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Hibridación y la Inmunohistoquímica
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Hibridación y la Inmunohistoquímica Hibridación y la Inmunohistoquímica Presentation Transcript

  • HIBRIDACION Y LA INMUNOHISTOQUIMICA
  • HIBRIDACION IN SITU La técnica de hibridación in situ está basada en la capacidad que poseen los ácidos nucleicos para hibridizarse entre sí, es decir, la existencia de determinada secuencia de ADN que resulta complementaria con otra secuencia. Lo que se produce mediante la utilización de esta técnica es: La hibridación (unión), de la sonda marcada, con la secuencia a buscar (en el caso de estar presente en la muestra) y posteriormente mediante técnicas específicas, la transformación de la secuencia en algo visible.
  • FISH - FISH (Fluorescent in situ hybridization): (sinónimo: hibridación in situ con fluorescencia)
    • Técnica que se utiliza para identificar, en una muestra problema, la presencia de Cromosomas determinados o regiones específicas de Cromosomas cuya secuencia es conocida, (sondas de ADN), y que marcamos con fluorescencia. La detección se realiza tras la hibridación (reconocimiento de la secuencia y fusión) de la Sonda de ADN marcada sobre el ADN cromosómico desnaturalizado de la muestra problema.
    • 1ª región cromosómica de interés fase. Preparación de la sonda. Una sonda es un segmento de ADN marcado con fluorescencia, que es complementario a la
    • 2ª fase. Hibridación. Los cromosomas desnaturalizados, fijos en el portaobjetos del microscopio, son expuestos a la sonda marcada con fluorescencia. La hibridación (fusión) tiene lugar entre la sonda y el ADN cromosómico complementario (es decir, se acopla).
    • 3ª fase. Visualización. Tras la hibridación, se examina el portaobjetos al microscopio con luz fluorescente. Las señales fluorescentes indican la presencia de ADN cromosómico complementario, la ausencia de tales señales implica que no hay ADN cromosómico complementario.
    • INMUNO: Anticuerpo/antígeno
    • HISTOQU í MICA: encontrar genes dentro de Proteínas
    • Las técnicas de inmunocitoquímica consisten en la identificación in situ de un constituyente celular o tisular mediante la interacción específica antígeno/anticuerpo, la que es identificada por medio de un marcador visible.
    TECNICAS DE INMUNOHISTOQUIMICA
    • Corresponde a un grupo de técnicas de inmunotinción que permiten demostrar una variedad de antígenos presentes en las células o tejidos utilizando anticuerpos marcados.
    • Estas técnicas se basan en la capacidad de los anticuerpos de unirse específicamente a los correspondientes antígenos. Esta reacción es visible sólo si el anticuerpo está marcado con una sustancia que absorbe o emite luz o produce coloración.
    • EJEMPLOS DE MARCADORES INMUNOHISTOQUÍMICOS
    • Anticuerpo Células/antígenos detectados
    • CD1a célula de Langerhans CD4 linfocito T de auxilio CD8 linfocito T citotóxico CD30 célula de Reed-Sternberg CD45 leucocitos CD68 macrófagos S100 células de Schwann HMB-45 melanocitos AE1 citoqueratinas de bajo peso molecular AE3 citoqueratinas de alto peso molecular DESMINA células musculares GFAP glía CEA antígeno carcino-embrionario AFP alfa-fetoproteína REN receptores nucleares de estrógenos VIMENTINA sarcomas
    • 1. Extracción y purificación del DNA.
    • Se requiere que el DNA este libre de otros compuestos celulares.
  • 2. Centrifugación del DNA en gradiente de densidad
    • Las moléculas varían de densidad dependiendo de su composición química. Las moléculas con mayor contenido de GC son m á s densas que las que tienen bajo contenido en GC.
    • 3 . Electroforesis en gel
    • Es un procedimiento por el que las moléculas cargadas emigran diferente cuando se les somete
    • a campo eléctrico. Las moléculas pequeñas y compactas migran mas rápido que las grande s y relajadas. El gel se tiñe
    • después de la
    • electroforesis
    • con bromuro de etilo
  • 4. Detección del DNA
    • Cuando de tratan los ácidos nucleicos con colorantes fluorescentes que se unen fuertemente con a sus cadenas, el acido nucleico que se obtiene es fluorescente. El bromuro de etilo es el más empleado ya que se intercala fuertemente con el DNA que es fluorescente sí se observa con luz ultravioleta.
  • 5. Marcaje de los ácido nucleicos
    • Un ácido nucleico puede hacerse radioactivo simplemente con la adición de fosfato activo (fósforo 32) durante su síntesis.
    • También se puede realizar el marcaje en el extremo 5’ utilizando ATP radiactivo marcado en el tercer fosfato. La enzima polinucleótido quinasa quita específicamente al tercer fosfato del ATP y lo une al grupo hidroxilo 5’ del DNA.
  • 6. Desnaturalización de los ácidos nucleicos
    • Las cadena de DNA se pueden separar por calentamiento (fusión). Cuando el DNA calentado se enfría lentamente vuelve a re-naturalizarse.
    • También pueden separarse a temperatura ambiente cambiando las condiciones iónicas del medio.(desnaturalización)
  • 7. Hibridación de ácidos nucleicos
    • La hibridación se hace a partir de dos monocatenarios y por complementariedad de bases. Por tanto la hibridación permite formar complejos bicatenarios no naturales de DNA, RNA o DNA:RNA. Existe una técnica denominada Western (también llamada inmunotrasferencia) que implica el uso de anticuerpos para la detección de proteínas especificas. La sonda que es radioactiva se une al fragmento con el que tenga complementariedad y se detectara por autoradiografía.
  • 8 . Determinación de la secuencia
    • Se puede realizar a través del método de Sanger o dideoxi nucleótidos y/o el de Maxam-Gilbert