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Western blot

  1. 1. Western blotEl Western blot, o inmunoblot, es una técnica analítica usada para detectar proteínasespecíficas en una muestra determinada (una mezcla compleja de proteínas, como unextracto tisular). Mediante una electroforesis en gel se separan las proteínas atendiendoal criterio que se desee: peso molecular, estructura, hidrofobicidad, etc. Hay casi tantasposibilidades como tipos de electroforesis existen. Luego son transferidas a unamembrana adsorbente (típicamente de nitrocelulosa o de PVDF) para poder buscar laproteína de interés con anticuerpos específicos contra ella.[1] [2] Finalmente, se detecta launión antígeno-anticuerpo por actividad enzimática, fluorescencia... De esta forma sepuede estudiar la presencia de la proteína en el extracto y analizar su cantidad relativarespecto a otras proteínas.Esta técnica es hoy en día imprescindible en varios campos de la biología, como labiología molecular, la bioquímica, la biotecnología o la inmunología. Existe toda unaindustria especializada en la venta de anticuerpos (monoclonales y policlonales) contradecenas de miles de proteínas diferentes.[3] [4]El Western blot fue desarrollado en el laboratorio de George Stark, en la Universidad deStanford.[2] El nombre (Western, occidental en inglés) le fue dado por W. NealBurnette,[5] y consiste en un juego de palabras con una técnica análoga pero que usaDNA, el Southern (sureño) blot, que en este caso debe su nombre a su descubridor,Edwin Southern. Otras técnicas que fueron nombradas siguiendo este criterio son elNorthern blot (en el que se separa e identifica RNA), el Eastern blot, el Southwesternblot.AntecedentesAntes de la aparición del Western blot, ya existían diversas técnicas capaces de detectarun antígeno determinado en una muestra, como la inmunoelectroforesis, lainmunodifusión doble de Ouchterlony, la inmunoprecipitación...La aparición del Western no fue posible hasta la aparición de las membranas. En 1975,Edwin Southern demostró que la nitrocelulosa era capaz de capturar ácidos nucleicosseparados previamente por electroforesis. De esta forma, se permitía el análisis de unamezcla compleja de moléculas de ADN, como un genoma tratado con enzimas derestricción.[6] Se desarrolló así el Southern blot, usando el nombre del descubridor comoepónimo; es por ello que tanto esta técnica como sus derivadas (Western blot, Northernblot...) se escriben con mayúscula.Más tarde, Towbin (1979) y Burnette (1981) demostraron que también era capaz deunirse a proteínas. Ya en 1986, Millipore desarrolló la primera membrana de PVDFdiseñada para la transferencia de proteínas, la membrana de transferencia ImmobilonTMPVDF. Porteriormente fue llamada membrana de transferencia Immobilon-PTM paradiferenciarse de otras membranas.
  2. 2. Pasos del Western blotPreparación de la muestraLas muestras pueden ser tomadas de un tejido entero o de un cultivo celular: Una pequeña cantidad del tejido se introduce en un buffer de extracción. Después se procede a homogeneizarlos, sea con una licuadora (para grandes volúmenes de muestra), con un homogenizador (para muestras pequeñas) o por sonicación. Por último se centrifuga para obtener las proteínas en el sobrenadante, la fracción no precipitada.[7] Las células pueden lisarse por uno de esos métodos mecánicos. También pueden usarse detergentes, sales o tampones que favorezcan la lisis y solubilicen las proteínas. A veces se añaden inhibidores de proteasas y fosfatasas que evitan la digestión por las enzimas celulares de las proteínas y de las fosfoproteínas, respectivamente.[8]Los materiales deben estar a bajas temperaturas (~4 °C) para evitar la desnaturalizaciónproteica. Para separar proteínas de compartimentos y orgánulos celulares es precisocombinar técnicas mecánicas - como filtraciones y centrifugaciones - y bioquímicas.Electroforesis en gelArtículo principal: Electroforesis en gelLas proteínas de la muestra serán separadas mediante una electroforesis en gel enfunción de uno o varios (en las electroforesis bidimensionales) de estos criterios: puntoisoeléctrico, peso molecular y carga eléctrica. La naturaleza de la separación dependedel tratamiento de la muestra y de la naturaleza del gel.La electroforesis en gel más frecuente, conocida como SDS-PAGE, hace uso de gel depoliacrilamida y de tampón con dodecilsulfato (SDS). En esta técnica las proteínassufren un tratamiento por agentes reductores que provocan la pérdida de las estructurassecundaria y terciaria (por ejemplo, reduciendo los puentes disulfuro (S-S) a grupos tiol(SH + SH)) y mantiene los polipéptidos en este estado desnaturalizado. De este modo,la estructura tridimensional de las proteínas no influye en la electroforesis, y puedensepararse únicamente en función del tamaño.
