1. La espectroscopía de RMN arroja luz
sobre la compleja dinámica de las proteínas.
Revela una estrecha relación entre la flexibilidad
molecular y la función biológica
Oscar Millet
L
a biología estructural, una de las ramas
biol sos dinámicos. Aquí describimos uno de esos
más dinámicas de la biología contempo-
d métodos, el estudio por RMN del intercambio
ránea, se ocupa del estudio de los pro- químico conformacional. A través de ejemplos
cesos celulares a nivel molecular. La unidad seleccionados ahondaremos en la capacidad de
fundamental de investigación son las macro- las técnicas de RMN para obtener información
CONCEPTOS BASICOS moléculas, las proteínas sobre todo. Buena de los procesos celulares.
Las proteínas son entida- parte de la exquisita precisión con que operan
des flexibles, movilidad las proteínas y enzimas se debe a su plastici- Plegamientos y reorientaciones
a menudo ligada a la dad. Sin embargo, el estudio del movimiento Las proteínas son biopolímeros, constituidos
función celular. proteínico entraña una notable dificultad. Su por concatenación de aminoácidos. A partir
La resonancia magnética relación con la función biológica se encuentra de veinte aminoácidos se forman, mediante
nuclear permite estudiar, a menudo enmascarada por otros factores. enlaces amida, múltiples combinaciones. To-
con resolución atómica, la La resonancia magnética nuclear (RMN) dos los seres vivos (virus incluidos) contienen
dinámica de las proteínas resulta idónea para analizar la movilidad de proteínas; del funcionamiento de éstas y de
y observar fenómenos las biomoléculas; se aplica a la “observación” su adecuada integración en el medio celular
moleculares que tienen de fenómenos moleculares que tienen lugar en depende la subsistencia del organismo.
lugar en múltiples escalas múltiples escalas de tiempo. Los fundamentos Proteínas son las enzimas que catalizan
de tiempo. teóricos del estudio de la movilidad confor- las reacciones químicas en un organismo,
La comprensión de los
macional por RMN se conocen desde hace los receptores que detectan específicamen-
fenómenos dinámicos decenios, pero ha sido la reciente introducción te determinados metabolitos o agentes pa-
en las proteínas reviste de métodos experimentales junto con notables tógenos, y los canales transmembrana que
interés para el desarrollo desarrollos técnicos en instrumentación los que regulan los gradientes de concentración de
de fármacos. han permitido obtener, con resolución atómica, iones y otras sustancias a ambos lados de la
información cualitativa y cuantitativa de proce- pared celular. Las proteínas ejercen también
68 INVESTIGACION Y CIENCIA, abril, 2009

2. funciones estructurales en células y tejidos.
Se encargan de la regulación de los procesos
metabólicos y de la transducción de señal en
el organismo.
¿A qué se deben la diversidad y la preci-
sión con que estos biopolímeros desarrollan
sus funciones? Por una parte, cada uno de
los veinte aminoácidos constituyentes (monó- residuos aromáticos del núcleo hidrofóbico 1. LA MOVILIDAD DE LAS PRO-
meros) presenta características fisicoquímicas de una proteína globular. TEINAS reviste suma importan-
singulares, que confieren a cada proteína una Sabemos ahora que los fenómenos dinámi- cia para su función biológica.
reactividad específica. La secuencia aminoací- cos en proteínas se manifiestan en distintos La imagen corresponde a la
dica (estructura primaria) define las propie- niveles. Centrémonos en el equilibrio entre la racemasa de prolina, enzima de
dades de la proteína. Las proteínas adoptan forma nativa (conformación plegada caracte- Tripanosoma cruzi, el parásito
espontáneamente una conformación tridimen- rizada por su estructura terciaria) y la forma responsable del mal de Chagas.
sional (estructura terciaria) que tiene por mi- desnaturalizada (forma inactiva y carente de Se muestra la superposición de
dos conformaciones molecula-
sión orientar en el espacio a los aminoácidos estructura definida).
