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Bioanalytik

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  • 1. BioanalytikInhaltsverzeichnis:Gebräuchliche Einheiten.................................................................................................................................... 4 Substanzquantität, Volumen und Konzentration......................................................................................................4 Verdünnen von Lösungen (Konzentration einer Substanz [S])...............................................................................5Kohlenhydrate..................................................................................................................................................... 7 Die glycosidische Bindung.......................................................................................................................................... 7Aminosäuren und Proteïne................................................................................................................................. 9 Biuret-Test..................................................................................................................................................................... 9 Molekularmasse von Proteïnen................................................................................................................................. 10 Denaturierung von Proteïnen.................................................................................................................................... 11Lipide.................................................................................................................................................................. 13Biologische Membranen................................................................................................................................... 15 Die 3 häufigsten Phospholipidtypen......................................................................................................................... 15Nucleïnsäuren.................................................................................................................................................... 17pH-Messung und Titration................................................................................................................................ 19 Berechnung des pH-Wertes einer schwachen Säure.............................................................................................19 Berechnung des pH-Wertes von Wasser..................................................................................................................19 Berechnung des pH-Wertes einer Lösung des Salzes einer schwachen Säure mit einer starken Base..........20 Berechnung des pH-Wertes einer Pufferlösung......................................................................................................20 Ampholyte.................................................................................................................................................................... 21Elektrophorese.................................................................................................................................................. 23Chromatographie............................................................................................................................................... 25 Ionenaustauscher-Chromatographie........................................................................................................................ 25 Gelchromatographie................................................................................................................................................... 26Photometrie........................................................................................................................................................ 29 Gesetz von Lambert-Beer.......................................................................................................................................... 29 Konzentrationsbestimmung durch Photometrie.....................................................................................................29 Photometer und Spektralphotometer....................................................................................................................... 29Enzymreaktionen............................................................................................................................................... 31 Abhängigkeit der Enzymaktivität von der Substratkonzentration........................................................................31Molekularbiologische Methoden...................................................................................................................... 39 Plasmide...................................................................................................................................................................... 39 Restriktionsenzyme.................................................................................................................................................... 39 Agarose-Gelelektrophorese....................................................................................................................................... 40 Restriktionskarten...................................................................................................................................................... 40 Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus......................................................................................................41 Polymerase-Kettenreaktion....................................................................................................................................... 41Radioaktive Isotope........................................................................................................................................... 43 In Biochemie und Medizin gebräuchliche Radioisotope:......................................................................................43 Bestimmung der Radioaktivität................................................................................................................................ 43 Messmethodik............................................................................................................................................................. 43 „Background".............................................................................................................................................................. 44 Zählstatistik................................................................................................................................................................. 44 Einheiten der Radioaktivität...................................................................................................................................... 44 Spezifische Radioaktivität.......................................................................................................................................... 44 Wirkung radioaktiver Strahlung auf lebendes Gewebe - Radiodosimetrie..........................................................44 Richtlinien zum Arbeiten mit 3H- und 14C-markierten Substanzen.....................................................................45Immunologische Bestimmungsmethoden...................................................................................................... 47Anhang............................................................................................................................................................... 49 Abbildungsverzeichnis............................................................................................................................................... 49 Formelverzeichnis...................................................................................................................................................... 50 Gleichungsverzeichnis............................................................................................................................................... 51 Tabellenverzeichnis.................................................................................................................................................... 52 -3-
  • 2. BioanalytikGebräuchliche EinheitenSubstanzquantität, Volumen und Konzentration Substanzquantität wird als Masse oder als Stoffmenge angegeben. Masse: Basiseinheit ist das Kilogramm. Gebräuchliche Einheiten sind: kg = 10 3 [g] g = 10 0 [g] mg ( milli) = 10 −3 [g] μg ( mikro ) = 10 −6 [g] ng (nano ) = 10 −9 [g] pg (pico ) = 10 −12 [g] fg ( femto ) = 10 −15 [g] Gleichung 1 : Gebräuchliche Masse-Einheiten Stoffmenge: Basiseinheit ist das mol. Ein mol ist die Stoffmenge, die der Molekularmasse einer Substanz inGramm entspricht. Gebräuchliche Einheiten sind: mol = 10 0 [mol] mm ( milli) = 10 −3 [mol] μm ( mikro ) = 10 −6 [mol] nm (nano ) = 10 −9 [mol] pm (pico ) = 10 −12 [mol] fm ( femto ) = 10 −15 [mol] Gleichung 2 : Gebräuchliche Stoffmengen-Einheiten Beispiel zur Umrechnung von Masse in Stoffmenge und umgekehrt:  g  Glucose = 180    mol  45[ g] 45[ g] Glucose = = 0,25[mol]  g  180    mol   g  0,05[mol] Glucose = 0,05[mol] ∗ 180   = 9[ g]  mol  Gleichung 3 : Umrechnung: Masse in Stoffmenge und vice versa Volumen: Basiseinheit ist der Liter. Gebräuchliche Einheiten sind: [ 1[l] = 1 dm 3 ] 1[ml] = 10 −3 [l] = 1 cm 3 [ ] 1[μl] = 10 −6 [l] = 1[mm ] 3 Gleichung 4 : Gebräuchliche Volumen-Einheiten Konzentration wird als Massenkonzentration oder Stoffmengenkonzentration angegeben. Massenkonzentration: Basiseinheit ist Kilogramm gelöste Substanz pro Liter Lösung. Gebräuchliche Einheitensind: -4-