  3. 3. [editar] TransferenciaPara que las proteínas sean accesibles a la detección por anticuerpos, se las transfieredesde el gel de poliacrilamida a una membrana de nitrocelulosa o de PVDF. Estatransferencia puede realizarse por difusión, por vacío o por acción de un campoeléctrico (electrotransferencia).Las membranas que se emplean en el Western blot se caracterizan por su capacidad deunir proteínas de forma inespecífica (es decir, se adhieren a todas las proteínas conidéntica afinidad): las membranas de nitrocelulosa, aunque no se conoce exactamente la naturaleza de las interacciones membrana - proteína, se sabe con cierta seguridad que se trata de interacciones no covalentes de naturaleza hidrófóba. en las membranas de PVDF, la unión está basada en interacciones hidrofóbicas y de dipolos entre la membrana y las proteínas. Como particularidad, deben ser humedecidas con metanol o etanol antes de exponerlas a tampones acuosos, debido a su alta hidrofobicidad y a la ausencia de surfactantes.Las membranas de nitrocelulosa son más baratas que las de PVDF, aunque son tambiénmás frágiles, tienden a tornarse quebradizas cuando se secan y no pueden ser sometidasa varias pruebas consecutivas.[9]También pueden usarse otros soportes, como las membranas de nylon o el papelactivado. Sin embargo, no son tan usados como los anteriores.Difusión simpleEn la transferencia por difusión simple se ponen en contacto las superficies del gelelectroforético y de la membrana y, sobre ésta, se dispone un taco de papeles de filtro.Con el fin de facilitar el proceso, puede ponerse encima una placa de vidrio y un objetopesado. Este montaje se coloca sobre un tampón, que ascenderá por capilaridad hacia elpapel de filtro arrastrando consigo las proteínas. Al llegar a la membrana, quedaránretenidas en ella.Este protocolo no está muy extendido actualmente, puesto que la cantidad de proteínatransferida a la membrana es muy baja, mucho menor que con la electrotransferencia.
  4. 4. Sin embargo, ha ganado cierta popularidad por una modificación que permite obtenermúltiples transferencias de un mismo gel, permitiendo de esta forma realizar variaspruebas sobre geles virtualmente idénticos. Esta modificación es viable cuando no esnecesaria una transferencia cuantitativa de proteína.[10] [11]Transferencia al vacíoEn esta técnica, se añade el poder de succión de una bomba conectada a un sistema desecado de planchas de gel, el cual lleva las proteínas desde el gel hasta la superficie dela membrana de nitrocelulosa.[12] Este método es válido tanto para proteínas de altocomo de bajo peso molecular.[11]ElectrotransferenciaEste método se basa en una corriente eléctrica y un tampón de transferencia para llevarlas proteínas desde el gel hacia la membrana. Para ello, se apilan en el orden descrito lossiguientes elementos (del polo negativo o cátodo al positivo o ánodo): esponja, variospapeles de filtro empapados en buffer de transferencia, gel, membrana, más papeles defiltro empapados y otra esponja. Este montaje, llamado coloquialmente sandwich, sedispone en el sistema de transferencia y se aplica una corriente eléctrica, de magnitudacorde a los materiales empleados, al tiempo disponible,... Las proteínas del gel sedesplazan hacia el polo positivo y quedan atrapadas por la membrana.[1]Tras la transferencia, se suele proceder a la tinción del gel con Coomassie Brilliant Blue(un colorante de proteínas) para comprobar que en efecto una parte importante delmaterial proteico ha pasado a la membrana.La electrotransferencia es hoy en día la técnica de transferencia más usada gracias a lavelocidad del proceso y al elevado porcentaje de proteína que se transfiere(especialmente en comparación con las otras técnicas).BloqueoPuesto que la membrana escogida necesita poder unirse proteínas de forma inespecífica,es preciso bloquear los lugares de unión que han quedado libres tras la transferencia. Encaso contrario, el anticuerpo (de naturaleza proteica) empleado en la detección puede