res: abierta (amarillo) y cerrada
de interés funcional. Pese a que la forma nativa es más estable
(azul). En ausencia de sustrato,
Para ejercer tal abanico de funciones, las que la desnaturalizada, se trata de una esta-
la proteína interacciona con
proteínas requieren una flexibilidad confor- bilidad marginal, pues equivale a la energía nuestro sistema inmunitario de
macional notable. Hace medio siglo, tras de unos pocos enlaces de puente de hidróge- forma que lo desbarata. Cuando
las primeras determinaciones de estructuras no. Ambas formas se convierten una en otra se une al centro activo un
tridimensionales de proteínas, mediante cris- constantemente. La conformación nativa debe sustrato (morado), la estruc-
talografía de rayos X, se planteó la posibili- existir sólo durante el tiempo necesario para tura se cierra, lo que evita la
dad de que en las proteínas se desarrollaran cumplir su función; luego, se desnaturaliza
LAURA MASGRAU (ambas páginas)
acción patógena. Ahondar en el
fenómenos de dinámica conformacional. La a través de un mecanismo de regulación y movimiento de esta molécula
confirmación de la hipótesis llegaría, años renovación del material celular. reviste suma importancia para
más tarde, con los experimentos de RMN, La conversión entre las formas nativa y el desarrollo de fármacos contra
cuando Gerhard Wagner y Kurt Wütrich, del desnaturalizada sucede a escalas de tiempo esta enfermedad.
Instituto Politécnico Federal Suizo en Zúrich, que van del milisegundo al segundo. La in-
observaron movimientos de rotación en los formación necesaria para dicha transformación
INVESTIGACION Y CIENCIA, abril, 2009 69

3. MOVIMIENTOS RAPIDOS Y ULTRARRAPIDOS
En las proteínas se producen varios tipos de movimiento: rotaciones de enlaces, plegamientos, libraciones, etcétera. Cada uno ocurre a una escala
de tiempo característica. Para estudiar uno de esos movimientos (barras azules), deberemos recurrir al “observable” equivalente (barras naranjas)
en aquella escala de tiempo. (Un “observable” corresponde a una propiedad del sistema que puede determinarse, u “observarse”, por una se-
cuencia de operaciones físicas.) Los observables que describen la dinámica de las proteínas se determinan mediante experimentos de RMN.
Desplagamiento parcial o total Difusión rotacional Libraciones de enlace
Tipo de movimeinto
Cinética enzimática Reorientación de giros (lenta) Reorientación de giros (rápida)
Reorientación puentes disulfuro Conversión de rotámeros
Conversión anillos aromáticos
Escala de tiempo (s)
103 100 10–3 10–6 10–9 10–12
Observable de RMN
Intercambio HN T2, T1rho T1, T2, nOe
Desplazamiento químico J
Constantes dipolares
suele ser función exclusiva de la secuencia de tamaño limitado”. Con otras palabras, la
aminoacídica de la proteína. Esas escalas de interacción con una molécula orgánica puede
tiempo son extraordinariamente pequeñas si inducir en la proteína cambios conformacio-
las comparamos con el tiempo que necesita- nales que facilitan la creación de un complejo
ría el polipéptido para tantear todas las con- y aumentan la especificidad. Esta hipótesis ha
formaciones posibles, lo que se conoce por sido ampliamente corroborada experimental-
paradoja de Levinthal. De lo que se infiere mente mediante RMN de alta resolución y
que debe de haber cierta direccionalidad en otras técnicas espectroscópicas.
el proceso de plegamiento. El mecanismo de acción de las enzimas
El modelo de plegamiento más aceptado es constituye un buen ejemplo de movilidad
el del “embudo de plegamiento proteico”. De segmental: una reordenación de átomos en
acuerdo con el mismo, los estadios intermedios la proteína facilita la adaptación entre ésta y
restringen paulatinamente el espacio confor- el sustrato. Se esgrimen varias razones para ex-
macional accesible y, de ese modo, encaminan plicar el fenómeno. Se habla, por ejemplo, de
el plegamiento hacia la conformación nativa. grados de libertad, que permitirían a la enzima
El estudio de la dinámica del plegamiento adoptar conformaciones que se encuentran en
proteínico se lleva buena parte de los trabajos la coordenada de reacción y rebajan la energía
actuales sobre biología estructural. de activación del proceso. Otro mecanismo
La estructura nativa no es rígida, sino que posible se basa en un acoplamiento con el
experimenta cambios conformacionales, en su sustrato, que iniciaría la reorientación y de-
totalidad o en segmentos aislados. Aunque sencadenaría la reacción enzimática.
