1. AGROBIOTECNOLOGÍA
Biotecnología Vegetal
Programa de Biotecnología
para América Latina y el Caribe
Universidad de las Naciones Unidas
Instituto de Ingeniería Genética y Biología Molecular
(INGEBI)
Ma. Mercedes Rivero
http://www.unesco.org/unuoe/unuesp/centros/biolac.htm
2. Biotecnología Vegetal
• Cultivo in vitro de células, tejidos y órganos
• micropropagación
• mejoramiento de plantas
• producción de compuestos de interés comercial
producción de metabolitos secundarios
producción de proteínas
producción de polímeros biodegradables
• establecimiento de plantas transgénicas
plantas resistentes a virus
plantas con rutas metabólicas modificadas
plantas mejoradas en cuanto a composición de
proteínas, aceites, etc.
• fitorremediación
remoción de xenobióticos
remoción de metales pesados
3. Agrobiotecnología
Cultivo de tejidos
vegetales
Sumario Técnicas del cultivo de células y tejidos vegetales
Micropropagación vegetal
Consideraciones técnicas de la propagación
clonal masiva de plantas
Etapas del cultivo in vitro de plantas superiores
Vías morfogenéticas: organogénesis y embriogénesis
Sistemas de micropropagación vegetal
Referencias
Alcances de la propagación clonal masiva de plantas
4. Técnicas del cultivo de células
y tejidos vegetales
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidos
vegetales
5. • Existen tres conceptos básicos que
fundamentan el cultivo in vitro de células y
tejidos vegetales:
- Totipotencialidad celular
- Desdiferenciación / Rediferenciación
- Balance de reguladores del crecimiento
vegetal
Principales
conceptos
fisiológicos
aplicables a los
cultivos in vitro
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidos
vegetales
6. • La teoría de la totipotencialidad celular, enunciada
por Haberlandt a principios del siglo veinte, postula que toda
célula vegetal individual es capaz de regenerar una planta
entera a partir de un cultivo in vitro sin importar el grado de
diferenciación alcanzado. Para ello se requieren condiciones
específicas referidas al medio del cultivo, relaciones
hormonales, temperatura, fotoperíodo, etc.
• La desdiferenciación consiste en la transformación y
pérdida de las características de especialización de un tipo
celular para dar lugar a células de tipo meristemático. El
siguiente paso involucrado en la regeneración de una planta
es la rediferenciación de las células previamente
desdiferenciadas.
• Todo proceso de diferenciación está regulado por el balance
entre diferentes tipos de reguladores del crecimiento,
fundamentalmente de auxinas y citocininas.
Fundamentos
teóricos y
prácticos del
cultivo de
tejidos
vegetales
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidos
vegetales
7. • Micropropagación vegetal
• Regeneración de plantas
(embriogénesis y organogénesis)
• Cultivo de meristemos
• Cultivo de suspensiones de células vegetales
• Cultivo de protoplastos
• Cultivo de anteras
• Cultivo de óvulos y embriones
Técnicas
del cultivo
de células
y tejidos
vegetales
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidos
vegetales
9. • La micropropagación vegetal, o propagación clonal
masiva de plantas superiores, posibilita la obtención
y cultivo de plantas a gran escala.
• Se realiza bajo estrictas condiciones de esterilidad en
un medio sintético nutritivo y con control de temperatura,
luz y fotoperíodo.
La
micropropagación
constituye la
principal aplicación
comercial del
cultivo de tejidos
vegetales
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidos
vegetales
10. Consideraciones técnicas de la propagación
clonal masiva de plantas
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidos
vegetales
11. • Laboratorio
- Area de preparación de medios.
- Area de lavado y esterilización.
- Cuarto estéril.
- Cámara de cultivo.
- Area de rusticación.
• Material vegetal
- Plantas madres seleccionadas
(pre-acondicionamiento).
- Explantes (elección, disección,
esterilización, etc.).
• Condiciones de cultivo
- Asepsia.
- Recipientes.
- Temperatura.
- Luz y fotoperíodo.
La
micropropagación
vegetal requiere
disponer de una
infraestructura
mínima
especializada
y de condiciones
controladas
de cultivo
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidos
vegetales
12. Compuestos inorgánicos
Macronutrientes: NO3
-
, PO4
3-
, K+
, Ca2+
,
Mg2+
, SO4
2-
Micronutrientes: Fe2+
, Cu2+
, Zn+
, Mn2+
,
Mo2+
, Co2+
, I-
Carbohidratos
Sacarosa, glucosa, mio-inositol
Vitaminas
Tiamina (B1)
Piridoxina
Acido nicotínico (C)
Biotina
Aminoácidos
Glicina
Reguladores del crecimiento
Auxinas
Citocininas
Giberelinas
Soporte inerte (medios semisólidos)
Agar (0,7 a 1%)
Gelrite®
pH
5,6 – 5,8
Esterilización
1 atmósfera, 15 a 20 minutos en autoclave
Medios de cultivo: composición general
13. • Soluciones concentradas de macroelementos (100x)
• Soluciones concentradas de microelementos (100x)
• Vitaminas grupo B (500 ó 1000x)
• Mio-inositol (100 mg/L)
• Azúcares: Generalmente sacarosa o glucosa
en concentraciones de aproximadamente 30 g/L.