  • 3. Bioanalytik  kg  g 1  = 1   l   ml  g g  mg  1  = 10 −3   = 1  l   ml   ml   mg  −6  g   μg  1  = 10  ml  = 1 ml   l       μg  g  ng  1  = 10 −9   = 1   l   ml   ml   ng  g  pg  1  = 10 −12   = 1   l   ml   ml  Gleichung 5 : Gebräuchliche Massenkonzentrations-Einheiten Stoffmengenkonzentration: Basiseinheit ist mol gelöste Substanz pro Liter Lösung. Beispiel: 1 mol/l Glucose = 180 g Glucose gelöst in H2O und durch weitere Zugabe von H2O auf 1 Liter gebracht.Gebräuchliche Einheiten und Symbole sind:  mol   mmol  1  = 1 ml  = 1[M] ( molar )  l     mmol  −3  mol   μmol  1  = 10  l  = 1 ml  = 1[mM] ( millimolar )  l       μmol  −6  mol   nmol  1  = 10  l  = 1 ml  = 1[μM] ( mikromolar )  l       nmol  −9  mol   pmol  1  = 10  l  = 1 ml  = 1[nM] ( nanomolar )  l      Gleichung 6 : Gebräuchliche Stoffmengenkonzentrations-Einheiten Beispiele: Eine 1 M Lösung von Glucose enthält 1 mol/l bzw. 1 mmol/ml oder 1 µmol/µl. Eine 1 mM Lösung vonGlucose enthält 1 mmol/l bzw. 1 µmol/ml oder 1 nmol/µl.Umrechnung von Massenkonzentration in Stoffmengenkonzentration Eine Lösung von 9 g/l Glucose ist: g 9  l = 0,05M → 50mM  g  180    mol  Eine 10 nM Lösung von Glucose hat eine Massenkonzentration von:  nmol   ng  ng μg 10   l   ∗ 180  nmol  = 1.800 l → 1,8 l   Beachten Sie die verschiedene BedeutungVerdünnen von Lösungen (Konzentration einer Substanz [S]) Volumen des Ansatzes Verdünnungsfaktor = Volumen der Ausgangslösung [S Ausgangslösung ] = [ S verdünnt ] ∗ Verdünnungsfaktor Beispiele: Zur Bestimmung einer Enzymaktivität werde 1,9 ml einer Enzymlösung (11 µg/ml) zu 0,5 ml Pufferlösung und 0,1 mlSubstratlösung (5 mM) gegeben. Das Substrat wird 25-fach (2,5 ml Ansatz / 0,1 ml Substratlösung) verdünnt. ImMessansatz ist die Substratkonzentration 0,2 mM und die Enzymkonzentration 8,4 µg/ml (Verdünnungsfaktor:2,5 ml / 1,9 ml = 1,32). Wenn im Messansatz eine Enzymaktivität von 14,4 U/ml bestimmt wird, ist die Aktivität derverwendeten Enzymlösung (14,4 U/ml x 1,32) = 19,0 U/ml. -5-
  • 4. Bioanalytik Zu 0,5 ml Serum werde eine Substanz durch Zugabe einer bestimmten Menge Fällungsreagens quantitativ ausgefällt,der Überstand nach Zentrifugation verworfen und das Präzipitat in 1,5 ml Puffer aufgelöst. Die gesamte Menge Substanz,die in 0,5 ml Serum enthalten war, ist nun in 1,5 ml enthalten (Volumen des Präzipitats ist vernachlässigbar klein).Verdünnung der Substanz: (1,5 ml/ 0,5 ml) = 3-fach. -6-
  • 5. BioanalytikKohlenhydrate Kohlenhydrate sind primäre Oxidationsprodukte mehrwertiger Alkohole. Es sind entweder Polyhydroxyaldehyde(Aldosen) oder Polyhydroxyketone (Ketosen). Sie werden eingeteilt in Monosaccharide, Oligosaccharide (Disaccharide,Trisaccharide usw.) und hochmolekulare Polysaccharide. Monosaccharide sind Aldehyde oder Ketone, die entsprechend der Anzahl ihrer C-Atome in Triosen, Pentosen,Hexosen usw. unterteilt werden. Monosaccharide und Oligosaccharide mit gleicher Anzahl C-Atome werden aufgrundder sterischen Anordnung (Konfiguration) der Substituënten an den C-Atomen unterschieden. Monosaccharide und Oligosaccharide sind gut wasserlöslich. Gewisse Polysaccharide können in heißem Wasser gelöstwerden.Zucker in Lösung haben vorwiegend zyklische Struktur Viele Eigenschaften der Monosaccharide sind auf ihre Aldehyd- bzw. Ketogruppe zurückzuführen. Diese Gruppensind im Unterschied zu gewöhnlichen Aldehyd- und Keto-Funktionen nur zum kleineren Teil in freier Form vorhanden,größtenteils liegen sie als Cyklohalbacetal (-ketal) vor. Die Ringe entstehen durch Kondensation der Aldehyd- oderKetogruppe mit einer alkoholischen OH-Gruppe desselben Monosaccharids. Zucker mit fünfgliedrigen Ringen werdenFuranosen, solche mit sechsgliedrigen Pyranosen genannt wegen ihrer Ähnlichkeit zu Furan und Pyran. Freie Pentosenund Hexosen haben in der Regel Pyranosestruktur. Dagegen liegt in Saccharose die Fructose und in Nukleïnsäuren die Ribose und Desoxyribose in der Furanoseform vor.Bei der Ringbildung sind am Hemiacetal- (bzw. Hemiketal-) Kohlenstoffatom 2 verschiedene räumliche Konfigurationenmöglich, die als α- und β-Formen bezeichnet werden (= anomere Formen). Beide gehen leicht ineinander über(Mutarotation). Der Übergang erfolgt über die offenkettige Form. Abbildung 1 : Ringbildung der Glucose (α- und β-Form)Die glycosidische Bindung Glycoside sind Zuckerderivate, bei welchen die OH-Gruppe am Hemiacetal- (bzw. Hemiketal-) Kohlenstoffatom miteinem organischen Rest (R) kondensiert ist. Je nach Konfiguration der dabei entstehenden Acetalgruppe unterscheidetman anomere α- und β-Glycoside, je nach Art der R-Gruppe O- oder N-Glycoside. Beispiel: Glycoside von Glucose. Abbildung 2 : Glykoside von Glucose -7-
  • 6. Bioanalytik Die wichtigsten Glycoside sind die Oligo- und Polysaccharide. Bei den einfachsten Oligosacchariden, denDisacchariden, lassen sich 2 Bindungstypen unterscheiden. Bei der Saccharose erfolgt die glycosidische Bindungzwischen den hemiacetalischen (bzw. hemiketalischen) OH-Gruppen beider Zuckerreste. Solche Zucker tragen deshalbkeine freie Halbacetalgruppe. Bei der Maltose erfolgt die Bindung zwischen einer hemiacetalischen und eineralkoholischen OH-Gruppe. Disaccharide des Maltose-Typs besitzen noch eine freie Halbacetalgruppe (Pfeil inuntenstehenden Formeln). Abbildung 3 : Disaccharide Chemisch können glycosidische Bindungen mit Säure gespalten werden, gegen Basen sind sie stabil. Im Organismuswerden Polysaccharide und Oligosaccharide enzymatisch gespalten.Zucker mit freier Aldehyd- oder Ketogruppe sind reduzierend Freie Aldehyde und Ketone in Zuckern sowie die entsprechenden Hemiacetale und Hemiketale werden durch mildeOxidationsmittel oxidiert. Weil bei dieser Reaktion das Oxidationsmittel durch den Zucker reduziert wird, spricht manvon reduzierenden Zuckern. Alle Monosaccharide sind reduzierend. Disaccharide und Oligosaccharide dagegen sindnur reduzierend, wenn sie noch eine freie Hemiacetal- oder Hemiketalgruppe besitzen. Disaccharide vom Saccharose-Typsind demgemäss nicht reduzierend. Hochmolekulare Polysaccharide wie Stärke und Glycogen wirken nicht reduzierend,weil in Polysaccharidlösungen die Konzentration der reduzierenden Molekülenden sehr niedrig ist. In der Benedictschen Probe wird 2-wertiges Kupfer (alkalische Lösung von CuSO 4 in Natriumcarbonat undNatriumcitrat) zur Oxidation von Zucker verwendet gemäss Cu 2 + + Glucose → Cu + + Oxidationsprodukte von Glucose Formel 1 : Benedict-Probe Während der Reaktion entsteht aus dem blauen 2-wertigen Kupfer zuerst gelbes 1-wertiges Kupferhydroxid (CuOH)und später schwerlösliches Kupfer-(I)-oxid (Cu 2O) als roter Niederschlag. Der Benedict-Test ist eine einfacheNachweismethode für reduzierende Zucker. Neben reduzierenden Zuckern geben aber auch andere reduzierendeSubstanzen eine positive Benedict-Reaktion. Für den spezifischen Nachweis einzelner reduzierender Zucker sind deshalbenzymatische Methoden notwendig. Zum spezifischen Nachweis von Glucose wird Glucoseoxidase aus Schimmelpilzverwendet, die folgende Reaktion katalysiert: Glucose + O 2 + H2 O Glucoseoxi dase →Gluconsäure + H2 O 2   Formel 2 : Enzymatischer Glucosenachweis, Schritt 1 Das entstehende Wasserstoffperoxid wird in einer gekoppelten Reaktion dazu benutzt, eine farblose Verbindung(Chromogen) zu einem Farbstoff zu oxidieren. Die Reaktion wird durch eine Peroxidase katalysiert. Peroxidase H2 O 2 + Chromogen  →Farbstoff + H2 O  Formel 3 : Enzymatischer Glucosenachweis, Schritt 2 Für den semiquantitativen Glucosenachweis z.B. im Urin dient ein Teststäbchen (Diabur-Test), das mit den beidenEnzymen und dem Chromogen imprägniert ist. Für die quantitative Glucosebestimmung wird aus einer nichtabsorbierenden Verbindung eine im UV-Bereich absorbierende Indikatorverbindung gebildet, deren Konzentrationphotometrisch gemessen wird. -8-
  • 7. BioanalytikAminosäuren und Proteïne Zwanzig verschiedene Aminosäuren sind die üblichen Bausteine der Proteïne. Man unterscheidet saure, neutrale undbasische Aminosäuren oder apolare (aliphatische, aromatische) und polare Aminosäuren. In den Proteïnen sind dieAminosäuren durch Peptidbindungen miteinander verknüpft. Formel 4 : Peptidbindung in Proteïnen Die Aminosäurensequenz (Primärstruktur) bestimmt die 3-dimensionale Anordnung der Peptidkette im Raum(Sekundär- und Tertiärstruktur). Häufig sind 2 und mehr Peptidketten mit ausgebildeter Sekundär- und Tertiärstruktur zustabilen oligomeren Molekülen zusammengelagert (Quartärstruktur).Primäre Aminogruppen von Aminosäuren und Proteïnen werden mit der Ninhydrin-Reaktion nachgewiesen Ninhydrin reagiert mit Ammoniak und primären Aminogruppen zu einem blauen Farbstoff. Formel 5 : Ninhydrin-Reaktion α-Aminosäuren werden durch Ninhydrin oxidativ desaminiert und decarboxyliert. Auf analoge Weise reagiert auchdie ε-NH2-Gruppe der Lysin-Seitenkette. Deshalb geben auch Proteïne eine positive Ninhydrin-Reaktion. Zurquantitativen Bestimmung von Aminosäuren wird die blaue Ninhydrin-Farbe photometrisch gemessen. Die Trennungverschiedener Aminosäuren durch Ionenaustauscher-Chromatographie und die anschließende photometrischeKonzentrationsbestimmung mit Ninhydrin wird im sog. Aminosäurenanalysator vollautomatisch durchgeführtBiuret-TestPeptidbindungen bilden blau-violette Cu 2+-Komplexe In stark alkalischer Lösung entstehen aus Proteïnen und Kupfersulfat Koordinationskomplexe zwischen Cu 2+-Ionenund benachbarten Amid-Stickstoffatomen von Peptidbindungen. Biuret (H 2N-CO-NH-CO-NH2) ist die einfachsteVerbindung, welche einen derartigen blauvioletten Kupferkomplex bildet. Der Biuret-Test dient zur quantitativenphotometrischen Proteïnbestimmung. Die Farbe des Komplexes ist in der Regel unabhängig von der Art des Proteïns, sodass eine für Serumalbumin bestimmte photometrische Kalibrierkurve auch für viele andere Proteïne benutzt werdenkann. Tryptophan und Tyrosin geben den Proteïnen ein charakteristisches UV-Spektrum mit Absorptionsmaximum bei280 nm. Wie die Spektren in Abb. 4 zeigen, trägt Tryptophan am meisten und Phenylalanin kaum zur Absorption derProteïne im nahen UV-Bereich bei. Abbildung 4 : Absorptionsspektren der aromatischen Aminosäuren -9-