se trata de reordenamientos reversibles y no También, al hallarse a temperaturas supe-
producen la desnaturalización de la proteína, riores al cero absoluto, todas las moléculas
revisten máximo interés biológico. Su posible experimentan movimientos y vibraciones de
función quedó ya recogida en una observa- enlace que ocurren a escalas de tiempo muy
ción pionera de Daniel Koshland en 1958: reducidas. Nos referimos al “movimiento tér-
“...la naturaleza flexible de fragmentos o de mico”. En el caso de las proteínas, esos movi-
la totalidad de la cadena polipeptídica se atri- mientos incluyen, entre otros, las vibraciones
buye a múltiples razones; entre ellas, cambios de enlace (con periodos de femtosegundos)
conformacionales producidos por moléculas y las rotaciones de las cadenas laterales (con
INVESTIGACION Y CIENCIA, abril, 2009

4. períodos de picosegundos, si se hallan en la enlaces químicos, con lo que la señal propor-r-
superficie, y nanosegundos, si los residuos son ciona información estructural de gran valor.or.
interiores). La espectroscopía de RMN y la cristalografía
rafía
El delicado equilibrio entre las componen- de rayos X de alta resolución constituyen las
en
tes entálpica y entrópica explica que el movi- dos técnicas más utilizadas en la elucidación
ón
miento térmico para residuos distintos no sea estructural de biomoléculas y las que propor-
independiente. En la dihidrofolatorreductasa cionan una mayor resolución.
y la ciclofilina A, por ejemplo, se ha demos- El espectro de RMN de una proteína en-
trado un movimiento térmico concertado de traña una complejidad notable, vinculada al
un grupo de residuos. Como veremos más solapamiento de señales con el mismo “des-
adelante, en la ciclofilina A, ese movimiento plazamiento químico” y al acoplamiento en-
de “respiración” es el responsable último de tre señales. Merced al desarrollo de la RMN
la actividad catalítica de la enzima. multidimensional, donde la información
correspondiente a distintos núcleos se pre-
RMN biomolecular senta de manera combinada, se ha registrado
La resonancia magnética nuclear se basa en la un progreso espectacular en el estudio de bio-
interacción entre núcleos atómicos y ondas de macromoléculas.
radiofrecuencia, en presencia de campos mag- En el experimento 1H-15N-HSQC (“He-
néticos intensos. En el caso de las proteínas, los teronuclear Single-Quantum Correlation bi-
núcleos más estudiados mediante esta técnica dimensional”), se combinan los desplazamien-
espectroscópica son el protón (1H), carbono tos químicos de los núcleos de hidrógeno y
(isótopo 13C) y nitrógeno (isótopo 15N). de nitrógeno. Cada señal que aparece en el
En el espectro de RMN monodimensional, plano del espectro corresponde a un grupo
el más sencillo, se registran las frecuencias de N-H vinculado a un residuo de la proteína.
resonancia de uno de los núcleos que se estu- La dispersión en el plano basta para resolver
dian, el protón (1H), por ejemplo. Se obtiene la mayoría de las señales. Mediante RMN se
entonces una serie de señales correspondientes han estudiado proteínas de pesos moleculares
a los protones de la molécula. Las diferencias de hasta 80 kilodalton (Kda) (80.000 g/mol,
entre señales provienen de las diferencias entre unos 700 aminoácidos).
los entornos químicos que rodean a los núcleos En general, el estudio del 1H-15N-HSQC
en la molécula. El entorno difiere incluso entre precede a otros experimentos multidimensio-
núcleos que están tendiendo el mismo tipo de nales, de mayor complejidad técnica y concep-
DETERMINACION ESTRUCTURAL MEDIANTE RMN
La aplicación de la resonancia magnética nuclear (RMN) a la determinación estructural se basa en la medida del "desplazamiento químico"
para cada núcleo atómico. Este parámetro depende del entorno químico que rodea el núcleo en estudio, es decir, de la composición
y la conformación de la biomolécula. Las siguientes imágenes muestran ejemplos de espectros de RMN mono, bi y tridimensional junto
con un esquema del tipo de interacción química que permiten estudiar. El desarrollo de la RMN multidimensional ha facilitado un progreso
espectacular en el estudio estructural de las biomoléculas.