  5. 5. unirse a ellos, dificultando la distinción del complejo antígeno-antígeno que se formacon la proteína que se busca.En el bloqueo se incuba la membrana con una solución de proteínas, típicamente dealbúmina de suero bovino o ASB (más conocida por sus siglas en inglés, BSA), leche enpolvo o caseína, con una diminuta fracción de detergente, como Tween 20 o Tritón X-100. Las proteínas en solución se unirán a todos aquellos lugares de unión de lamembrana que no estén ya ocupados por las transferidas desde el gel. De este modo, elanticuerpo sólo podrá unirse a su antígeno específico, reduciendo así el ruido de fondo ylos falsos positivos.DetecciónEn la detección se comprueba la presencia en la membrana de una determinada proteína.Para ello se emplea un anticuerpo específico contra ella unido a enzima que, enpresencia de su sustrato, catalice una reacción colorimétrica (produce color). De estaforma, se hace patente la unión con el antígeno, la proteína, así como su localización.El proceso tradicionalmente se ha realizado en dos pasos, aunque ahora es posible ladetección en un único paso, lo cual es útil en ciertos campos.Método en dos pasosLos dos pasos de los que consta este método de detección son la unión del anticuerpoprimario y la del anticuerpo secundario.¡ Anticuerpo primarioEl primer paso es permitir la unión de un anticuerpo primario contra la proteínabuscada. Éste se consigue inoculando dicha proteína o uno de sus epítopos (regionescapaces de desencadenar la respuesta inmune) a un animal (como un conejo o unacabra) o a un cultivo celular. Además, como la proteína se ha desnaturalizado durante laelectroforesis en gel, es preciso que el anticuerpo reconozca específicamente la proteínadesnaturalizada. La presencia del elemento extraño debería desencadenar una respuestainmune cuyo resultado incluya la producción del anticuerpo, primario en este caso, yaque reconoce la proteína.
  6. 6. Así pues, tras el bloqueo se incuba en agitación moderada la membrana con unadisolución de anticuerpo primario (0,5 - 5 μg/ml). La disolución consiste en un tampónsalino, con cloruro de sodio por lo general, con un pH cercano a la neutralidad, unapequeña fracción de detergente y, en ocasiones, proteínas disueltas, como ASB o lecheen polvo. La membrana junto con la disolución pueden ser introducidas en una pequeñabolsa de plástico. Esta incubación puede durar desde 30 minutos a una noche entera. Latemperatura a la que puede tener lugar es igualmente variada; en general, las elevadastemperaturas favorecen las uniones más específicas.¡ Anticuerpo secundarioTras lavar la membrana para eliminar el anticuerpo primario que no se ha unido, seexpone al anticuerpo secundario. Éste reconoce de forma específica una región concretadel anticuerpo primario. Suelen estar marcados para ser detectables (unión a biotina, auna enzima reporter como laa fosfatasa alcalina o la peroxidasa del rábano (HRP), etc.).Varios de estos anticuerpos se unirán a cada anticuerpo primario, amplificando la señal.Los anticuerpos secundarios proceden de animales o de cultivos de hibridomas deorigen animal. Por ejemplo, un anticuerpo secundario "anti-ratón" es aquel capaz dereconoces casi todos los anticuerpos primarios obtenidos de ratones. Igualmente hayanticuerpos "anti-cabra", "anti-conejo"... Su uso presenta ciertas ventajas: económicas,por permitir a un laboratorio compartir una única fuente de anticuerpos secundarios; ydan resultados mucho más consistentes.También pueden emplearse proteínas no anticuerpos, como las proteínas A y G.RadiactividadUnión del anticuerpo primario a la proteína de interés. A este se une la proteína A o laproteína G para ser detectada.Es una alternativa al uso de anticuerpos secundarios que consiste en proteínas de unióna anticuerpos marcadas radiactivamente. Esta proteína puede ser, por ejemplo, laproteína A de Staphylococcus aureus[13] o la proteína G[14] marcadas con 125I (un isótoporadiactivo de yodo). Las proteínas mencionadas tienen la capacidad de unirse aanticuerpos de forma inespecífica, por lo que se unirán al primario.