  • 8. Bioanalytik In Abb. 4 bedeutet εmM „millimolarer Extinktionskoëffiziënt“. Der millimolare Extinktionskoëffiziënt ist dieAbsorption einer millimolaren Lösung der entsprechenden Aminosäure. Je nach dem Gehalt an aromatischenAminosäuren ändert die UV-Absorption von Proteïnen. In Abbildung 5 sind die UV-Spektren von Lösungen gleicherMassenkonzentration (mg/ml) von Lysozym, γ-Globulin und Ribonuclease dargestellt. Alle Peptide und Proteïneabsorbieren sehr stark bei 220 nm aufgrund ihrer Peptidbindungen. Die 3 Proteïne enthalten unterschiedlich viel Tyrosinund Tryptophan. Zur Konzentrationsbestimmung kann die UV-Absorption bei 280 nm benutzt werden, wegen desvariablen Gehalts an aromatischen Aminosäuren gilt jedoch eine Kalibrierkurve nur für ein bestimmtes Proteïn. MancheProteïne absorbieren sichtbares Licht. Für das sichtbare Absorptionsspektrum sind prosthetische Gruppen verantwortlich(Häm, Flavin, etc.). Abbildung 5 : Absorptionsspektren von Proteinen mit verschiedenem Gehaltan aromatischen Aminosäuren Die Spektren wurden mit Proteïnlösungen gleicher Konzentration (1 mg/ml) aufgenommen. Proteïn Tryptophangehalt Tyrosingehalt Lysozym (Hühnereiweiß) 8,6 4,0 Ovalbumin (Hühnereiweiß) 1,3 3,8 Ribonuclease (Rind) 0,0 7,9 Tabelle 1 :Tryptophan- und Tyrosingehalt in g Aminosäure pro 100 g ProteïnGroßmolekulare Proteïne werden von kleinen Molekülen durch Dialyse oderGelchromatographie abgetrennt Gewisse Cellophanmembranen sind für große Moleküle undurchlässig, für Wasser und andere kleine Moleküledurchlässig. Wird eine Proteïn-Salzlösung in einem Cellophanschlauch für längere Zeit (Stunden) in Wasser eingetaucht,so stellt sich für die frei passierbaren Moleküle durch Diffusion ein Konzentrations-Gleichgewicht über das gesamteFlüssigkeitsvolumen ein. Die großen Proteïnmoleküle werden im Schlauch zurückgehalten. Der Vorgang wird Dialysegenannt. Durch Dialyse können Proteïnlösungen entsalzt werden, oder ein Proteïn in einem Puffer A kann durch Dialysein einen neuen Puffer B gebracht werden. Die Hämodialyse (künstliche Niere) arbeitet nach demselben Prinzip. Mit derGelchromatographie ist eine feinere Trennung von Molekülen unterschiedlicher Größe möglich als mit der Dialyse.Molekularmasse von Proteïnen Die meisten Proteïne haben eine Molekularmasse (M r) im Bereich 10.000 bis 100.000. Proteïn Molekularmasse Glucagon (ein Peptid) 4.500 Ribonuclease 13.700 Myoglobin 17.000 Chymotrypsin 25.000 Hämoglobin 64.500 Serumalbumin 69.000 Aldolase 160.000 Phosphorylase a 390.000 Tabelle 2 : Molekularmasse einiger Proteïne - 10 -
  • 9. Bioanalytik Gebräuchliche Methoden zur Molekularmassebestimmung von Proteïnen sind Gelchromatographie, SDS-Gelelektrophorese und Sedimentationsanalyse in der Ultrazentrifuge. Die heute gebräuchlichste Methode ist die SDS-Gelelektrophorese. Bei dieser speziellen Elektrophoresemethode ist die Wanderungsgeschwindigkeit im elektrischen Feldfast ausschließlich eine Funktion der Molekülgröße. Proteïne mit niedriger Molekularmasse wandern schneller als solchemit hoher Molekularmasse. Die SDS-Gelelektrophorese ist nicht zu verwechseln mit der üblichen Proteïnelektrophorese,bei der native Proteïne aufgrund ihrer Ladung getrennt werden. Die Molekularmassebestimmung in der Ultrazentrifuge ist aufwendig. Sie gibt aber zusätzlich Information über dieForm und den Aggregationszustand von Proteïnmolekülen. Im künstlichen Schwerefeld der Ultrazentrifuge ist dieSedimentationsgeschwindigkeit Vs der Partikel von ihrer Größe abhängig gemäss Vs = S@Γ. Die Zentrifugalfeldstärke Γwird bestimmt durch den Radius der Zentrifuge und die Tourenzahl. S ist die für die untersuchte Partikelcharakteristische Sedimentationskonstante, welche experimentell gemäss der obigen Gleichung bestimmt werden kann.S ist unter anderem eine Funktion der Molekülmasse, und daher kann letzteres aus dem experimentell bestimmten Sberechnet werden. Die Beziehung lautet:  ρ  M ∗ D ∗ 1 − m   ρp  S=   R ∗T Gleichung 7 : Berechnung der Sedimentationskonstanten M = Molekularmasse, D = Diffusionskonstante, ρm und ρp = Dichte von Medium und Partikel, R = Gaskonstante,T = Temperatur (absolut). Die Sedimentationskonstanten werden in Svedberg-Einheiten [S] (1 Svedberg = 10-13 sec)ausgedrückt und auf ρm von Wasser und 20 °C normalisiert (S20,w). Typische Werte sind: Myoglobin 2 Ribosomen- 40 Untereinheiten 60 Viren 200 Zellen (komplett) 1000 Tabelle 3 : Typische Werte für SDenaturierung von Proteïnen Die native Struktur von Proteïnen wird unter dem Einfluss verschiedenster Faktoren zerstört, dazu gehören Wärme,Schaumbildung, Zusatz von organischen Lösungsmitteln, Säuren, Basen, Schwermetallionen oder hohe Konzentrationvon Harnstoff. Die für die Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur verantwortlichen, nicht-kovalenten Bindungen werdenteilweise oder ganz gelöst, während die für die Primärstruktur verantwortlichen kovalenten Bindungen erhalten bleiben.Man bezeichnet diesen Prozess der partiellen oder vollständigen Entfaltung der Peptidkette als Denaturierung. Eindenaturiertes Proteïn hat die gleiche Primärstruktur wie das native, hat aber keine einheitliche räumliche Struktur undandere physikalisch-chemische Eigenschaften (Beispiel: Hartwerden von Eiern beim Kochen). Bei der Denaturierung geht die biologische Aktivität verloren. (Beispiele: Hitze-Inaktivierung von Enzymen undProteïnhormonen). Denaturierung kann, muss aber nicht reversibel sein. Denaturierung verringert in der Regel die Löslichkeit der Proteïne. Denaturierte Proteïne werden von Proteasenleichter gespalten als native: gekochtes Fleisch ist leichter verdaulich.Proteïne sind an ihrem isoelektrischen Punkt am wenigsten löslich Die Löslichkeit der Proteïne variiert stark. Globuläre Proteïne wie Serumalbumin und Globuline sind im allgemeinengut, Faserproteïne (Kollagen, Keratin) sehr schlecht löslich. Proteïne sind Polyelektrolyte. Elektrostatische Kräftezwischen Proteïnmolekülen einerseits und zwischen Proteïnmolekülen und Wasserdipolen andererseits beeinflussen dieLöslichkeit. Proteïne mit vielen geladenen Gruppen sind häufig gut wasserlöslich. Die Löslichkeit eines Proteïns ist amgeringsten, wenn seine Gesamtladung gleich Null ist. Dies ist der Fall, wenn das Molekül gleich viele positive wienegative Ladungen trägt. Man bezeichnet den pH-Wert der wässrigen Lösung, bei dem dies zutrifft, als isoelektrischenPunkt (IEP) des Proteïns. Manche Proteïne fallen am IEP aus (= werden unlöslich). Bei pH-Werten über und unter demIEP bewirken negative bzw. positive Überschussladungen gegenseitige Abstoßung der Proteïnmoleküle und damit bessereLöslichkeit. - 11 -
  • 10. Bioanalytik Abbildung 6 : Löslichkeit von β-Lactoglobulin (IEP 5,2) in Abhängigkeit vom pH-Wert bei 25 °C. Die Löslichkeit ist bei pH 6,0 mehr als 40 mal größer als bei pH 5,2.Proteïne werden aus wässrigen Lösungen durch Zugabe von Salz, organischenLösungsmitteln oder bestimmten Säuren ausgefällt Zur Isolierung und Reinigung werden Proteïne häufig ausgefällt. Solche Fällungen müssen reversibel sein, soll dasProteïn seine biologische Aktivität behalten: Ein isoliertes Enzym muss nach der Fällung wieder gelöst werden könnenund unverminderte Aktivität besitzen. Bei manchen Analysemethoden stören anwesende Proteïne; sie werden deshalbirreversibel ausgefällt (z.B. durch ein Fällungsreagens wie Perchlorsäure oder Trichloressigsäure) und durchZentrifugation abgetrennt. Eine solche "Deproteïnisierung" ist z.B. nötig bei der Bestimmung von Glucose im Serum. Die meisten Fällungen beruhen auf der Änderung der elektrostatischen Wechselwirkungen zwischenProteïnmolekülen. So werden Proteïne aus wässrigen Lösungen durch Zugabe von organischen Lösungsmitteln ausgefällt,weil in organischen Lösungsmitteln die gegenseitige Anziehung der geladenen Proteïnmoleküle größer wird (Proteïnehaben ein unregelmäßiges Muster von positiven und negativen Ladungen auf ihrer Oberfläche). Gemäss demCoulombschen Gesetz über die Anziehung entgegengesetzt geladener Teilchen nimmt die elektrostatische Anziehungmit abnehmender Diëlektrizitätskonstante des Mediums zu. Organische Lösungsmittel haben eine niedrigereDiëlektrizitätskonstante als Wasser. Industriell bedeutungsvoll ist die Fällung von Blutplasmaproteïnen mit Alkohol undAceton (Cohn-Fraktionierung). Die Fällung geschieht bei tiefen Temperaturen, damit die Plasmaproteïne nichtirreversibel denaturiert werden. Zusatz eines Salzes in hoher Konzentration zu einer Proteïnlösung bewirkt die Erniedrigung der effektivenKonzentration (Aktivität) des Wassers und dadurch eine Herabsetzung der für die Lösung des Proteïns verfügbarenWassermenge. Das Proteïn wird ausgefällt. Man bezeichnet die durch Salzzugabe bewirkte Ausfällung als Aussalzung.Sie ist meist reversibel und deshalb zur Isolierung von Enzymen geeignet. Gewöhnlich wird für die AussalzungAmmoniumsulfat verwendet, weil es besonders gut löslich ist. Zur Ausfällung von verschiedenen Proteïnen werdenunterschiedliche Konzentrationen von Ammoniumsulfat benötigt. Ein Proteïngemisch kann deshalb durch schrittweisesZufügen von Ammoniumsulfat aufgetrennt werden. - 12 -
  • 11. BioanalytikLipide Die Lipide sind eine heterogene Stoffklasse. Ein hoher Gehalt an hydrophoben Gruppen ist ihnen gemeinsam. Lipidesind daher in organischen Lösungsmitteln gut, in Wasser schlecht löslich. Die Lipide können unterteilt werden ineinfache Lipide, komplexe Lipide und Isoprenoidlipide. Zu den einfachen Lipiden gehören die Neutralfette oderTriacylglycerole. Es sind häufige Nahrungsbestandteile und Energiespeicher der Zelle. Zu den komplexen Lipiden werdenz.B. die Membranbestandteile Lecithin, Cerebroside und Cardiolipin gezählt. Die Isoprenoidlipide sind Abkömmlinge desIsoprens und umfassen Verbindungen wie Cholesterin, Vitamin A, Steroidhormone und Gallensäuren. Cholesterin ist einuniverseller Membranbestandteil, aber auch Ausgangsprodukt für die Biosynthese von Gallensäuren, Steroidhormonenund Vitamin D.Die physikalischen Eigenschaften der Neutralfette werden durch die Struktur derFettsäuren bestimmt Die Fette und Öle der Nahrung sind Gemische verschiedener Triacylglycerole. Triacylglycerole sind Verbindungen,die aus einem Molekül Glycerol, verestert mit 3 Molekülen Fettsäure, bestehen. Sie tragen im Gegensatz zu denkomplexen Lipiden keine ionisierbaren Gruppen, daher auch der Name Neutralfette. Die physikalischen und chemischenEigenschaften der Neutralfette sind je nach Fettsäurenzusammensetzung verschieden. So ist der Schmelzpunkt von Fettenum so niedriger, je kürzer die Fettsäuren und je größer die Zahl der ungesättigten Bindungen. Öle enthalten vorwiegendTriacylglycerole mit ungesättigten Fettsäuren. Tierische Fette haben einen Schmelzpunkt, der etwas unter derphysiologischen Gewebstemperatur liegt. Fett aus dem Unterhautfettgewebe hat einen niedrigeren Schmelzpunkt als Fettaus dem Innern des Körpers. Fettsäuren und Lipide, die ungesättigte Fettsäuren enthalten, werden leichter oxidiert als gesättigte Fettsäuren. DasRanzigwerden von Fetten beruht zum Teil auf oxidativer