R O R O R O
N C C N C C N C C
ppm
H H H 106 H H H
108
110
112
114 F2 (ppm)
114
116
118
116
120
122
118
124
126
120
128 m)
(pp
1 (p
130 4 F
5
6
132 7
9,0 8,5 8,0 7,5 7,0 F3 (ppm)
10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm 11,0 10,5 10,0 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5 7,0 6,5 6,0 ppm
El espectro monodimensional es el más El espectro bidimensional resuelve el problema El espectro tridimensional añade compleji-
sencillo de registrar y de analizar. Su principal del solapamiento. Al hacer uso del acopla- dad técnica y de interpretación de la señal,
inconveniente es que el solapamiento de miento entre dos núcleos unidos por un enlace pero permite estudiar de forma simultánea
OSCAR MILLET
bandas de átomos parecidos (verde) complica (amarillo), permite diferenciar entre átomos la interacción entre tres núcleos relaciona-
a menudo la interpretación de la señal. que la RMN monodimensional no distingue. dos (azul).
INVESTIGACION Y CIENCIA, abril, 2009 71

5. tual, que permiten asignar las señales relativas se, la intensidad de cada señal disminuirá
a la posición de los núcleos en la proteína. en función de las poblaciones relativas de
cada confórmero en el equilibrio. Los pro-
Captar el movimiento cesos de intercambio conformacional suelen
De la RMN destacamos su capacidad para corresponder a transiciones entre un estado
proporcionar información acerca de procesos fundamental y un estado excitado escasamente
dinámicos en un amplio intervalo de escalas poblado (población inferior al 1 por ciento).
de tiempo. Revisten especial interés biológico En esos casos, la señal del estado excitado
los procesos que implican un intercambio en- apenas se detecta; el espectro no difiere del
tre dos conformaciones de la molécula en la que correspondería a un sistema sin intercam-
escala del microsegundo-milisegundo. Para su bio conformacional, lo que constituye una
caracterización, importa recabar información limitación del método.
estructural de ambas conformaciones, así como Las condiciones en las que se observan dos
describir la termodinámica y la cinética del señales distintas, una para C1 y otra para C2,
cambio químico. se dan sólo cuando el intercambio es lento,
Supongamos un equilibrio de intercambio es decir, cuando los valores de kint son in-
entre dos conformaciones, C1 ← C2, donde C1
→ feriores a la diferencia de frecuencias entre
y C2 representan los dos estados involucrados las dos conformaciones (kint << 2πΔν). Si el
en el proceso y k12 y k21 sus respectivas velo- intercambio es rápido (kint > 2πΔν), no es
cidades de conversión (en s‒1). La constante posible resolver ambas frecuencias; el espectro
cinética de intercambio (kint) se define como muestra una señal, única, cuya frecuencia de
la suma de k12 y k21. Proporciona una idea del resonancia corresponde al valor promedio
número total de conversiones por unidad de de las dos conformaciones, con la consiguien-
tiempo. Dado que la frecuencia de resonancia te dificultad para identificar los procesos de
de cada núcleo depende de su entorno quími- intercambio químico subyacentes.