  7. 7. Este método apenas se usa actualmente, por ser significativamente más caro, peligroso ylento que los otros. Sin embargo, presenta ventajas: es muy sensible, da bandas quepermiten una precisa cuantificación; y la imagen autoradiográfica puede ser reproducidafácilmente y con gran precisión para su publicación.[11]Anticuerpo unido a una enzimaAnticuerpo secundario unido a la peroxidasa de rábano, de modo que puede catalizar lareacción quimioluminiscente.Un mecanismo de detección simple y rápido consiste en unir al anticuerpo secundarioenzimas que catalicen la transformación de un sustrato soluble en un producto insoluble.De esta forma, en el posterior análisis quedará una mancha allí donde esté la proteína deinterés. Enzimas como la peroxidasa de rábano (HRP) o una fosfatasa alcalina sonválidas para este mecanismo.[11] Por ejemplo, la peroxidasa puede catalizar la oxidacióndel 4-cloronaftol en presencia de un 1% de peróxido de hidrógeno. El resultado es queel primero forma una mancha de precipitado oscura.[15] Otras técnicas, como ELISA oELISPOT, también emplean este método de detección.Otro método más sofisticado consiste en la unión de una enzima que catalice unareacción quimioluminiscente. Las anteriormente citadas enzimas también son válidas eneste caso, aunque cada una usa un agente quimioluminiscente diferente. En el caso de laperoxidasa, cataliza la oxidación del luminol en presencia de peróxido de hidrógeno. Lafosfatasa alcalina cataliza la defosforilación del adamantil-1-2-dioxetano fosfato,reacción que genera luz. Si se coloca una película fotográfica sobre la membrana, laexposición a la luz que se desprende en la reacción permite detectar la actividadenzimática.Marcaje fluorescenteOtro método basado en el mismo principio emplea anticuerpos unidos a fluorocromosdel infrarrojo cercano, como el 2 - metoxi - 2,4 - difenil - 3 (2H) - furanona (MDPF) oel rojo Nilo. Estos compuestos emiten una cantidad de luz constante (estado estático)cuando se excitan de manera constante, permitiendo una detección muy precisa y unacuantificación del antígeno más exacta que la de la quimioluminiscencia, que se realizadurante un estado dinámico.
  8. 8. El rojo Nilo no es puede usarse para teñir bandas en membranas de PVDF; sin embargoes posible realizar la tinción en el gel SDS - PAGE y luego transferirlo a la membranade PVDF. Esto último presenta una ventaja, y es que no es necesario realizar una tincióndel gel para comprobar la transferencia proteica.[16]Sistema avidina/estreptavidinaOtra opción es emplear un anticuerpo primario unido covelentemente a moléculas debiotina. Después la detección se llevará a cabo con una proteína de unión a la misma,como la estreptavidina o la avidina.Detección con oroOtra técnica, conocida como Golden blot, consiste en la detección de los anticuerposprimarios con proteína A unida a partículas de oro. El resultado es una membrana conmanchas rojas, causadas por el oro, allí donde está la proteína.[17] La sensibilidad delmétodo puede incrementarse con una tinción fotoquímica de plata: el oro cataliza lareducción de los iones plata a plata metálica en presencia de otro agente reductor, comola hidroquinona; la plata forma de este modo unas manchas visibles bajo microscopioóptico. Se consigue así una sensibilidad comparable a la de las técnicas radiactivas.[11][18]Método en un pasoHistóricamente la detección se ha realizado en dos pasos por la relativa facilidad quesupone producir anticuerpos primarios y secundarios en procesos separados. Esto ofrecea investigadores y empresas enormes ventajas en lo que a flexibilidad se refiere, y añadeun efecto amplificador al proceso. Sin embargo, debido a la llegada de los análisis deproteínas de alto rendimiento y los menores límites de detección ha crecido el interéspor desarrollar sistemas de detección en un solo paso que aumentarían la rapidez delproceso al tiempo que reducen los consumibles. Esto requiere un anticuerpo quereconozca al mismo tiempo la proteína de interés y una "etiqueta" detectable. Se incubade manera similar al anticuerpo primario del proceso en dos pasos, y, tras una serie delavados, ya se puede detectar directamente.AnálisisTras el lavado de las sondas marcadas no unidas, se procede a la detección de aquellasque sí se han unido a la proteína de interés.Detección colorimétricaLa detección colorimétrica depende de la incubación del Western blot con un sustratoque reacciona gracias a la enzima reporter (una peroxidasa, por ejemplo) unida alanticuerpo secundario. Pasa así de ser un compuesto soluble a una forma insoluble deotro color que precipita cerca de la enzima tiñendo así la membrana. Se procede despuésa un lavado en el que se elimina el tinte soluble. La cuantificación proteica se evalúa pordensitometría (cuan intensa es la mancha) o por espectrometría.