Spaltung an den Doppelbindungen, wobei stark riechendeAldehyde oder Säuren geringerer Kettenlänge entstehen.Seifen, Detergentiën und Gallensäuren emulgieren wasserunlösliche Lipide In Haushalt und Labor werden wasserunlösliche Lipide mit Seifen oder Detergentiën emulgiert. Im tierischenOrganismus haben die Gallensäuren eine ähnliche Aufgabe. Die 3 Verbindungen sind aus einem hydrophoben, apolarenKohlenwasserstoffgerüst und einem hydrophilen, polaren „Kopfteil“ aufgebaut. Solche Verbindungen lösen sich inorganischen Lösungsmitteln in der protonierten Form, im Wasser als Anionen. Sie sind amphiphil. In Öl-Wasser Gemischen reichern sich amphiphile Verbindungen an der Grenzfläche zwischen Öl und Wasser an. Sie sindoberflächenaktiv, d.h. sie erleichtern die Vergrößerung von Grenzflächen und ermöglichen so die Bildungmikroskopisch kleiner Öltröpfchen im Wasser; das Öl wird emulgiert. Im Unterschied zu einer echten Lösung sind aberdie Lipidmoleküle in der Emulsion nicht direkt von Wassermolekülen umgeben, sondern von einer Hülle aus Seife,Detergens- oder Gallensäuremolekülen. Formel 6 : Unterschiede bei Seife, Detergens- und GallensäuremolekülenNur emulgierte Neutralfette können durch Lipase hydrolysiert werden Im Dünndarm werden Neutralfette durch die Pankreaslipase in Monoacylglycerole und freie Fettsäuren gespalten. DieLipase, ein Proteïnmolekül, ist nur in wässriger Phase löslich und aktiv. Die physiologische Funktion der Gallensäurenbesteht darin, die Neutralfette zu kleinen Tröpfchen zu emulgieren, so dass eine große Grenzfläche für den Angriff derLipase zur Verfügung steht. Im Blut werden wasserunlösliche Lipide an Proteïne gebunden transportiert. Fettsäuren werden an Serumalbumingebunden, Neutralfette, Cholesterin und Phospholipide an spezielle Lipoproteïne. Low Density Lipoproteïne (LDL) alshauptsächliche Träger von Cholesterin und Cholesterinestern sind besonders bedeutsam. Erhöhte Blutcholesterin-Wertesind ein Risikofaktor für die Entstehung von Arteriosklerose. Die Chylomikronen sind lichtmikroskopisch sichtbareAggregate von Neutralfetten, umgeben von weniger hydrophoben Phospholipiden und hydrophilen Proteïnen. Es sindTransportvehikel für schwerlösliche Lipide aus der Dünndarmmucosa via Lymphe in die Blutbahn. - 13 -
  • 12. BioanalytikBiologische Membranen Biologische Membranen verschiedener Herkunft (Plasmamembran, ER 1, Mitochondriënmembran, Golgi-Apparat,u.a.) können sich nicht nur in ihrer Proteïnzusammensetzung, sondern auch in ihrer Lipidzusammensetzung starkunterscheiden. Ebenso können sich je nach Zelltyp die Gesamtmenge und die Anteile der verschiedenen biologischenMembranen unterscheiden. Die Erythrozytenmembran besteht wie andere biologische Membranen hauptsächlich ausLipiden und Proteïnen. Die Lipid-Doppelschicht ist 6-7 nm dick und enthält in einem Feld von 1 µm2 etwa 5 x 106Lipidmoleküle. Die speziellen Eigenschaften der Membranlipide ermöglichen, dass sich die Lipidmoleküle spontananeinander lagern und durch nicht-kovalente Wechselwirkungen zusammengehalten werden. Die Lipidfraktion umfasstpolare Lipide, vor allem Glycerolphosphatide, aber auch Sphingolipide sowie Cholesterin. Die Grundstruktur derGlycerolphosphatide ist die mit einem Alkohol (R-OH) veresterte Phosphatidsäure. Formel 7 : Grundstruktur der Glycerolphosphatide R1 und R2 sind langkettige Fettsäuren. R2 ist meist eine ungesättigte Fettsäure, häufig die hochungesättigteArachidonsäure (20:4), die nach Abspaltung aus Phospholipiden als unmittelbare Vorstufe zur Synthese hormonähnlicherLipidsubstanzen dient (Prostaglandine, Thromboxane einerseits und Leukotriëne andererseits). Die polare Kopfgruppe Xbestimmt den Typ des Phospholipids.Die 3 häufigsten Phospholipidtypen Phospholipidtyp „Kopfgruppe“ (-X) − CH2 CH2N( CH3 ) 3 + Phosphatidylcholin PC + Phosphatidylethanolamin PE − CH2 CH2NH3 Phosphatidylserin PS ( − CH2 CH2 NH3 COO − + ) Phosphatidsäure −H Tabelle 4 : Phospholipidtypen Die Kohlenwasserstoffketten (Acylgruppen) der Membranlipide können entweder in starrem, geordnetem Verbandoder in relativ ungeordnetem, „flüssigem“ Zustand existieren. Der starre Zustand wird begünstigt durch gesättigteFettsäuren, während ungesättigte Fettsäuren infolge der cis-Doppelbindung(en) die geordnete Packung der Acylkettenstören. Biologische Membranen sind asymmetrisch aufgebaut. Während PC vorwiegend und Glycolipide fastausschließlich auf der extrazellulären Seite der Lipidmembran gefunden werden, befinden sich PE und PS hauptsächlichauf der cytoplasmatischen Seite. Einige der neutralen Glycolipide sind für die Blutgruppenspezifität von roten Blutzellenverantwortlich. Abbildung 7 : Schnitt durch eine Lipid-DoppelschichtSchnitt durch eine Lipid-Doppelschicht, die in der Darstellung eine flüssigkeitsähnliche Packungsdichte der Kohlenwasserstoffketten aufweist. Im dargestellten 30x30 Å großenSchnitt befinden sich sechs Cholesterinmoleküle, fünf Glycerophospholipidmoleküle (3 Typen) und vier Sphingolipidmoleküle (2 Typen). Die OH-Gruppe des Cholesterinmolekülssitzt an der Oberfläche der Lipid-Doppelschicht, während das Steroid-Ringsystem sich im äußeren Anteil der Lipid-Doppelschicht befindet und mitverantwortlich ist für eineVersteifung der Doppelschicht in diesem Bereich.1 Endoplasmatisches Retikulum - 15 -
  • 13. Bioanalytik Abbildung 8 : Diffusion von Phospholipidmolekülen in einer Lipid-DoppelschichtDie spontane “Flip-Flop-Bewegung” ist ein äußerst seltenes Ereignis. - 16 -
  • 14. BioanalytikNucleïnsäuren Zur Reinigung und Trennung großmolekularer Nucleïnsäuren, deren Aufbau und Struktur hier nicht behandeltwerden soll, dienen ähnliche Methoden wie für Proteïne; die Gelchromatographie zur Trennung nach Molekülgröße unddie SDS-Gelelektrophorese zur Molekularmassebestimmung. Oligonucleotide können aufgrund ihres Gehalts an negativgeladenen Phosphatgruppen durch Ionenaustauschchromatographie getrennt werden. Nucleïnsäuren sind gutwasserlöslich, fallen aber in saurem Milieu aus. Gegen Wärme oder organische Lösungsmittel sind Nucleïnsäurenwesentlich stabiler als Proteïne. Chemisch können Nucleïnsäuren durch Kochen in Säure in die Bausteine Phosphat,Pentose und Nucleïnbasen zerlegt werden. Im Organismus werden sie durch Nucleasen verschiedener Spezifität zu Oligo-und Mononucleotiden hydrolysiert. Pankreatische Ribonuclease spaltet die Esterbindung zwischen der Phosphatgruppeeines Pyrimidinnucleotids und dem C 5 der Ribose des nächsten Nucleotids. Es entstehen freie Pyrimidin-3-phosphate undOligonucleotide mit einem Pyrimidin-3-phosphat am einen Ende.Die Purine und Pyrimidine haben ein Absorptionsmaximum bei 260 nm Das Absorptionsmaximum ist um rund 20 nm im kurzwelligeren Bereich des Spektrums als dasjenige der Proteïne.Die Extinktionskoëffiziënten der Purine und Pyrimidine sind wesentlich höher als diejenigen von Tryptophan undTyrosin. Im allgemeinen sind die Spektren aller Nucleïnsäuren gleich, allerdings gibt es gewisse von Struktur undKonformation abhängige Unterschiede. Zum Beispiel ändert sich das Spektrum von DNA bei der Denaturierung vondoppelsträngiger zu einsträngiger DNA.Das unterschiedliche UV-Spektrum von reduzierten und oxidierten Pyridinnucleotidenwird zur Messung vieler Enzymreaktionen benutzt Pyridinnucleotide (NAD+↔NADP+) absorbieren ebenfalls maximal bei 260 nm, der Nicotinamidrest zeigt zusätzlicheine vom Redoxzustand (NAD+↔NADH) abhängige Absorption im längerwelligen UV. Enzymreaktionen, die mit denReaktionen NAD+↔NADH oder NADP↔+NADPH gekoppelt sind, können daher bequem photometrisch verfolgtwerden. Die Methode, historisch als „Optischer Test nach Warburg" bekannt, wird im klinisch-chemischen Laboraußerordentlich häufig angewandt. - 17 -
  • 15. BioanalytikpH-Messung und Titration Eine Säure kann nach Brönsted definiert werden als eine Substanz, die in Lösung in ein Wasserstoffion und diekonjugierte Base A- dissoziiert. Eine Base ist eine Substanz, die ein Wasserstoffion aufnehmen kann und dadurch zurkonjugierten Säure wird. Diese Beziehungen sind gegeben durch die folgenden Gleichgewichte: AH ⇔ A + + H − ( Säure ) B + H + ⇔ BH + (Base ) Formel 8 : Brönstedsche Säure-Base-Definition Je nach Lage des Gleichgewichts kann eine Säure in wässriger Lösung in der undissoziierten, der dissoziierten Formoder einer Mischung der beiden vorliegen. Wasserstoffionen existieren in wässriger Lösung nur in hydratisierter Form alsH3O+. Aus Gründen der Vereinfachung wird aber im folgenden auf diese Schreibweise verzichtet. Bei der acidimetrischen Titration von Säuren werden sowohl die freien wie auch alle potentiell dissoziierbarenWasserstoffionen (undissoziierte saure Äquivalenzen) erfasst. Bei der pH-Messung (pH = -log (H+)) wird nur die freieH+-Konzentration (bzw. Aktivität) gemessen. Starke Säuren sind in wässriger Lösung vollständig dissoziiert. Eine 0,1 M HCl-Lösung liegt beispielsweisevollständig in Form von H+ und Cl--Ionen vor und ergibt daher eine H+-Konzentration von 0,1 M = 10-1 M, also einen pH-Wert von 1. Acidimetrische Titration und pH-Messung liefern in diesem Fall das gleiche Resultat. Bei einer schwachen Säure ist die Dissoziation unvollständig. Das Gleichgewicht zwischen der dissoziierten undundissoziierten Form ist gegeben durch die Säuredissoziationskonstante Ka: [ A ] + [H ] =K − + [ AH ] a Gleichung 8 : Definition der Säuredissoziationskonstante Je schwächer eine Säure, desto kleiner ist Ka. Acidimetrische Titration und pH-Messung liefern ungleiche Resultate.Eine 0,1 M Essigsäurelösung ist z.B. nur zu 1,5 % dissoziiert. Ihr pH-Wert ist etwa 2,85. Gl. 8 gestattet die Berechnungdes pH-Wertes von wässrigen Lösungen schwacher Säuren, von Wasser, von wässrigen Lösungen von Salzen einerschwachen Säure und einer starken Base und von Mischungen der Lösungen solcher Salze und der zugehörigenschwachen Säure (Pufferlösungen).Berechnung des pH-Wertes einer schwachen Säure Wenn eine schwache Säure der Hauptlieferant von H+ ist, dann ist [H+] = [A-]. Gl. 8 wird somit umgeformt in: [H ] + 2 = Ka [ AH ] [ H ] = K [ AH ] + 2 a 2 ∗ log[ H ] = log K + log[ AH ] + a Gleichung 9 : Säuredissoziationskonstante einer schwachen Säure Bei einer schwachen Säure in einer Konzentration > 10 * Ka entspricht [AH] fast der ursprünglichenGesamtkonzentration c [mol/l], somit [ ] log H + = ( log K a + log c ) / 2 pH = ( pK a − log c ) / 2 Gleichung 10 : pH-Wert einer schwachen Säure wobei pKa = -log Ka. Damit lässt sich der pH-Wert einer schwachen Säure angenähert berechnen. Für 0,01 MEssigsäure (pKa 4,7) ist der berechnete pH-Wert 3,35.Berechnung des pH-Wertes von Wasser Wasser ist eine sehr schwache Säure und die Konzentration der undissoziierten Form (H 2O) ist praktisch in allenwässrigen Lösungen konstant (55 M). Das Dissoziationsgleichgewicht ist somit [ H ] ∗ [OH ] = 1,7 ∗10 + − −16 = KA 55 Gleichung 11 : Dissoziationsgleichgewicht von Wasser Daraus ergibt sich das Ionenprodukt, Kw, des Wassers - 19 -