co, esperaríamos dos señales (una para cada Esas dificultades para la identificación y
una de las dos conformaciones), separadas por caracterización de los procesos de intercambio
una diferencia de frecuencias Δν. La presencia químico se han superado merced al desarrollo
de señales adicionales en el espectro evidencia, de secuencias de pulsos que cuantifican el en-
2. LABORATORIO DE RMN DEL pues, un intercambio químico conformacional. sanchamiento de la señal. (Y no la frecuencia
CICbioGUNE (Bilbao), dedicado El análisis de la frecuencia característica de de resonancia o el desplazamiento químico. La
a la biología estructural de pro- cada señal proporciona información estructural anchura de banda también se ve modificada
teínas. Se muestran los imanes de ambas conformaciones. por la presencia de procesos de intercambio
superconductores (izquierda Las señales correspondientes a C1 y C2 químico.) En esos experimentos de relajación-
y centro) y la sala de control pertenecen a dos estados del mismo núcleo. dispersión, se mide la envolvente de la señal
(derecha). Dado que la integral total debe conservar- (anchura de la banda) a tiempos de evolución
distintos. La conversión de C1 en C2 implica
un intercambio de frecuencias, lo que com-
porta una interferencia destructiva, que resulta
en la atenuación, o ensanchamiento, de la
señal. Cuanto mayor es el tiempo de coexis-
tencia entre las dos frecuencias, mayor es la
probabilidad de interconversión (probabilidad
que viene dada por kint) y más ancha la señal
obtenida. La representación de la evolución
temporal de las anchuras de banda proporciona
las curvas de dispersión.
El ajuste matemático de las curvas de dis-
persión proporciona una descripción del equi-
librio conformacional. Por un lado, se obtiene
la velocidad del proceso (kint); este parámetro
guarda relación directa con la barrera ener-
gética que separa los dos estados: el sustra-
to y el producto en una enzima, o el estado
fundamental y el excitado en el caso de otra
proteína. Por otro, se determinan los despla-
CICbioGUNE, BILBAO
zamientos químicos de ambas conformaciones,
que contienen valiosa información estructural.
Se obtienen también las poblaciones relativas
de los dos estados; a partir del análisis de
72 INVESTIGACION Y CIENCIA, abril, 2009

6. una sola señal, se deducen las poblaciones de Lys 313 Glu 43
40 16
ambos confórmeros, incluso en el caso de que
35 15
la señal de uno de ellos sea muy pequeña. Se
Anchura de banda (Hz)
Anchura de banda (Hz)
14
han detectado conformaciones con poblaciones 30
13
de un exiguo 0,5 por ciento. 25 12
El experimento básico de medición de la 20 11
dispersión en proteínas lo llevó a cabo el grupo 15
10
de Arthur G. Palmer, de la Universidad de 9
10 8
Columbia, en 1998. Desde entonces se ha
venido depurando la técnica. Se han publi- 0
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
cado numerosas aplicaciones. Dos de ellas se CPMG
/s–1 CPMG
/s–1
detallan a continuación.
muestran que la mayoría de los aminoácidos 3. EN LOS EXPERIMENTOS DE
Mecanismo catalítico de la ciclofilina A no se hallan implicados en procesos dinámi- RELAJACION-DISPERSION se
La ciclofilina A (CypA) pertenece a una fa- cos; sólo un grupo de 30 residuos presenta mide la anchura de banda a di-
milia de prolil-isomerasas que catalizan la una flexibilidad conformacional notable. Los ferentes tiempos de interferen-
isomerización cis-trans de enlaces en pépti- aminoácidos de ese subgrupo se apiñan en cia (representados aquí como
dos y proteínas, siempre que contengan el el centro activo de la proteína y en ciertos frecuencias). Se muestran los
aminoácido prolina. Participa en importantes residuos periféricos. resultados obtenidos para dos
procesos celulares —activación de linfocitos T La mayoría de los grupos amida proporcio- aminoácidos de la proteína que
se une a la maltosa. La lisina 313
en el sistema inmunitario, por ejemplo— y nan valores de intercambio químico (kint) muy
muestra una curva de dispersión
cumple funciones de chaperona molecular, es similares en la escala de tiempo de la fluctua-
característica. Del ajuste de los
decir, asiste al plegamiento de otras proteí- ción; ello sugiere que siguen un movimiento
datos experimentales se extrae
nas recién formadas. La CypA constituye el concertado. El valor conjunto obtenido para información sobre la movilidad
receptor natural de la ciclosporina A (CsA), kint (2500 ± 220 s1) encaja con la suma de las del aminoácido. El aminoácido
un fármaco inmunosupresor. Desempeña una constantes enzimáticas kct y ktc (2689 s1). Esos glutámico 43, en cambio, no
función esencial en el mecanismo de acción del resultados, junto con el análisis de proteínas muestra ninguna respuesta dife-
virus de inmunodeficiencia adquirida (VIH-1): mutantes, demuestran que el movimiento de rencial con respecto al tiempo
se une al virus a través de la proteína gag y los residuos implicados resulta crítico para de interferencia; ello indica que
afecta a la generación de copias de la proteína la actividad catalítica de la enzima y que el no experimenta ningún proceso
de la cápside Vpr. valor de la velocidad máxima de la enzima de intercambio químico confor-
Esta enzima presenta un elevado grado de (kct + ktc) corresponde al tiempo necesario para macional.
