Hibridación y Blotting
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    Hibridación y Blotting Hibridación y Blotting Presentation Transcript

    • Híbrido: Cruce de 2 especies distintas.
    • En Biología Molecular:Proceso por el cual se combinan dos cadenas de ácidos nucleicos antiparalelas y consecuencia de bases complementarias en una única molécula de doble cadena, que tomala estructura de doble hélice, donde las bases nitrogenadas quedan ocultas en elinterior.Dichas cadenas pueden ser de DNA/DNA ó DNA/RNA.En ambos casos, se utiliza una cadena sencilla de ADN marcada por un método físico-químico (radiactiva o fluorescente). Esta cadena tiene una secuencia de nucleótidosconocida y se utiliza como sonda para detectar otras moléculas de ARN o ADN decadena sencilla de secuencia parecida.
    • Protocolo General:1. La hélice de doble cadena (ADN) es separada mediante un proceso físico (calor) o químico (con una base fuerte).2. Las dos hebras complementarias se separan, el ADN se desnaturaliza.3. Una muestra de cadenas simples (o desnaturalizadas) se mezcla con otra muestra decadenas simples.4. La muestra combinada se enfría lentamente, las moléculas sencillas se vanemparejando por las zonas complementarias (más estables termodinámicamente) y seva formando una nueva molécula ”híbrida”.
    • Blot= Mancha.Proceso en el cual se hibridan 2 fragmentos de DNA.El ADN es digerido con una enzima de restricción y los fragmentos son separados porelectroforesis.Los fragmentos de ADN de doble cadena son desnaturalizados mediante un procesoquímico separando las dos hebras componentes de ADN en sus cadenas sencillas.El ADN inserto en el gel es transferido a una membrana de nitrocelulosa.Dicha membrana se incuba durante un tiempo con la sonda marcada para hibridar alas moléculas de ADN de cadena sencilla de secuencia complementaria (o muyparecida).La sonda unida al fragmento de ADN complementario se puede visualizar medianteuna radiografía para el caso de sondas radiactivas o con una película sensible a la luz,para el caso de sondas fluorescentes.
    • Digestión con EcoRI de 14 colonias que son probables portadoras de un gen de interés. Sólo 6 de las 14confirmaron ser positivas después de realizar el Southern Blot.
    • Se utiliza para identificar las cadenas de ARN de secuencia semejante al ADN que seusa como sonda.El ARN se extrae y se fracciona en tamaños variables mediante una electroforesis engel de poliacrilamida en unas condiciones que mantenga las cadenas de ARN en estadodesnaturalizado.El proceso continúa de forma semejante a la hibridación de tipo Southern.El método del northern se utiliza muy frecuentemente para realizar estudiosde expresión génica; para conocer qué genes están activos formando ARN mensajero enqué condiciones, en qué tejidos o tipos celulares.
    • Las sondas (fluorescentes) se hibridan directamente sobre material orgánico. Usadaen conjunto con técnicas de microscopía. FISH (Fluorescent in situ Hybridization). Se usa para identificar regiones específicas deADN en los cromosomas (detección de anomalías congénitas, por ejemplo). Protocolo general:1. Se genera la sonda fluorescente basándose en la secuencia de interés.2. Se hibrida con los cromosomas (fijos en un portaobjetos y desnaturalizados).3. Se examina la muestra al microscopio con luz fluorescente. Si hay señales fluorescentes, la sonda hibridó en la región blanco.
    • Detección de la replicación de un vector adenoviral en células humanas por FISH. Para lograr mayor contraste, los núcleos se tiñeron con yoduro de propidio (rojo).
    •  Técnica analítica usada para detectar proteínas específicas en una muestradeterminada (una mezcla compleja de proteínas, como un extracto tisular). Mediante una electroforesis en gel se separan las proteínas atendiendo al criterio quese desee: peso molecular, estructura, hidrofobicidad, etc. Las proteínas se transfieren a una membrana adsorbente (nitrocelulosa) para poderbuscar la proteína de interés con anticuerpos específicos contra ella. Finalmente, se detecta la unión antígeno-anticuerpo por actividadenzimática, fluorescencia entre otros métodos. De esta forma se puede estudiar la presencia de la proteína en el extracto y analizar sucantidad relativa respecto a otras proteínas.