  • 16. Bioanalytik [H ] ∗ [OH ] = 10 + − −14 = K W ( 25°C ) Gleichung 12 : Ionenprodukt des Wassers In Abwesenheit anderer H -Donatoren ist [H+] = [OH-], und daher [H+]2 = l0-14, bzw. pH = 7. Dies ist der pH-Wert von +reinem Wasser. Wegen der Aufnahme von Kohlensäure aus der Luft ist der pH-Wert von destilliertem Wasser jedochmeist niedriger (≈ pH 5).Berechnung des pH-Wertes einer Lösung des Salzes einer schwachenSäure mit einer starken Base Salze starker Säuren mit starken Basen sind in wässriger Lösung annähernd neutral; hingegen sind Salze schwacherSäuren mit starken Basen leicht alkalisch. Ein solches Salz ist in wässriger Lösung vollständig dissoziiert: XA = X+ + A-.A- reagiert mit H2O gemäss A- + HOH = AH + OH-. Da die Menge von AH gleich der Menge des gebildeten OH- ist, undda [A-] praktisch gleich der Salz-Konzentration [Salz] ist, folgt aus Gl. 8 [ H ] = [ AHA] ∗]K + a = [OH ] ∗ K − a [ − [ Salz ] [OH ] = [ K ] − H W + [ H ] = [ HK ] ∗ [K ] + ∗ + a Salz W [ ] log H + = log KW K + log a − log [ Salz ] 2 2 2 pH = 7 + pK a + log [ Salz ] 2 2 Gleichung 13 : pH-Wertes einer Lösung des Salzes einer schwachen Säure mit einer starken Base Nach Gl. 13 ist der pH-Wert von 0,1 M Na-Acetat 8,85.Berechnung des pH-Wertes einer Pufferlösung Lösungen, die eine schwache Säure (AH) und deren Salz (X+, A-) enthalten, werden Pufferlösungen genannt. Siekönnen dank dem gleichzeitigen Vorhandensein der konjugierten Säure (AH) und Base (A-) Wasserstoffionen bindenoder abgeben. Sie vermögen deshalb Änderungen der H+-Konzentration bei Zugabe von Säuren oder Basen innerhalbenger Grenzen abzudämpfen. Dieses als Pufferwirkung bezeichnete Verhalten spielt eine grundlegende Rolle bei derAufrechterhaltung des pH-Wertes in physiologischen Systemen und auch bei der Kontrolle des pH-Wertes inExperimenten. Pufferlösungen können durch partielle Neutralisierung einer schwachen Säure mit einer starken Base (z.B. NaOH),oder praktischer durch Vermischen einer Lösung der Säure und der Lösung eines ihrer Alkalisalze hergestellt werden. Der pH-Wert einer Pufferlösung bekannter Zusammensetzung lässt sich nach Gl. 8 berechnen. Unter der Annahme,dass [AH] der zugegebenen totalen Säurekonzentration und [A-] der zugegebenen totalen Salzkonzentration entspricht(diese Annahme ist nur gültig im Bereich, wo der Anteil von Säure oder Salz mehr als 5 % oder weniger als 95 % ihrerSumme ausmacht), ergibt sich: [ H ] = K [[AH]] = K [ Säure] ] + A a − [ Salz a  [ Säure]  log[ H ] = log K +   [ Salz ]   a  pH = pK a + log [ Salz ] = pK + log A − [ ] [ Säure] a [ AH ] Gleichung 14 : Henderson-Hasselbalch-Gleichung Aus Gl. 14 folgt, dass pH = pKa, wenn [A-] = [AH]; d.h. der pH-Wert einer zur Hälfte neutralisierten schwachenSäurelösung entspricht ihrem pK a-Wert. Beispiele: Zu 10 ml 0,1 M Essigsäure werden 5 ml 0,1 M NaOH zugefügt. Damit wird die Hälfte der Essigsäure in die Salzformübergeführt, so dass [Salz]/[Säure] = 5/5 wird. - 20 -
  • 17. Bioanalytik 5 pH = 4 ,7 + log = 4,7 + log 1 = 4 ,7( pH = pK a ) 5 Zu 10 ml 0,1 M Essigsäure werden 0,2 ml 1 M NaOH zugefügt. Das entspricht der Addition von 2 ml 0,1 N NaOH.Damit wird 1/5 der Essigsäure in die Salzform übergeführt, so dass [Salz]/[Säure] = 1/4 wird. 1 pH = 4 ,7 + log = 4,7 + log 0 ,25 = 4,7 + 0 ,4 − 1 = 4,1 4 Zu 10 ml 0,15 M Na2HPO4 werden 5 ml 0,15 M NaH2PO4 zugefügt (pKa2 = 7,2) 10 pH = 7 ,2 + log = 7 ,2 + 0,3 = 7 ,5 5 Aus je 0,3 M Na2HPO4 und NaH2PO4 soll eine 0,15 M Phosphatpufferlösung mit pH = 7,4 hergestellt werden. 7 ,4 = 7 ,2 + log [ Salz ] [ Säure] log [ Salz ] = 7 ,4 − 7 ,2 = 0,2 = [ Salz ] = 1,58 [ Säure] [ Säure] Also müssen 1,58 Teile 0,3 M Na2HP04, 1 Teil 0,3 M NaH2P04 und 2,58 Teile H20 gemischt werden.Ampholyte Substanzen, welche sowohl saure wie basische Gruppen enthalten, nennt man Ampholyte, z.B. Aminosäuren sindAmpholyte. Bei Säurezusatz verhalten sich Aminosäuren wie Basen, bei Basenzusatz wie Säuren (Zwitterionen): Formel 9 : Ampholyt Am isoelektrischen Punkt (IEP) liegen sie als Zwitterionen vor. Der isoelektrische Punkt ist derjenige pH-Wert, beiwelchem die Nettoladung der Aminosäure gleich Null ist. Bei diesem pH-Wert wandert die Aminosäure in einemelektrischen Feld nicht. Da Proteïne aus Aminosäuren zusammengesetzt sind, sind Proteïne auch amphoter und weisenauch einen IEP auf. Der IEP eines Proteïns wird durch Elektrophorese bestimmt: Der pH-Wert der Proteïnlösung wird solange variiert, bis keine Wanderung im elektrischen Feld mehr feststellbar ist.Berechnung des isoelektrischen Punktes einer Aminosäure Der pKa-Wert der Carboxylgruppe wird pK1 genannt, derjenige der Aminogruppe pK2. Am isoelektrischen Punkt ist 1 pH = ∗ ( pK 1 + pK 2 ) 2 Glycin: pK 1 = 2,34 pK 2 = 9 ,60 IEP = 5,97 Gleichung 15 : IEP einer Aminosäure Saure und basische Aminosäuren haben 3 pKa-Werte: Formel 10 : Dissoziation von sauren und basischen Aminosäuren (Aspartat) pK1 = 1,88, pK2 = 3,65, pK3 = 9,60, IEP = 2,77 - 21 -
  • 18. Bioanalytik Aminosäure Carboxylgruppe Α-Aminogruppe Seitenkettengr.2 IEP (protonierte Form) Glycin 2,30 9,60 5,95 Asparaginsäure 1,90 9,60 3,70 (β-COOH) 2,80 Glutaminsäure 2,20 9,70 4,30 (α-COOH) 3,50 Tyrosin 2,20 9,10 10,10 (-OH) 5,65 Cysteïn 1,90 10,70 8,40 (-SH) 5,15 Histidin 1,80 9,20 6,0 (Imidazolium) 7,60 Lysin 2,20 9,00 10,5 (ε-NH3+) 9,75 Arginin 2,20 9,00 12,5 (Guanidinium) 10,75 Tabelle 5 : pKa- und IEP-Werte einiger AminosäurenTitrationskurven zeigen die Abhängigkeit des pH-Wertes vom Verhältnis Base / Säure Der Verlauf der Titrationskurve einer einzelnen protonierbaren Gruppe wird von der Henderson-HasselbalchschenGleichung vorausgesagt. Die Titrationskurve eines Gemisches von Aminosäuren oder einer Proteïnlösung ist die Summeder Titrationskurven der einzelnen ionisierbaren Gruppen. In der Praxis wird statt des Verhältnisses Base / Säure dieMenge der zugegebenen Base gegen den pH-Wert aufgetragen. Titrationskurven zeigen anschaulich, dass bei Zugabeeiner gleich großen Menge Base oder Säure die pH-Änderung im Bereich der pK-Werte gering, im Bereich derÄquivalenzpunkte groß ist. Als Faustregel gilt: Aminosäuren (aber auch andere Säuren und Basen) puffern gut im pH-Bereich von pK ±0,5.pH-Indikatoren sind schwache Elektrolyte, bei denen die protonierte und die nicht-protonierte Form verschiedenfarbig sind Sie wechseln deshalb im Bereich ihres pK a über ein Intervall von 1-2 pH-Einheiten die Farbe. Statt eine Titration ampH-Meter zu verfolgen, kann durch Zusatz eines geeigneten Indikators der Endpunkt der Titration am Farbwechsel desIndikators erkannt werden.2 In Proteïnen gelten oft andere pK-Werte, weil im Proteïnverband räumlich benachbarte Seitenketten sich gegenseitig beeinflussen können. Beispiel: -COO -,NH3+-, pKNH2 steigt, pKCOO- sinkt. - 22 -
  • 19. BioanalytikElektrophorese Unter Elektrophorese versteht man die Wanderung von geladenen Partikeln in einem elektrischen Feld. Je nachdem,ob die Nettoladung dieser Substanzen positiv oder negativ ist, wandern sie zur Kathode (negativer Pol) oder zur Anode(positiver Pol). Unterschiede in der Nettoladung äußern sich in Unterschieden der Wanderungsgeschwindigkeit undkönnen so zur Trennung von Substanzgemischen verwendet werden. Die Elektrophorese ist eine wichtige Methode zurTrennung von Aminosäuren, Peptiden und Proteïnen. Wegen ihres Ampholytcharakters wandern diese Verbindungen jenach ihrem isoelektrischen Punkt (IEP) und je nach dem pH-Wert des Milieus zur Kathode oder zur Anode. Wenn derpH-Wert dem IEP des Ampholyts entspricht, erfolgt keine Wanderung. Die gebräuchlichste Methode zur Auftrennung von Gemischen ist die Zonenelektrophorese. Eine kleine Menge deszu trennenden Gemisches wird als schmale Zone auf einem mit Puffer getränkten Träger aufgetragen. ÜblicheTrägermaterialien sind Agarose-Gel und Polyacrylamid-Gel. An den Elektrophorese-Träger wird eine Gleichspannungangelegt. Unter dem Einfluss des im Streifen wirksamen elektrischen Feldes kommt es zur räumlichen Auftrennung derKomponenten, die durch geeignete Anfärbemethoden lokalisiert und auch quantitativ bestimmt werden können. Abbildung 9 : Elektropherogramm von Serum eines Menschen a) angefärbter Elektrophoresestreifen b) die bei der photometrischen Auswertung der Farbbänder entstandene Extinktionskurve; die Zahlen geben die Anteile der Fraktionen in Prozenten an, die durch Integration der Flächen unter den einzelnen Peaks der Extinktionskurve ermittelt werden. Das Auflösungsvermögen der Polyacrylamid-Gelelektrophorese ist besonders hoch, weil im Gel Moleküle aufgrundihrer Ladung und ihrer Größe aufgetrennt werden. Während auf Agarose die Serumproteïne nur in die größeren GruppenAlbumin, α1- und α2-, β1- und β2-, und γ-Globuline aufgetrennt werden, vermag die Polyacrylamid-GelelektrophoreseDutzende verschiedener Serumproteïne zu unterscheiden. Ausschließlich nach der Größe aufgetrennt werden Proteïne inder SDS-Gelelektrophorese.Vereinfachte quantitative Behandlung der Wanderungsgeschwindigkeit geladenerTeilchen im elektrischen Feld Auf ein Teilchen mit der Ladung Q wirkt im elektrischen Feld E (V/cm) die Kraft Q*E, so dass dieWanderungsgeschwindigkeit des Teilchens v = Q*E/f beträgt. Für den Idealfall einer Kugel ist der Reibungskoëffiziëntf = 6*πηr (r = Stokesscher Radius, η = Viskosität des Mediums). Gl. 8 zeigt, dass die Wanderungsgeschwindigkeitproportional zum Spannungsabfall (= Feldstärke = Spannung pro Längeneinheit des Elektrophoresestreifens, V/cm) undproportional zur Ladung des wandernden Teilchens ist. Die Ladung ist bei Aminosäuren und Proteïnen vom pH-Wertabhängig. Der Reibungskoeffizient f ist abhängig von Form und Größe der Teilchen und von der Viskosität des Mediums. Bei der Elektrophorese entsteht Wärme. Die pro Zeiteinheit gebildete Wärme H beträgt R*I2 (R = elektrischerWiderstand, I = Stromstärke). Bei der Hochspannungselektrophorese (Feldstärken bis einige 100 V/cm und Stromstärkenvon gegen 1 Ampère) wird die entstehende Wärme mit einem Kühlsystem abgeführt. - 23 -