reversibilidad en la reacción de isomerización. que los residuos cambien de la conformación
Opera, pues, con velocidades semejantes en cis a la trans.
ambas direcciones. Los valores de las constan- Los experimentos de dispersión demuestran
tes de interconversión son del mismo orden de que el movimiento conjunto de un grupo de
magnitud: 1049 s1 para la conversión del isó- aminoácidos es el responsable último de la
mero cis en trans (kct) y 1640 s1 para el proceso acción enzimática en la ciclofilina. Bajo una
inverso (ktc). La unión de CsA a CypA, muy apariencia caótica, esas fluctuaciones térmicas
fuerte, con una constante de disociación del establecen la estereoselectividad necesaria para
complejo CypA/CsA de 30 μM (micromolar). ejecutar la catálisis enzimática con una preci-
En presencia de un exceso de ciclosporina A, sión exquisita. ¿De qué modo se produce la
la población de enzima libre puede conside- sincronización del movimiento de ese grupo
rarse despreciable, y decimos que se produce de aminoácidos? La respuesta se encuentra
la saturación de la enzima. Ambas formas, cis en la arquitectura molecular de la enzima: la
y trans, son a la vez sustrato y producto de la evolución ha moldeado la disposición espacial
enzima. La saturación de la enzima conlleva de este grupo de átomos de forma que apa-
la generación de un estado estacionario en el rezca el movimiento concertado en situación
que las formas cis y trans se transforman entre de equilibrio.
sí indefinidamente; ambas conformaciones se Con el propósito de averiguar la función
encuentran casi equipobladas. que desempeña el sustrato en la activación
Mediante experimentos de RMN, se ha del proceso, se han medido las curvas de
estudiado la dinámica enzimática de CypA dispersión en ausencia de sustrato. Se han
en presencia de CsA, así como la relación descubierto equilibrios conformacionales, en
entre este movimiento y la función biológica. la misma escala de tiempo, que afectan aproxi-
A partir de las curvas de dispersión se ha madamente al mismo grupo de aminoácidos.
determinado el ensanchamiento de la señal De la investigación se desprende que la ci-
inducido por el intercambio químico con- clofilina A no necesita el sustrato para llevar
formacional, para cada grupo amida de cada a cabo su actividad, sino que desarrolla su
aminoácido de la proteína. Los resultados de- función catalítica a través del movimiento tér-
INVESTIGACION Y CIENCIA, abril, 2009

7. 4. LA CICLOFILINA A (gris)
constituye el receptor natural
de la ciclosporina A (rojo). Se
muestran también los átomos
involucrados en procesos de
intercambio químico conforma-
cional (azul). Los experimen-
tos de RMN demuestran una
correlación entre la dinámica de
la ciclofilina A y el sitio de unión
a la ciclosporina.
mico de un fragmento activo de la proteína. inconveniente: la proteína recombinante tiende
Se trata de un mecanismo complementario a a colapsarse sobre sí misma para eliminar el
otros modos de catálisis enzimática, como el volumen adicional.
encaje inducido. La lisozima T4 constituye la excepción.
