5,5'-tetrametil benzidin). 9. Penambahan larutan penghenti reaksi Reaksi dibiarkan berjalan untuk jangka waktu tertentu setelah reaksi dihentikan dengan mengubah pH sistem. Larutan penghenti digunakan untuk mengakhiri reaksi enzim substrat dalam teknik ELISA setelah mencapai
  13. 13. intensitas warna yang diinginkan yang merupakan indikasi dari tingkat analit. Pada penelitian ini reaksi dihentikan oleh 1 M HCl yang diukur pada pembacaan 450 nm. Gambar 8. Plate ELISA yang sudah terbetuk warnanya Jumlah HbA2 dalam sampel yang diuji diperoleh dengan menerjemahkan OD 450 nm untuk unit konsentrasi (μg/ml) dengan menggunakan kurva standar yang dikembangkan di plate yang sama. Jumlah relatif HbA2 sebagai persentase dari total Hb (% HbA2) kemudian dihitung menggunakan persamaan berikut : [kadar HbA2 dalam mg/ml] / [Hemoglobin total dalam mg/ml] x 100 Dalam ELISA sandwich, terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi tingkat sensitivitas dari hasil pengujian, antara lain: Banyak molekul antibodi penangkap yang berhasil menempel pada dinding lubang mikrotiter dan Afinitas dari antibodi penangkap dan antibodi detektor terhadap antigen. Sebenarnya, teknik ELISA sandwich ini merupakan pengembangan dari teknik ELISA terdahulu, yaitu ELISA direct. Kelebihan teknik ELISA sandwich ini pada dasarnya berada pada tingkat spesitifitasnya yang relatif lebih tinggi karena antigen yang diinginkan harus dapat berinteraksi dengan 2 jenis antibodi, yaitu antibodi penangkap dan antibodi detektor. Namun demikian, teknik ELISA sandwich ini juga memiliki kelemahan, yaitu teknik ini hanya dapat diaplikasikan untuk mendeteksi antigen yang bersifat
  14. 14. multivalent serta sulitnya mencari dua jenis antibodi yang dapat berinteraksi antigen yang sama pada sisi antigenic yang berbeda (epitopnya harus berbeda). Interpretasi Kurva ELISA Grafik diatas menunjukkan bahwa konsentrasi suatu sampel akan berbanding terbalik dengan banyaknya jumlah antibodi yang terikat.
  15. 15. Hasil Produksi dan karakterisasi mAbs menjadi HbA2 Untuk mengubah mAbs menjadi HbA2, dua tikus Balb/c diimunisasi dengan HbA2 yang telah dimurnikan dengan interval 2 minggu. Setelah imunisasi ketiga, respon antibodi poliklonal untuk HbA2 di kedua tikus itu cukup kuat (titer [1:32,000). Seekor tikus dipilih untuk generasi hibridoma. Supernatan budaya hyrbidomas yang dihasilkan diuji dengan indirect ELISA menggunakan berbagai jenis Hbs sebagai antigen. Dua klon hibridoma menghasilkan antibodi yang dapat mengenali HbA2 tapi tidak untuk Hbs. Kedua mAbs yang isotipe dengan IgG1. Hasilnya menunjukkan bahwa mAbs ThalA2-1 dan ThalA2-2 khusus bereaksi terhadap HbA2 dan dapat digunakan untuk membangun ELISA untuk kuantifikasi HbA2. Pengembangan sandwich ELISA untuk kuantisasi HbA2 Sebagai tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengembangkan ELISA yang efektif untuk kuantifikasi HbA2, jenis ELISA terpilih menjadi sistem assay. Dengan diproduksinya mAbs anti-HbA2, sandwich ELISA telah berhasil dikembangkan. Anti-HbA2 mAb ThalA2-1 digunakan sebagai antibodi pertama untuk lapisan plate sebagai penangkap molekul HbA2 dalam sampel. Yang kedua anti-HbA2 mAb ThalA2-2 yang berlabel dengan FITC digunakan untuk mendeteksi HbA2 yang terikat. HRP conjugate ditambahkan ke sistem untuk mendeteksi pengikatan antibodi FITCl ke plate. Dengan sistem ini, kurva standar mendeteksi HbA2 dalam kisaran 3,125-100 μg/ml mengikuti hukum Beer dengan OD 450 nm berkisar 0,191-1,732 diperoleh gambar dibawah ini. Kekhasan sandwich ELISA divalidasi menggunakan ELISA yang dikembangkan untuk mengukur berbagai jenis Hbs. Hanya HbA2 yang dapat dideteksi oleh ELISA.
  16. 16. Penilaian keandalan tingkat HbA2 ditentukan oleh sandwich dikembangkan ELISA ELISA yang dikembangkan telah digunakan untuk penentuan kadar HbA2 yang terdapat di hemolysates diperoleh dari berbagai penelitian. Analisis hubungan jelas menunjukkan bahwa kadar HbA2 ditentukan oleh sandwich ELISA berkorelasi sangat baik dengan yang ditentukan oleh metode HPLC. Untuk memanfaatkan tingkat HbA2 untuk diagnosis thalassemia, cut-off poin dari tingkat HbA2 dibuat dari nilai-nilai pada batas 2SD, yang berkisar masing-masing 2,5 dan 4,0% untuk sandwich ELISA dan HPLC. Sandwich ELISA yang dikembangkan mampu mengukur kadar HbA2 dalam HbE-bearing (HbE sifat dan homozigot HbE), yang tidak bisa dilakukan oleh HPLC konvensional. ELISA yang dikembangkan kemudian diterapkan dalam penentuan tingkat HbA2 di diketahui sampel darah rutin dan diagnosis yang diperoleh kemudian dibandingkan dengan yang dihasilkan dengan metode HPLC. Analisis dari 112 sampel darah rutin menunjukkan bahwa teknik ELISA yang dikembangkan memiliki kapasitas yang sebanding untuk mendeteksi heterozigot β-thalassemia dengan teknik HPLC dengan sensitivitas 100%, 95% spesifisitas, akurasi 95%, nilai prediksi 82,3% positif dan 100% nilai prediksi negatif .
  17. 17. Sebagai kesimpulan, penelitian ini telah berhasil mengembangkan ELISA sandwich untuk kuantifikasi HbA2. Teknik ini sederhana, cepat dan dapat digunakan untuk mengidentifikasi operator β-thalassemia. Oleh karena itu dapat diadaptasi untuk skrining skala besar untuk β -thalassemia di daerah endemik. Dengan demikian, peneliti mendorong penggunaan strategi ini dalam penyaringan untuk β -thalassemia di negara-negara yang memiliki keterbatasan sumber daya. Referensi Graphad Prism. 2003. Step-by-Step Examples Nonlinear Standard Curves: RIA and ELISA. Graphad software. San Diego, CA. Ibrahim A. Darwish. 2006. Immunoassay Methods and their Applications in Pharmaceutical Analysis: Basic Methodology and Recent Advances. International journal of Biomedical science. vol. 2 no. 3 september 2006. Kuntaruk, Surakit; Thanusak Tatu; Tiemjan Keowkarnkah et al. 2010. Sandwich ELISA for hemoglobin A2 quantification and identification of β- thalassemia carriers. Hematol journal. DOI 10.1007/s12185-009-0490-3. SeraCare. 2013. Technical Guide for ELISA (Protocols & Troubleshooting). 800- 638-3167: www.kpl.com Yang and Ma. 2009. Western Blotting and ELISA Techniques. Sciencepub journal. 1(2):67-86.

×