  • 20. BioanalytikChromatographie Chromatographische Trennmethoden beruhen im wesentlichen darauf, dass sich die zu trennenden Substanzen je nachihren physikalisch-chemischen Eigenschaften zwischen einer stationären und einer mobilen Phase ungleich verteilen. Dieverschiedenen Verfahren können grob klassifiziert werden in Verteilungschromatographie (Papier-, Dünnschicht-,Gaschromatographie), Adsorptionschromatographie (Ionenaustauscher-, Affinitätschromatographie) undGelchromatographie (Gelfiltration). Die Verteilungschromatographie beruht auf der verschiedenen Löslichkeit der zutrennenden Substanzen in den Phasen. Bei der Adsorptionschromatographie wirken verschieden starke nicht-kovalenteBindungskräfte zwischen den zu trennenden Substanzen und den Molekülen der einzelnen Phasen. In derGelchromatographie beruht die Trennung auf der räumlich begrenzten Zugänglichkeit der verschiedenen Phasen fürunterschiedlich große Moleküle. Während der chromatographischen Trennung werden die stationäre und die mobilePhase gegeneinander verschoben. Verschiedene Kombinationen von festen, flüssigen und gasförmigen Phasen sind jenach Chromatographietyp möglich. Eine Übersicht gibt die folgende Tabelle. Phase 1 Phase 2 Typ (stationär) (mobil) H2O in Cellulosematrix desPapierchromatographie organisches Lösungsmittel PapiersDünnschichtchromatographie (TLC, organische Lösungsmittel (im Gemisch Aluminiumoxid, Kieselgel etc.HPTLC) mit Säuren oder Laugen)Gaschromatographie (GC) Silikone auf inertem Träger H2, He, N2Flüssigkeitschromatographie organische Lösungsmittel (im Gemisch Modifizierte Kieselgele, etc.(HPLC) mit Säuren oder Laugen)Ionenaustauschchromatographie Ladungen auf inertem Träger Elektrolyt (Puffer)(IC) Spezifischer Ligand aufAffinitätschromatographie Puffer, Lösungsmittel inertem Träger Puffer im Raum innerhalb derGelchromatographie Puffer außerhalb der Partikel Partikel Tabelle 6 : Chromatographietypen Die einzelnen Chromatographietypen können nicht immer eindeutig der Verteilungs-, Adsorptions- oderGelchromatographie zugeordnet werden. Beispielsweise beobachtet man bei der Papierchromatographie gelegentlich auchAdsorption an das Papier. Oder im Falle der Gelchromatographie werden aromatische Verbindungen wegen Adsorptionan die Gelpartikel besonders langsam aus den Gelpartikeln eluiert.Der Rf-Wert ist ein Maß für die Wanderungsgeschwindigkeit einer Substanz in Papier-und Dünnschichtchromatographie Der Rf-Wert ist der Quotient aus der Wanderungsdistanz der Substanz und der Lösungsmittelfront. Startpunkt bis Fleckenmitte Rf = Startpunkt bis Lösungsmittelfront Gleichung 16 : Allgemeine Definition des Rf-Wertes Der Rf-Wert ist für eine Substanz in einem bestimmten Lösungsmittelsystem und bei konstanter Temperaturcharakteristisch. Zur Identifikation ist aber der direkte Vergleich von unbekannter Substanz und Referenzsubstanz imgleichen Chromatogramm zuverlässiger. In der Gelchromatographie ist der Verteilungskoeffizient K d eine dem Rf-Wertentsprechende Größe.Ionenaustauscher-Chromatographie Bei dieser Art von Chromatographie werden gelöste Ionen gegen Ionen gleichen Vorzeichens, die an ein unlöslichesGegenion auf einem festen Träger gebunden sind, ausgetauscht. Auf diesem Prinzip beruht die Enthärtung von Wasser,bei der Ca2+ des „harten" Wassers gegen Na + von unlöslichem Zeolith (= Natrium-Aluminiumsilikat) ausgetauscht wird.Der entstehende Ca-Zeolith kann durch Waschen mit einer konzentrierten NaCl-Lösung wieder zum Na-Zeolithregeneriert werden. Die meisten Ionenaustauscher sind synthetische Polymere (Kunstharze), welche saure oder basische Gruppenenthalten. Austauscher-Harze kann man nach dem pK-Wert ihrer ionischen Gruppen einteilen. Ein stark saurerKationenaustauscher kann z.B. -S0 3 - Gruppen enthalten, ein schwach saurer z.B. -COO - Gruppen. Den Austausch kannman sich folgendermaßen vorstellen: Harz − SO3 Na + + R − NH 3 ⇒ Harz − SO3 H 3 N − R + Na + − + − Harz − NH 3 Cl − + R − COO − ⇒ Harz − NH 3 OOC − R + Cl − + + Formel 11 : Ionen-Austausch am Austauscherharz - 25 -
  • 21. Bioanalytik Abbildung 10 : Trennung von zwei Aminosäuren (A1 und A2) auf Kationenaustauscherharz Bei pH 1 liegen A1 und A2 als Kationen vor. Beide werden am Kationenaustauscher adsorbiert und wandern nur sehrlangsam. Bei pH 6 liegt A1 als Kation vor. A2 wird als ungeladenes Zwitterion nicht adsorbiert und wandert deshalbschneller als A1. Statt einen Puffer konstanter Zusammensetzung zur Elution zu verwenden, können z.B. bei einemKationenaustauscher der pH-Wert oder die Ionenstärke oder beide schrittweise (schrittweise Elution) oder kontinuierlich(Gradientenelution) erhöht werden. Dadurch kann die Elution der aufgetrennten Komponenten beschleunigt werden. DieAminosäuren eines Proteïnhydrolysats werden im automatischen Aminosäuren-Analysator durchIonenaustauschchromatographie quantitativ aufgetrennt (s. Abb. 11). Abbildung 11 : Analyse von Aminosäuren mit Hilfe einer HPLC an einem Kationenaustausscher-HarzDie Fläche unter jedem Signal des Chromatograms ist der Menge jeder in der Mischung vorhandenen Aminosäure proportional.Gelchromatographie Vernetztes Dextran („Sephadex“) bildet in gequollenem Zustand ein poröses Gel. Das Flüssigkeitsvolumen innerhalbder Gelpartikel ist bei einem gegebenen Grad der Vernetzung nur für gelöste Moleküle unterhalb einer bestimmten Größezugänglich. Die Verteilung von gelösten Molekülen innerhalb und außerhalb der Gelpartikel ist somit abhängig vomzugänglichen Volumen innerhalb der Gelpartikel. Das Totalvolumen (Vt) einer Sephadex-Säule ist die Summe desVolumens außerhalb der Gelpartikel (Vo), des Volumens innerhalb der Gelpartikel (Vi) und des Volumens derGelsubstanz selbst (Vg): Vt = V0 + Vi +V g Gleichung 17 : Volumenverteilung in einer "Sephadex"-Säule Das Elutionsvolumen (Ve) einer Substanz ist abhängig von Vo und vom „Verteilungskoëffiziënten“ Kd, der denBruchteil des Vi angibt, der für die Substanz zugänglich ist. Ve = V0 + K d ∗Vi Gleichung 18 : Abhängigkeit des Elutionsvolumens einer Substanz - 26 -
  • 22. Bioanalytik Für große Moleküle, die nicht in das Gel eindringen können, ist Kd = 0, somit Ve = Vo. Für kleine Moleküle, dievollständig in das Gel eindringen können, ist Kd = 1, somit Ve = Vo+Vi. Für Moleküle mit einem Kd zwischen 0 und 1 gilt: V0 < Ve < (V0 + Vi ) Je nach der Größe der Moleküle, die voneinander getrennt werden sollen, wird verschieden stark vernetztes Sephadexverwendet. Die gebräuchlichsten Typen sind: Ausschluss- Sephadex Molekularmasse G- 25 > 5.000 G- 50 > 25.000 G- 75 > 50.000 G-200 >200.000 Tabelle 7 : Ausschluss-Molekularmassen einiger "Sephadex"-Gele Sephadex G-25 eignet sich wie die Dialyse besonders zur Entsalzung von Makromolekülen. Sephadex G-50, G-75 undG-200 werden zur Trennung verschieden großer Proteïne verwendet. Sie dienen auch zur Schätzung der molekularenGröße und damit der Molekülmasse eines Proteïns. Als Referenzen braucht man die Elutionsvolumina von Proteïnen mitbekannter Molekularmasse. Für globuläre Proteïne ist das Verhältnis Ve/Vo über einen weiten Bereich umgekehrtproportional zum Logarithmus der Molekularmasse. Abbildung 12 : log Molekularmasse gegen Elutionsvolumen Die Abb. 12 zeigt solche Kurven für Sephadex G-50 und G-200. Die gesuchte Molekülmasse eines Proteïns erhältman anhand der Kurven aus dem gemessenen Elutionsvolumen. - 27 -
  • 23. BioanalytikPhotometrieGesetz von Lambert-Beer Wird Licht durch eine Farbstofflösung gestrahlt und dabei absorbiert, so ist die Intensität des austretenden Lichts ( I)kleiner als diejenige des eintretenden Lichts (I0). Der Quotient I/I0 wird als Durchlässigkeit D oder Transmission Tbezeichnet und ist abhängig von der Konzentration c des Farbstoffs und der Schichtdicke d: D = I/I0 = l0-k@c@d. D wird oftin % angegeben. %D = 100*I/I0. Ein für photometrische Messungen gebräuchlicheres Maß ist die Extinktion E oder optische Dichte OD. Sie ist direktproportional zu c und d:  I  E = − log I  = − log D = k ∗ c ∗ d   0  Gleichung 19 : Definition der Extinktion E (optischen Dichte OD) Der Extinktionskoëffiziënt k ist charakteristisch für die absorbierende Substanz und ist abhängig von der Wellenlänge.Der numerische Wert von k ist ferner abhängig von den Einheiten von c und d. Wird der molare Extinktionskoëffiziënt εverwendet, wird d in cm und c in mol/Liter (M) angegeben. Die Dimension ist dann M-1*cm -1. Der molareExtinktionskoëffiziënt entspricht also der Extinktion einer 1 M Lösung der betreffenden Substanz bei einer Schichtdickevon 1 cm. Bei stark absorbierenden Substanzen ist der millimolare Extinktionskoëffiziënt gebräuchlicher ( εmM = ε/1000).Für Tryptophan beträgt εmM = 6 [mM-1*cm-1] bei 280 nm, für ATP 15 mM-1*cm-1 bei 260 nm. Zwischen % Durchlässigkeit und Extinktion besteht die Beziehung:  I  log %D = log 100 + log I  =2−E   0  Gleichung 20 : Bezeihung zwischen %D und E Durchlässigkeiten von 100 %, 10 %, 1 % entsprechen die Extinktionen 0, 1,0 und 2,0. Die meisten Photometer sindmit einer %D-Skala (linear) und einer E-Skala (logarithmisch) ausgerüstet.Konzentrationsbestimmung durch Photometrie Nach dem Gesetz von Lambert-Beer kann eine unbekannte Konzentration graphisch bestimmt werden. Zuerst werdendie Extinktionen (E1, E2, E3, E4) von Standardlösungen bekannter Konzentrationen (c1, c2, c3, c4) als Kalibrierkurveaufgezeichnet. Die Werte sollen auf einer Geraden liegen, die durch den Nullpunkt geht. Abweichungen von derLinearität können bei höheren Konzentrationen auftreten. Die unbekannte Konzentration cx kann aus der gemessenenExtinktion Ex auf der Kalibriergeraden abgelesen werden. Bereich, in dem das Lambert-Beer Gesetz nicht mehr erfüllt ist Abbildung 13 : Gültigkeitsbereich des Lambert-Beer GesetzesPhotometer und Spektralphotometer Das Lambert-Beer Gesetz gilt nur für monochromatisches Licht. Um eine möglichst große Extinktion zu erhalten,wird monochromatisches Licht gewählt, das zur Farbe der absorbierenden Substanz komplementär ist.Monochromatisches Licht wird beim Photometer durch die Verwendung eines Filters erzeugt, beim Spektralphotometerdurch ein Prisma oder ein Diffraktionsgitter. - 29 -