La comparación de los valores obtenidos Proteína bacteriolítica de dos dominios, la
en ambos experimentos revela que las carac- encontramos en tejidos humanos y animales.
terísticas dinámicas de la enzima en estado de Los trabajos presentados en 1992 por el gru-
reposo (en ausencia de sustrato) y en estado po de Brian Matthews, de la Universidad de
activo (cuando procesa el sustrato) no son Oregón, descubrieron que una sola mutación
idénticas. en el núcleo de la lisozima T4 (leucina 99
En ausencia de sustrato, la enzima opera por alanina: L99A) es suficiente para generar
con una kint del orden de 1140 ± 200 s1; una cavidad de 150 angstrom cúbicos. La es-
en condiciones de saturación de sustrato, la tructura cristalográfica de la proteína mutante
constante cinética de intercambio alcanza los confirma que la cavidad no distorsiona la ar-
2500 s1. Tal discrepancia síguese de las dife- quitectura molecular, pese a hallarse enterrada
rencias en la distribución de la población mo- a siete angstrom de la superficie. Y lo que es
lecular. En el estado de reposo, alrededor de un más, se revela capaz de alojar en su interior
10 por ciento de la población se encuentra en ligandos de tamaño reducido e hidrofóbicos
la forma trans y un 90 por ciento en la forma (benceno, por ejemplo).
cis; en presencia de elevadas concentraciones La estabilidad de la cavidad sugiere la exis-
de CsA, en cambio, las poblaciones de ambos tencia de una fuerza repulsiva entre los ami-
confórmeros se acercan al 50 por ciento. El noácidos que la componen. Además, según los
estado de reposo establece, por tanto, la direc- datos estructurales, la cavidad no daría entrada
cionalidad del proceso biológico —favorable a a una molécula de tamaño reducido; se requie-
la transformación de cis en trans—, mientras re una segunda conformación “abierta” por
que la maquinaria catalítica cataliza ambos donde la molécula penetraría. Experimentos
procesos con rendimientos equiparables. de unión de xenón a la lisozima T4-L99A han
revelado que la unión transcurre en torno a la
Detección de estados excitados escala de tiempo del milisegundo.
La conformación nativa de una proteína La dinámica de la cavidad de la lisozima
se caracteriza por un corazón, o núcleo hi- T4 ha sido estudiada por Lewis E. Kay y su
drofóbico, en donde las cadenas laterales se grupo, de la Universidad de Toronto, mediante
El autor hallan densamente empaquetadas con el fin técnicas de RMN de relajación-dispersión. Se
de maximizar las interacciones no covalentes ha monitorizado el comportamiento de los
Oscar Millet es investigador del
entre los aminoácidos. Dada la complejidad grupos amida y metilo de la proteína. A una
laboratorio de RMN de proteínas
del Centro de Investigación de la estructura, el empaquetamiento sólo temperatura de 25 oC, más de la mitad de los
Cooperativa en Biociencias bio- puede predecirse —y de manera aproxima- aminoácidos que forman la proteína muestran
GUNE. Realizó su tesis doctoral da— a partir de métodos computacionales. El cierta flexibilidad: todos los residuos que se
en la Universidad de Barcelona diseño de proteínas mutantes con cavidades hallan orientados hacia la cavidad, numerosos
y completó su formación con
OSCAR MILLET
una estancia posdoctoral en la
que puedan alojar moléculas constituye un residuos del dominio que contiene la mutación
Universidad de Toronto. reto para la ingeniería de proteínas y reviste e incluso aminoácidos que se encuentran en
interés farmacológico. Pero existe un grave el otro dominio. La existencia de un movi-
74 INVESTIGACION Y CIENCIA, abril, 2009

8. AMINOACIDOS SINCRONIZADOS
El aminoácido prolina, al ser cíclico, presenta
isomería geométrica. Puede adoptar dos
conformaciones, que se distinguen por la
orientación de los residuos respecto del enlace
peptídico (flecha): cis (residuos en el mismo lado)
y trans (residuos en lados opuestos). A la derecha,
el equilibrio cis-trans del péptido alanina-prolina-
alanina (ALA-PRO-ALA).
La ciclofilina A (CypA) es una enzima que
participa en numerosos procesos celulares de CIS TRANS
importancia máxima. Cataliza la isomerización
cis-trans de enlaces en péptidos y proteínas
que contienen prolina. Presenta un equilibrio
10 %
entre dos conformaciones, que reconocen 50 % 50 %
específicamente a las formas cis y trans del 90 %
péptido respectivamente. En ausencia de
sustrato, la enzima presenta un equilibrio
cis-trans desplazado hacia la forma que se une a
la conformación cis de la prolina; en presencia de
sustrato, en cambio, ambas conformaciones son
ENZIMA LIBRE COMPLEJO ENZIMA-SUSTRATO
equiprobables.