• Agar-agar: hidrato de carbono de alto peso
molecular extraído a partir de algas. Se usa entre
5 y 10 g/L
Formulación
básica
de un medio
de cultivo
para tejidos
vegetales
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidos
vegetales
14. • El metabolismo de los tejidos puede modificarse
dependiendo de las características del medio de cultivo
(líquido o semi-sólido).
• En el caso de un medio sólido, la concentración y calidad
del agar pueden tener importantes efectos en el desarrollo
del cultivo (hiperhidricidad, crecimiento lento, etc.).
• El cultivo en medio líquido resulta imprescindible cuando
la propagación in vitro es desarrollada a través
de las siguientes vías:
- Inducción de embriogénesis*.
- Cultivo de protoplastos.
- Cultivo de suspensiones celulares.
*también en medio semisólido
Consistencia
del medio
Semisólido
Líquido
Propiedades
físicas
de los medios
de cultivo
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidos
vegetales
15. • Intercambio gaseoso:
Los recipientes de cultivo se tapan con una película de
polietieleno (Resinite®
) para posibilitar el intercambio de
gases. La organogénesis puede verse modificada
si el intercambio de gases se ve dificultado.
- La inducción de yemas a partir de callos
de tabaco se reduce si no hay suficiente oxígeno.
- La acumulación de etileno puede inhibir
la regeneración de brotes.
• pH:
- Constituye un factor crítico.
- Se ajusta en el rango 5,5 – 5,8.
- Se modifica durante el crecimiento de los cultivos.
Propiedades
físicas
de los medios
de cultivo
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidos
vegetales
19. • Grupos básicos de reguladores del crecimiento:
- Auxinas
- Citocininas
- Giberelinas
- Acido abscísico
- Etileno
• Generalidades:
- Actúan a bajas concentraciones
- Interactúan unos con otros (los resultados
están determinados por las concentraciones
relativas entre las diferentes fitohormonas).
- Los reguladores endógenos del crecimiento
están presentes en la planta durante todo
su ciclo de vida pero su concentración fluctúa.
Su concentración relativa varía en función
del estado fisiológico de la planta y en cada
uno de los órganos de ésta.
- Están involucrados en numerosos procesos
fisiológicos.
Reguladores
del crecimiento
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidos
vegetales
20. • Las auxinas fueron descubiertas entre 1933 y 1935 a partir
de bioensayos realizados para caracterizar el mensajero
químico responsable de la elongación y de la respuesta
fototrópica del coleóptilo de gramíneas.
- Alargamiento y división celular
- Crecimiento de secciones de hojas, tallos y frutos
- Formación de raíces adventicias
- Dominancia apical
- Acción herbicida
- Estimulación de la producción de etileno
• Se sintetizan en las yemas, las hojas jóvenes, los frutos y
en el embrión. La concentración endógena en la planta varía
entre 0,001 y 0,1 mg·Kg-1
.
• Su transporte es polar
• Auxinas sintéticas:
- Acido indol butírico (IBA)
- Acido naftalen acético (ANA)
- 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D)
N
OH
O
Acido indol acético (AIA)
(auxina endógena)
Auxinas: estos
compuestos se
emplean
básicamente
como
promotores de
la proliferación
celular y la
inducción de la
morfogénesis
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidos
vegetales
21. • Fueron descubiertas en 1955 estudiando sustancias
promotoras de la división celular in vitro.
• Están involucradas en variadas respuestas fisiológicas:
- Promoción de la división celular
- Promoción de la organogénesis (relación
auxinas/citocininas)
- Retardo de la senescencia
- Síntesis de clorofila y desarrollo de cloroplastos
• Citocininas endógenas:
- Zeatina (Zea)
- Isopenteniladenina (2iP)
• Citocininas sintéticas:
- Cinetina (Kin)
- Benziladenina (BAP)
• Se sintetizan en el embrión y las raíces; se encuentran
en todos los tejidos. La concentración endógena en
plantas varía entre 0,1 y 500 µg·Kg-1
.
• Su transporte es no polar.
Citocininas: en
combinación
con las auxinas,
determinan
diferentes
respuestas
morfogenéticas
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidos
vegetales
23. • Aisladas del hongo Gibberella fujikuroi, a partir de plantas de arroz
infectadas. Estas plantas presentaban marcada clorosis y largos
entrenudos. Los primeros ensayos se llevaron a cabo usando
extractos solubles del hongo.