  • 24. BioanalytikSchematische Darstellung eines Spektralphotometers Lichtquelle Monochromator Probenraum Photoelektrischer Empfänger mit Anzeigegerät Abbildung 14 : Schematische Darstellung eines Spektralphotometers1 Lichtquelle 2 Eintrittsspalt 3 Prisma oder Diffraktionsgitter 4 Drehmechanismus für Prisma5 Skala mit Angabe der Wellenlänge 6 Austrittsspalt 7 Küvette mit Lösung 8 Photozelle, wandelt Lichtimpulse in Strom um9 Elektronischer Verstärker 10 Regulier-Potentiometer 11 Ampèremeter mit %D- und E-SkalaPraktisches Vorgehen bei der Photometrie Extinktionswerte sind keine absoluten Größen, sondern Relativwerte bezogen auf eine Blindprobe. Als Blindwert dientgewöhnlich der verwendete Puffer. Vor der Messung der Extinktion E muss das Photometer mit dem Blindwert wie folgtkalibriert werden: 1. Lichtweg schließen, Photometeranzeige auf %D = 0 einstellen durch Kompensation des sogenannten Dunkelstroms (geschieht bei neueren Geräten automatisch). 2. Lichtweg öffnen, Blindprobe in den Lichtweg bringen, auf Photometeranzeige E = 0 einstellen durch Veränderung der Verstärkung des Photostroms (Nullpunkt-Abgleichung, "zero adjustment"). 3. Probe in den Lichtweg bringen und E ablesen. Wird die Wellenlänge verändert, so muss das Photometer wieder neu kalibriert werden, weil sich die Intensität derLichtquelle und die Empfindlichkeit der Photozelle mit der Wellenlänge ändert. - 30 -
  • 25. BioanalytikEnzymreaktionen An fast allen chemischen Umsetzungen im Organismus sind Enzyme beteiligt. Enzyme sind Katalysatoren, welche dieStoffwechselprozesse unter den milden Bedingungen in der Zelle (niedrige Metabolitkonzentrationen, niedrigeTemperatur, neutraler pH-Wert) ermöglichen. Die wesentliche Eigenschaft eines Enzyms ist sein Vermögen, eine spezifische Reaktion ganz enorm zu beschleunigen(= katalysieren). Dabei werden die Geschwindigkeiten der Vorwärts- und der Rückwärts-Reaktion proportional erhöht,d.h. das chemische Gleichgewicht der Reaktion wird nicht verändert. Die im Reaktionsablauf verbrauchteVerbindung bezeichnet man als Substrat, die neugebildete als Produkt. Bei der Rückwärtsreaktion sind die Begriffevertauscht (z.B. Acetaldehyd und Ethylalkohol sind je nach Reaktionsablauf entweder Substrat oder Produkt der Alkohol-Dehydrogenase). Enzymreaktionen lassen sich durch Bestimmung der Menge des in der Zeiteinheit gebildeten Produktsoder des verbrauchten Substrats messen. Die reaktionsbeschleunigende Wirkung von Enzymen wird als Enzymaktivitätbezeichnet. Enzyme sind Proteïne und als solche empfindlich gegen denaturierende Einflüsse (Wärme, Säuren, Basen etc.). DieAminosäurensequenz und die räumliche Struktur verschiedener Enzyme sind heute bekannt. Die Molekularmassen Mrliegen zwischen 104 und 106 (Beispiele: Lysozym 14.400, Phosphorylase a 390.000). Viele, aber nicht alle Enzymebestehen aus mehreren Peptidketten (Quartärstruktur). Denjenigen Teil eines Enzymmoleküls, an den das Substrat (bzw.Produkt) bindet und wo die katalytische Umsetzung stattfindet, bezeichnet man als aktive Stelle. Sie umfasst u.a. die andiesen Prozessen direkt beteiligten Aminosäurereste. Bei gewissen Enzymen enthält die aktive Stelle auch nicht-proteïnartige Bestandteile (prosthetische Gruppen). Die Geschwindigkeit einer enzymatischen Reaktion hängt von folgenden Reaktionsbedingungen ab. 1. Substratkonzentration 2. Enzymkonzentration und Enzymaktivität 3. pH-Wert 4. Temperatur 5. Konzentration von Inhibitoren und Aktivatoren Die Untersuchung der Abhängigkeit der Enzymaktivität von diesen Faktoren ist das Gebiet der Enzymkinetik.Abhängigkeit der Enzymaktivität von der Substratkonzentration Im Laufe einer durch ein Enzym E katalysierten Umwandlung von Substrat S in Produkt P entstehen ein Enzym-Substrat-Komplex ES und ein Enzym-Produkt-Komplex EP als Zwischenformen. Die Reaktionssequenz ist entsprechend: E + S ⇔ ES ⇔ EP ⇔ E + P Formel 12 : Formaler Ablauf einer enzymatischen Reaktion Es ist schwierig, aus diesem allgemein gültigen Schema (6 Teilreaktionen) eine experimentell leicht nachprüfbareBeziehung zwischen der Reaktionsgeschwindigkeit und der Substratkonzentration abzuleiten. Zur Vereinfachungbeschränkt man sich deshalb auf Bedingungen, unter denen die Reaktion nur in einer Richtung abläuft, d.h. dieRückwärts-Reaktion P ⇒ S vernachlässigt werden kann. Dies ist der Fall am Anfang der Reaktion, solange dieKonzentration von P verschwindend klein ist im Vergleich zur Konzentration von S, oder unter Bedingungen, unterdenen das Produkt laufend abgefangen wird. Das Reaktionsschema ist dann: E + S ⇒ ES ⇒ EP ⇒ E + P Formel 13 : Reaktionsschema einer "normalen" enzymatischen Reaktion Wenn man weiter darauf verzichtet, den ES- und EP-Komplex gesondert zu betrachten (nur die Geschwindigkeit derersten Teilreaktion, der Bildung des ES-Komplexes, ist abhängig von der Substratkonzentration), ergibt sich alseinfachste Formulierung: E + S k11 ⇒ ES ⇒ E + P k− Formel 14 : Einfachste Formulierung einer enzymatischen Reaktion wobei k1, k-1 und k2 die Geschwindigkeitskonstanten der Teilreaktionen sind. Aus diesem Schema lässt sich einequantitative Beziehung zwischen der Anfangsgeschwindigkeit v einer enzymatischen Reaktion und derSubstratkonzentration ableiten (Henry, 1903; Michaelis und Menten, 1913; Briggs und Haldane, 1925). Die Herleitung ist wie folgt: Die Geschwindigkeit, mit der die Konzentration des Produkts P zunimmt, ist d [ P] v= = k 2 [ ES ] dt Gleichung 21 : Geschwindigkeit der Produktentstehung Da v am Anfang der Reaktion, (d.h. solange die Substratkonzentration sich nicht merkbar verändert hat) konstantbleibt, folgt aus Gl. 21, dass ES ebenfalls konstant ist. Dies bedeutet, dass die Bildungs- und Zerfallsgeschwindigkeitenvon ES gleich groß sind (= Fliessgleichgewichtszustand). Daraus folgt: - 31 -
  • 26. Bioanalytik k1 [ E ][ S ] = ( k −1 + k 2 )[ ES ] Gleichung 22 : Fliessgleichgewicht einer enzymatischen Reaktion Wir setzen für [E] = [Et]-[ES] ein, wobei [Et] die messbare Gesamtkonzentration des Enzyms darstellt. Eingesetzt inGl. 22 erhalten wir für [ES] k1 [ Et ][ S ] [ ES ] = k −1 + k 2 + k1 [ S ] Gleichung 23 : Umformung der Gl. 22 Gl. 23 können wir jetzt in Gl. 21 einsetzen, d.h. wir drücken die Anfangsgeschwindigkeit der Enzymreaktion alsFunktion der gesamten Enzymkonzentration und der Konzentration des freien Substrats aus: k 2 k1 [ E t ][ S ] v = k 2 [ ES ] = k −1 + k 2 + k1 [ S ] Gleichung 24 : Anfangsgeschwindigkeit der enzymatischen Reaktion Gl. 24 ist bereits die gesuchte Geschwindigkeitsgleichung für unsere Enzymreaktion, wenn auch noch nicht in derüblichen Form. Diese erhalten wir, indem wir Zähler und Nenner durch k 1 teilen: k 2 [ Et ][ S ] V [S] v= = max k −1 + k 2 Km + [S] + [S] k1 Gleichung 25 : Michaelis-Menten-Gleichung Dieses ist die Michaelis-Menten-Gleichung. Sie beschreibt die Anfangsgeschwindigkeit einer Enzymreaktion unterder Annahme des Fliessgleichgewichts. Die Konstanten Km und Vmax sind definiert als k −1 + k 2 Km = k1 Vmax = k 2 [ Et ] Gleichung 26 : Definition der Konstanten der Michaelis-Menten-Gleichung Km wird Michaeliskonstante genannt. Vmax ist die maximale Geschwindigkeit, die bei der Konzentration [Et] erreichtwerden kann. Sie entspricht dem Zustand, wo alle Enzymmoleküle als ES vorliegen, also [ES] = [Et]. Weil beiEnzymreaktionen [Et] << [St], kann man in Gl. 25 für [S] die Gesamtkonzentration des Substrats einsetzen. Nach Gl. 25 ist v eine hyperbolische Funktion von [S]. Abbildung 15 : Abhängigkeit der Aktivität von der Substratkonzentration (v gegen [S]-Darstellung)Bedeutung von Km und Vmax Die Michaelis-Menten-Gleichung liefert eine Arbeitsdefinition von Km. Km hat die Dimension einer Konzentration undentspricht numerisch derjenigen Substratkonzentration, bei welcher bei gegebener Enzymkonzentration die halbmaximaleReaktionsgeschwindigkeit erreicht wird (Substitution von v = Vmax/2 in Gl. 25 ergibt Km = [S]). Km kann als reziprokesMaß der „Affinität" von S zu E aufgefasst werden. Je größer die Affinität eines Substrats zum Enzym ist, desto kleiner istdie zum Erreichen der halbmaximalen Umsatzgeschwindigkeit benötigte Substratkonzentration, d.h. ein kleines Kmentspricht einer großen „Affinität" und umgekehrt. Es muss allerdings betont werden, dass Km nicht dieDissoziationskonstante Kd = k-1/k1 des Enzym-Substrat-Komplexes darstellt. Wie der obere Teil der Gl. 26 zeigt, ist Kmdurch drei Geschwindigkeitskonstanten bestimmt. Lediglich im Spezialfall k2 << k-1 wird der numerische Wert von Kmetwa gleich demjenigen von Kd der Reaktion E + S → ES. In allen andern Fällen ist Km > Kd. - 32 -
  • 27. Bioanalytik Bei Substratkonzentrationen, die viel kleiner oder größer sind als Km, ergeben sich folgende Vereinfachungen derMichaelis-Menten-Beziehung: [ S ] << K m Vmax ∗ [ S ] V ∗ [S] v= → max Km + [S] Km Gleichung 27 : Michaelis-Menten-Gleichung bei Substratkonzentrationen weit unterhalb K m Da Vmax und Km Konstanten sind, wird v proportional [S], d.h. der enzymatische Prozess verläuft alsReaktion Erster. Ordnung. Gl. 27 entspricht dem anfänglich linear ansteigenden Abschnitt der Michaelis-Menten-Hyperbel. [ S ] >> K m Vmax ∗ [ S ] v= → Vmax Km + [S] Gleichung 28 : Michaelis-Menten-Gleichung bei Substratkonzentrationen weit oberhalb K m Die Reaktionsgeschwindigkeit wird konstant und unabhängig von [S], d.h. die Umsetzung verläuft alsReaktion Nullter Ordnung. Gl. 28 entspricht der von der Michaelis-Menten-Hyperbel angestrebten horizontalenAsymptote.Bestimmung von Km und Vmax Der numerische Wert von Vmax ist bei Anwendung der hyperbolischen v gegen [S]-Darstellung manuell schwierig zubestimmen. Die für eine Messung von v in der asymptotisch auslaufenden Region der Kurve benötigten hohenSubstratkonzentrationen sind oft praktisch nicht realisierbar und Extrapolationen sind unsicher. Die sich darausergebende Ungenauigkeit von Vmax erschwert auch die Bestimmung des Km. Diese Schwierigkeiten werden beseitigt durchVerwendung von Computerprogrammen, die den Messwerten am besten angepasste Michaelis-Menten-Kurve berechnen(Hyperbolische Anpassung). Damit erhält man die Werte für Vmax und Km. Falls keine Rechner zur Verfügung stehen, kann die Michaelis-Menten-Beziehung durch einfache Umformung vonGl. 25 in eine linearen Darstellungsform von der Art y = ax+b übergeführt werden (Darstellung nach Lineweaver-Burk): 1 Km + [S] Km [S] = = + v Vmax ∗ [ S ] Vmax ∗ [ S ] Vmax ∗ [ S ] 1 K 1 1 = m ∗ + v Vmax [ S ] Vmax Gleichung 29 : Lineweaver-Burk 1 Wenn anstelle der gemessenen Werte v und [S] der reziproke Wert 1/v (y-Achse) als Funktion von 1/[S] (x-Achse)graphisch aufgetragen wird, ergibt sich eine Gerade mit der Steigung Km/Vmax. Die Schnittpunkte mit den Achsen ergebenaufgrund von Gl. 29: 1 1   1  =  für die Ordinate   [ S] = 0    v Vmax     1 1  1  =−  für die Abszisse  = 0   [ v] S Km  v   Gleichung 30 : Lineweaver-Burk 2 Diese Darstellungsform liefert so durch lineare Extrapolation eindeutige Werte für 1/Vmax und -1/Km (1/v gegen1[S]-Darstellung. - 33 -