  9. 9. Detección quimioluminiscenteLa detección quimioluminiscente requieren la incubación de la membrana con unsustrato, que emitirá luminiscencia al ser expuesto al reporter que trae unido elanticuerpo secundario. La luz emitida es captada por una película fotográfica o, másrecientemente, por cámaras CCD, que toman una imagen digital del Western blot. Seanaliza la imagen por densitometría para evaluar la cantidad relativa de mancha ycuantifica el resultado en términos de densidad óptica. Actualmente hay programas quepermiten realizar análisis más profundos si se aplican ciertos estándares, como laobtención del peso molecular.] Detección radiactivaLos marcadores radiactivos no requieren sustratos enzimáticos; en su lugar se colocauna película fotográfica contra el Western blot y la actividad radiactiva del marcadorprovoca la aparición en ella de regiones oscuras. Éstas se corresponderán con las bandasde las proteínas de interés. Su alto precio y su riesgo para la salud y la seguridad hanprovocado su desuso en los últimos tiempos.Detección fluorescenteEn la detección con marcadores fluorescentes se procede a la excitación lumínica deéstos que les provoca una excitación. Ésta es detectable por un fotosensor, como unacámara CCD equipado con los filtros de emisión apropiados. Se consigue así unaimagen digital del Western blot que puede ser analizado para obtener el peso molecularo la cuantificación proteica. La fluorescencia es considerada uno de los métodos deanálisis más sensibles.Exploraciones secundariasUna característica de las membranas de PVDF, de la que carecen las de nitrocelulosa, essu capacidad de quitar los anticuerpos y volver a explorar la membrana con otrosanticuerpos. Aunque hay protocolos que permiten hacer lo mismo en membranas denitrocelulosa, la robustez de las de PVDF facilita la eliminación de los anticuerpos,permitiendo más reusos antes de que el ruido de fondo es tan grande que impidecontinuar con los experimentos. Otra diferencia es que, a diferencia de la nitrocelulosa,el PVDF debe ser empapado en etanol, isopropanol o metanol al 95% antes de serusado. Además, las membranas de PVDF tienden a ser más delgadas y más resistentes alos daños durante su uso.
  10. 10. [AplicacionesInvestigaciónActualmente, el Western blot es una de las técnicas más usadas en el estudio de labiología molecular.[19]Diagnóstico Prueba de VIH: Aunque el VIH suele detectarse mediante la técnica ELISA, el Western Blot se usa como prueba confirmatoria cuando el ELISA da un resultado positivo en un grupo que no es de riesgo o en una población donde la prevalencia del virus es muy baja. Mediante el Western blot se buscan los anticuerpos anti-VIH en una muestra de suero humano. Se transfieren a una membrana las proteínas de células que, se sabe, están infectadas por el VIH. Entonces, se incuba el suero que hay que probar con esta membrana. Este paso es equivalente a la incubación con el anticuerpo primario; si hay anticuerpos anti-VIH en el suero, serán estos los que realizen el papel de anticuerpo primario. Se lava, para eliminar los anticuerpos no unidos, y la membrana se vuelve a incubar con un anticuerpo secundario anti-humano unido a una enzima- señal. La aparición de bandas indica la presencia de proteínas contra las cuales el suero del paciente contiene anticuerpos, es decir, el paciente es seropositivo. Se emplea como prueba definitiva de la encefalopatía espongiforme bovina, comúnmente llamada "enfermedad de las vacas locas". Algunas clases de la prueba para la enfermedad de Lyme usan el Western blot. En veterinaria, ocasionalmente se emplea el Western blot para confirmar la presencia del FIV en gatos.[Enlaces externos Métodos de transferencia de proteínas a filtros - Universidad de BarcelonaReferencias 1. ↑ a b Towbin H, Staehelin T, Gordon J. (1979). «Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.». Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9): pp. 4350–4354. doi:10.1073/pnas.76.9.4350. PMID 388439. 2. ↑ a b Renart J, Reiser J, Stark GR (1979). «Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure.». Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (7): pp. 3116–3120. doi:10.1073/pnas.76.7.3116. PMID 91164. 3. ↑ Antibody Central. . Consultado el 18 de agosto de 2010. «Total number of antibodies in database: 231279». 4. ↑ «Western blot antibody». exactantigen.com. Consultado el 20/8/2010. «Labome lists 449244 antibody products against 41374 genes, including 15695 human, 11355 mouse, and 9387 rat genes.».
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