• El ácido giberélico (GA3) fue la primera giberelina identificada. En
la actualidad se conocen alrededor de 50 diferentes giberelinas.
• Algunos efectos mediados por las giberelinas son:
- Promoción del crecimiento en plantas de genotipos enanos
o plantas bianuales
- Crecimiento de yemas latentes
- Germinación de semillas en dormancia
- Floración
- Movilización de reservas en la semilla.
• Se sintetizan en hojas jóvenes, yemas y en el embrión.
• Su transporte no es polar.
Acido giberélico (GA3)
Las giberelinas
se utilizan para
favorecer el
crecimiento y el
alargamiento de
los entrenudos
de los brotes
de novo
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidos
vegetales
24. Etapas del cultivo in vitro
de plantas superiores
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidos
vegetales
25. • Iniciación
- Elección y fitoacondicionamiento de la planta madre
- Elección del explante inicial y de la formulación
del medio de cultivo
- Desinfección superficial de los explantes
- Establecimiento del cultivo in vitro
• Multiplicación
- Multiplicación del material stock
• Enraizamiento
- Enraizamiento de los brotes obtenidos in vitro
• Rusticación
- Pasaje de las plantas crecidas in vitro a las condiciones
de maceta o a campo
Etapas de la
micropropagación
vegetal
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidos
vegetales
26. • Posibles vías morfogenéticas:
- Organogénesis
- Embriogénesis
• Diferencias entre las dos posibles vías:
- La organogénesis es de origen pluricelular. Un grupo o
cluster de células del explante inicial se desdiferencía
inicialmente para luego rediferenciarse dando lugar a un
órgano vegetal. No se obtienen por esta vía plantas completas
directamente.
- La embriogénesis se presupone de origen unicelular.
Una célula del explante se aísla y constituye el punto
de partida para la obtención de un embrión somático.
Se diferencian embriones o estructuras bipolares
que completan cada una de las etapas implicadas
en la ontogenia de un embrión cigótico. El resultado es
una planta completa.
Existen dos
posibles vías
morfogenéticas
implicadas en la
diferenciación
de novo
de brotes y/o
plantas
completas
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidos
vegetales
27. Elección de una planta
madre selecta
Explantes
Desinfección superficial
Establecimiento en medio
de cultivo apropiado
Transferencia a un
medio de
multiplicación
Formación de
brotes o embrioides
Transferencia a un medio
para el enraizamiento de
los brotes
Pasaje a maceta en
un invernadero
ETAPA 1
ETAPA 2
ETAPA 3
ETAPA 4
Etapas implicadas
en el protocolo de
micropropagación
de una especie
vegetal
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidos
vegetales
29. Protocolo tipo de esterilización superficial
de material vegetal:
- Etanol 70%, entre 5 y 10 segundos.
- Solución de hipoclorito de sodio (NaCIO)
al 5 a 20%, entre 5 y 30 min
Este paso puede ser reemplazado por el uso
de soluciones diluídas de bicloruro de mercurio
(HgCl2), entre el 0,01 y 0,05%.
- Enjuagues con abundante agua estéril
(4 ó 5 veces).
- En el caso del HgCl2, el material se debe
enjuagar sucesivas veces pues es difícil
de eliminar.
Los explantes
deben ser
esterilizados
antes de ser
establecidos
en condiciones
de cultivo
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidos
vegetales
35. Sistemas de micropropagación vegetal
Proliferación de yemas axilares o apicales
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidos
vegetales
36. • Proliferación de yemas apicales o axilares
- Consiste en la multiplicación de plantas a partir
de las yemas axilares preexistentes.
Representa la aceleración in vitro del crecimiento
natural de dichos meristemos.
- La tasa de multiplicación (t.m.) se calcula con
base en el número de brotes o vástagos obtenidos
a partir de un explante inicial, entre una resiembra
y otra sucesiva. Esta tasa puede variar entre 2 y 20
brotes por mes, dependiendo de la especie
en cuestión, entre otras variables.
- Por ejemplo, con una t.m. de 5/mes podrían
obtenerse 10.000.000 plantas en un solo año,
a partir de una única yema inicial.
- El cultivo de meristemos es un caso especial
del uso de esta técnica.
Propagación
vegetativa a
partir de yemas
preexistentes
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidos
vegetales
37.
38. Sistemas de micropropagación vegetal
Proliferación de tejidos desdiferenciados
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidos
vegetales
39. • Consideraciones generales:
- Callo: masa de células desdiferenciadas
obtenidas a partir de un explante cultivado
in vitro (disco de hoja, meristemo,
células en suspensión, etc.)
- Es posible regenerar brotes o vástagos a partir
de estos callos.
- Las plantas diferenciadas pueden
no ser uniformes, debido al posible desarrollo
de variantes somaclonales. Esto debe tenerse
en cuenta, especialmente cuando se trabaja en
propagación clonal a gran escala.