Los experimentos de RMN indican que el responsable último de la dinámica enzimática de la CypA es el movimiento concertado de un grupo
de aminoácidos, una sincronización que se produce en situación de equilibrio. Es decir, que la CypA no necesita el sustrato para llevar a cabo su
actividad, sino que desarrolla su función catalítica a través del movimiento térmico de un fragmento activo de la proteína.
miento concertado se ha corroborado tras la Lo impide una compensación entrópico-entál-
comparación de los valores de kint. pica: la mayor libertad conformacional de las
A diferencia de la proteína nativa, en la cadenas laterales compensa, en parte, la pérdida
proteína mutante L99A los grupos flexibles de estabilidad que produce la disminución del
oscilan entre el estado fundamental (esen- número de interacciones no covalentes.
cialmente idéntico al de la proteína sin la Bibliografía
mutación) y un estado excitado (de naturaleza Una mirada hacia el futuro complementaria
desconocida), accesible al ligando. La pobla- Una silenciosa revolución en el campo de
STUDYING EXCITED STATES OF
ción del estado excitado se cifra en torno al la RMN ha acelerado el desarrollo de nue- PROTEINS BY NMR SPECTROSCO-
3 por ciento, “invisible” a los experimentos vos métodos para el estudio del intercambio PY. Frans A. Mulder, Anthony
estándar de resonancia magnética nuclear y químico conformacional en la escala de los Mittermaier, Bin Hon, Frederick
de cristalografía de rayos X. microsegundos y milisegundos. Dada la ínti- W. Dahlquist y Lewis E. Kay en
Con el fin de caracterizar la naturaleza del ma, y compleja, relación entre la flexibilidad Nature Structural Biology, vol.
8, pág. 932; noviembre, 2001.
estado excitado se han repetido las mediciones conformacional y la función biológica, a los
de dispersión a una serie de temperaturas que métodos de dispersión por RMN les espera NUCLEAR MAGNETIC RESONANCE
oscilan entre los 10 oC y los 30 oC. Se han un futuro prometedor en la caracterización METHODS FOR QUANTIFYING
analizado los resultados de forma conjunta. molecular de procesos celulares: intermedios MICROSECOND TO MILLISE-
COND MOTIONS IN BIOLOGICAL
Al incluir en el estudio el factor térmico, se de plegamiento, proteínas mal plegadas (así,
MACROMOLECULES. Arthur G.
han determinado las poblaciones del estado la proteína β-amiloide y su relación con la Palmer, Christopher D. Kroenke,
excitado a cada temperatura y extraído las enfermedad de Alzheimer) y las interacciones Patrick J. Loria en Methods in
componentes entrópica y entálpica. proteína-proteína y proteína-ADN. Enzymology, vol. 339, pág. 204;
Las conclusiones del análisis revelan que el Una comprensión más honda de la compo- diciembre, 2001.
estado excitado corresponde a una estructura nente entrópica de la dinámica de las proteínas
INTRINSIC DYNAMICS OF AN
más desordenada que el estado fundamental: facilitará el diseño de fármacos selectivos y el ENZYME UNDERLIES CATALYSIS.
existen menos interacciones y los aminoácidos escalado de enzimas para su uso industrial. Elan Z. Eisenmesser, O. Millet,
presentan mayor movilidad. Una movilidad Por fin, la integración de la información de W. Labeikovsky, D. Korzhnev,
que se concentra en las zonas afectadas por el los experimentos de dispersión con otros ex- M. Wolf, D. Bosco, J. Skalicky,
L. Kay y D. Kern en Nature, vol.
OSCAR MILLET
intercambio químico. Pero el desorden local perimentos sensibles a fenómenos ultrabreves
438, pág. 117; 3 de noviembre,
observado en el estado excitado no desemboca arrojará luz sobre otros procesos dinámicos 2005.
en la desnaturalización completa de la proteína. que ocurren en las proteínas.
INVESTIGACION Y CIENCIA, abril, 2009 75