Resulta posible
regenerar brotes
o yemas a partir
de tejidos
vegetales
desdiferenciados
in vitro
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidos
vegetales
44. • Posibilitan la micropropagación de diferentes especies
vegetales.
• Constituyen el explante ideal para liberar de patógenos in
vitro a plantas infectadas por virus, hongos y/o bacterias.
• Son ampliamente utilizados como explantes para la
criopreservación y conservación de germoplasma.
Los meristemos
son grupos de
células
indiferenciadas
que retienen
la capacidad de
dividirse
durante todo el
ciclo de vida de
una planta
Los meristemos determinan el crecimiento de
la planta y dan origen a sus diferentes
órganos
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidos
vegetales
45. • Meristemos apicales
- Están localizados en la porción terminal o distal del vástago
y de la raíz.
- Sus divisiones dan lugar a las células de los tejidos
pimarios del tallo y la raíz.
- Son organogénicos.
- Determinan el crecimiento en largo de tallos y raíces.
• Meristemos secundarios
- Determinan el crecimiento radial de los órganos vegetales.
- Dan lugar a los tejidos de conducción.
• Meristemos florales
- Derivan de la transformación de meristemos apicales.
- Se limitan a la producción de órganos florales.
• Meristemos intercalares
- En el curso del desarrollo de la planta, persisten restos
de los meristemos apicales intercalados en los tejidos maduros.
- Determinan el crecimiento en largo de tallos y raíces
En el cuerpo
de una planta
se reconocen
diferentes tipos
de meristemas
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Cultivo de tejidos
vegetales
46. Cultivo de meristemasEl empleo
de los meristemos
como explantes
del cultivo in vitro
constituye
una posible
herramienta para
el saneamiento de
plantas infectadas
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidos
vegetales
47. - El domo meristemático no está vascularizado
(muchos patógenos se translocan por los tejidos
de conducción).
- El número de partículas virales es menor
en los meristemos que en otros tejidos (White, 1934).
- La velocidad de división celular a nivel del meristema
es mayor que la velocidad de replicación de un virus.
- Las primeras plantas saneadas a partir del cultivo
de meristemos fueron obtenidas por Morel y Martin
entre 1952 y 1957 a partir de cultivos de papa y
Dahlia.
El cultivo de
meristemos
facilita la
eliminación de
patógenos
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Cultivo de tejidos
vegetales
48. Asp • Equipamiento
- Elementos generales para cultivo in vitro.
- Lupa estereoscópica.
- Instrumental de disección.
• Etapas del cultivo
- Elección del explante: escencialmente meristemos apicales
de vástago. Domo meristemático desnudo o acompañado
por 2 ó 3 pares de primordios foliares.
Tamaño aproximado 0,5 mm.
- Esterilización de la yema o porción apical del vástago
conteniendo al meristemo propiamente dicho.
- Disección del meristemo bajo lupa. Eliminación
de las primeras hojas.
- Transferencia del explante al medio de cultivo semi-sólido.
- Regeneración de yemas axilares. Subcultivo a medio
sin hormonas para la obtención de plantas completas.
- Propagación del material (a partir de estacas uninodales, etc.)
- Rusticación.
Aspectos
técnicos
del cultivo
de meristemas
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidos
vegetales
49. • La eficiencia del cultivo de meristemos como
procedimiento para la obtención de plantas sanas
dependerá del tamaño del explante.
• Existe una situación de compromiso entre el tamaño
mínimo posible del meristemo y su capacidad de
desarrollar y prosperar durante el cultivo in vitro.
Ejemplos prácticos:
- Frutilla (Fragaria sp) / ¿patógeno?:
Explantes de 0,22 mm; 100% de plantas sanas.
- Papa (Solanum tuberosum) / Potato virus X:
Explantes de 0,1 mm (o menor); 10% de plantas
sanas. Si el explante incluye 2 pares de primordios
el % de plantas sanas es menor.
- Papa (Solanum tuberosum) / Potato virus Y o V:
Se obtienen altas eficiencias de saneamiento
cultivando explantes de no más de 2 pares
de primordios foliares.
Consideraciones
prácticas sobre
el cultivo de
meristemos
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Cultivo de tejidos
vegetales
50. • Propagación vegetativa rápida y a gran escala
• Uniformidad seleccionada del material clonado
• Multiplicación de plantas recalcitrantes
a las técnicas convencionales
• Reducción en el tiempo de multiplicación
y en el espacio requerido para tal fin
• Mayor control sobre la sanidad del material
propagado
• Introducción rápida de nuevos cultivares
• Conservación de germoplasma
• Facilidades para el intercambio internacional
de material vegetal
Alcances de la
micropropagación
vegetal
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Cultivo de tejidos
vegetales