  • 28. Bioanalytik Abbildung 16 : Abhängigkeit der Aktivität von der SubstratkonzentrationAbhängigkeit der Enzymaktivität von der Enzymkonzentration Substitution von Vmax = k2 [Et] in Gl. 25 führt zu k2 ∗ [ S ] v= ∗ [ Et ] Km + [S] Gleichung 31 : Substituierte Michaelis-Menten-Gleichung d.h. bei gegebener Substratkonzentration ist die Aktivität proportional der Enzymkonzentration (doppelt sovielEnzymmoleküle können pro Zeiteinheit doppelt soviel Substratmoleküle umsetzen). Im Gegensatz zu Vmax ist Kmunabhängig von der Enzymkonzentration. Abbildung 17 : Abhängigkeit der Geschwindigkeit von der EnzymkonzentrationAbhängigkeit der Enzymaktivität vom pH Im allgemeinen ist ein Enzym nur in einem relativ engen pH-Bereich aktiv. Aktivitätsmessungen müssen deshalbimmer unter definierten pH-Bedingungen ausgeführt werden, am einfachsten durch Verwendung von Pufferlösungen. AlspH-Optimum bezeichnet man den pH-Bereich, an dem die Aktivität am höchsten ist (z.B. pH 1.5 - 2.5 für Pepsin oderpH 7 - 9 für Trypsin). Abbildung 18 : Abhängigkeit der Enzymaktivität von der Enzymkonzentration Die Lage des pH-Optimums ist durch das Vorhandensein bestimmter ionisierbarer Gruppen am Enzym oder Substraterklärbar. In gewissen Fällen können daraus Schlüsse über den Mechanismus der Katalyse gezogen werden - 34 -
  • 29. BioanalytikAbhängigkeit der Enzymaktivität von der Temperatur Wie andere chemische Reaktionen werden Enzymreaktionen durch Temperaturanstieg beschleunigt.Aktivitätsmessungen müssen deshalb bei definierter Temperatur ausgeführt werden. Im allgemeinen findet man bei einerErhöhung der Temperatur um 10 °C eine Aktivitätssteigerung auf etwa das Doppelte (RGT-Regel). Bei höherenTemperaturen fällt aber die Aktivität wegen der während der Messung fortschreitenden Hitzedenaturierung des Enzymswieder ab. Die Temperatur, bei der die höchste Aktivität gemessen wird, liegt bei den meisten Enzymen zwischen 40 °Cund 50 °C. Abbildung 19 : Abhängigkeit der Enzymaktivität von der TemperaturWirkung von Inhibitoren und Aktivatoren auf die Enzymaktivität Für viele Enzyme kennt man spezifische Verbindungen, welche die Aktivität entweder herabsetzen (Inhibitoren) odersteigern (Aktivatoren). Bei den Inhibitoren unterscheidet man dabei solche, die mit dem Enzym eine irreversibleVerbindung eingehen (Beispiel: Hemmung von Chymotrypsin durch DFP3) und solche, die einen reversiblen, d.h. leichtdissoziierbaren Komplex bilden. Bei den reversiblen Hemmstoffen können als Haupttypen die kompetitiven und nicht-kompetitiven Inhibitoren unterschieden werden.Kompetitive Inhibitoren Diese hemmen die Bindung des Substrats an das Enzym. Das Ausmaß der Hemmung hängt dabei von den relativenKonzentrationen von Substrat und Inhibitor ab und von ihren relativen Affinitäten für das Enzym. Wenn Substrat ingroßem Überschuss zugegeben wird, verschwindet die Hemmung. Vmax ist deshalb bei diesem Hemmungstyp nichtverändert. Die Affinität des Substrats zum Enzym ist aber scheinbar erniedrigt. Der in Gegenwart von Inhibitorgemessene Km-Wert (= K’m) ist größer als das Km des nicht gehemmten Enzyms. Spezifische kompetitive Inhibitorennennt man Inhibitoren, die dem natürlichen Substrat eines Enzyms strukturell ähnlich sind. So ist z.B. Malonat einspezifischer, kompetitiver Inhibitor der Succinat-Dehydrogenase. Diese Inhibitoren besetzen am Enzym die gleicheBindungsstelle wie das Substrat und verhindern so kompetitiv dessen Bindung ans Enzym. Abbildung 20 : Kompetitive HemmungNicht-kompetitive Inhibitoren Diese hemmen das Enzym, ohne die Bindung des Substrats zu beeinträchtigen. Umgekehrt hat eine Steigerung derSubstratkonzentration auch keine Wirkung auf die Hemmung. Das Ausmaß der Hemmung hängt nur von derKonzentration des Inhibitors ab. Die mit Inhibitor besetzten Enzym-Moleküle sind weniger oder nicht aktiv. Vmax istdeshalb erniedrigt, verglichen mit dem nichtgehemmten Enzym. Der Km-Wert bleibt unverändert. Abbildung 21 : Nicht-kompetitive Hemmung3 Diisopropylfluorophosphat - 35 -
  • 30. BioanalytikAktivatoren Gewisse Enzyme sind nur aktiv in Gegenwart eines Aktivators oder werden dadurch in ihrer Wirkung gesteigert.Aktivatoren sind oft bestimmte Ionen, die leicht dissoziierbare Komplexe mit dem Enzym eingehen, z.B. Mg 2+ mitEnolase oder alkalischer Phosphatase, Cl - mit Amylasen. Aktivitätsbestimmungen solcher Enzyme müssen immer inGegenwart definierter Konzentrationen des Aktivators ausgeführt werden. H+-Ionen können als Spezialfall sowohl einesAktivators wie eines Inhibitors betrachtet werden. Die pH-Abhängigkeit der Enzymwirkung lässt sich in vielen Fällen aufdie Aufnahme oder Abgabe von Protonen durch das Enzym zurückführen. Je nach Enzym ist dabei die protonierte oderdie nicht-protonierte Form die aktive (bzw. aktivere) Spezies.Einheiten der Enzymaktivität Aufgrund von Gl. 31 ist die Geschwindigkeit einer enzymkatalysierten Reaktion proportional zur Menge desvorhandenen Enzyms. Die Enzymaktivität wird in Internationalen Einheiten (U) gemessen. Ein U ist dieEnzymaktivität, welche 1 µmol Substrat/min in Produkt umsetzt. Die Messung soll bei definierter Temperatur, in derRegel bei 25 °C, und optimalen Bedingungen (Puffer, pH-Wert, Substratkonzentration) ausgeführt werden. Man beachte,dass U die Dimension einer Geschwindigkeit hat und somit nichts angibt über die Proteïnmenge, in der dieEnzymaktivität U enthalten ist. Die spezifische Aktivität ist die Anzahl Aktivitätseinheiten eines Enzyms pro Menge Proteïn. Gewöhnlich wird sieals Anzahl U/mg Proteïn angegeben. Sie ist ein Maß für den Reinheitsgrad eines Enzympräparates. Die spezifischeAktivität steigt im Laufe der Reindarstellung eines Enzyms durch sukzessive Entfernung aller Fremdproteïne bis zu demfür das reine Enzym typischen maximalen Wert an. Wenn das Enzym rein und seine Molekularmasse bekannt ist, lässtsich die molekulare Aktivität berechnen. Sie wird angegeben als Anzahl U/µmol Enzym. Die molekulare Aktivität (oderWechselzahl) des Enzyms gibt die Anzahl Substratmoleküle an, welche bei optimaler Substratkonzentration durch1 Enzymmolekül/min umgesetzt wird. Die Wechselzahl vieler Enzyme liegt zwischen 10 3 und 104 min -1.Der optische Test nach Warburg Die reduzierten Pyridinnucleotide NADH bzw. NADPH zeigen bei 340 nm eine Absorptionsbande, die den oxidiertenFormen fehlt. Die Umwandlung der reduzierten in die oxidierten Formen und umgekehrt lässt sich deshalb durchExtinktionsmessungen verfolgen. Diese Eigenschaft erlaubt die Messung von enzymkatalysierten Reaktionen, an denenPyridinnucleotid-Coënzyme beteiligt sind. Alle Reaktionen dieser Art verlaufen nach dem Schema: RH2 + NAD( P ) ←   → R + NAD( P )H + H + +  Dehydrogenase Formel 15 : Enzymatische Reaktion wobei RH2 und R je nach Reaktionsrichtung das Substrat bzw. das Produkt darstellen. Die Mengen von umgesetztemSubstrat und Coënzym sind gleich. Die optisch messbare Konzentrationsänderung (Zunahme oder Abnahme) desreduzierten Coënzyms ist deshalb ein direktes Maß für das verbrauchte Substrat oder gebildete Produkt. DieKonzentration von NADH bzw. NADPH lässt sich aufgrund des Lambert-Beer-Gesetzes aus Extinktionsmessungen imBereich der Dihydronicotinamid-Absorptionsbande des Coënzyms ermitteln. Bei Verwendung eines Spektralphotometerserfolgt die Messung am Absorptionsmaximum (340 nm) unter Anwendung des millimolaren Extinktionskoëffiziënten,ε340 = 6,22. Bei Photometern, die mit einer Hg-Dampflampe (diskontinuierliches Linienspektrum) ausgerüstet sind, stehtnur die Emissionslinie von Hg bei 365 nm zur Verfügung. Da diese Wellenlänge nicht dem Absorptionsmaximumentspricht, muss der niedrigere Extinktionskoëffiziënt ε365 = 3,3 verwendet werden. Je nach Wahl derVersuchsbedingungen kann der optische Test zur Messung von Enzymaktivitäten oder zur enzymatischen Bestimmungvon Substratkonzentrationen verwendet werden.Bestimmung von Enzymaktivitäten im optischen Test Die gesuchte Größe ist die Anzahl Enzymaktivitätseinheiten pro ml der verwendeten Enzymlösung ( Anzahl U/ml)oder die spezifische Aktivität (Anzahl U/mg) des Enzyms. Es ist vorteilhaft, zuerst die Anzahl U/ml im Reaktionsansatz(in der Küvette) zu ermitteln und dann den gefundenen Wert, unter Berücksichtigung des Verdünnungsfaktors, auf dieAnzahl U/ml in der verwendeten Enzymlösung umzurechnen. Aus dieser Größe und der Proteïnkonzentration derEnzymlösung (mg/ml) erhält man die spezifische Aktivität des Enzyms in U/mg. Die Enzymaktivität/ml im Ansatz istdie pro ml und pro min umgesetzte Anzahl µmol NADH. U  μmol  = NADH   ml  min∗ ml  Gleichung 32 : Enzymaktivität 1 Die Konzentrationsänderung von NADH/min ist bei Messung in einer Küvette von 1 cm Schichtdicke die in derMinute erfolgte Änderung der Extinktion (∆E340/min) dividiert durch den millimolaren Extinktionskoëffiziëntenε340 = 6,22. Die Enzymaktivität ist somit: U ΔE 340 = ml ε 340 ∗ min Gleichung 33 : Enzymaktivität 2 - 36 -
  • 31. Bioanalytik Die Anzahl U/ml in der zum Ansatz zugegebenen Enzymlösung erhält man durch Multiplikation der aus Gl. 33erhaltenen Aktivitätskonzentration mit dem Verdünnungsfaktor: U ( Enzymlösung ) = U ( Ansatz ) ∗ Verdünnungsfaktor ml ml V Ansatz FV = (Verdünnungsfaktor ) V Zugabe Enzymlösung Gleichung 34 : Enzymaktivität 3 Die spezifische Aktivität U/mg ist die Aktivitätskonzentration der Enzymlösung (U/ml) dividiert durch dieProteïnkonzentration der Enzymlösung (mg/ml): U ( Enzymlösung ) Spezifische Aktivität = ml  mg ( Pr oteïn )    ml ( Enzymlösung )    Gleichung 35 : Spezifische Aktivität Beispiel: Eine Lösung von Isocitrat-Dehydrogenase (5 mg/ml) wird 1:200 mit H2O verdünnt und 50 µl davon werden zumoptischen Test verwendet, der in einem Totalvolumen von 3,00 ml ausgeführt wird (Verdünnungsfaktor = 12.000). Eswird eine Extinktionsabnahme bei 340 nm von 0,53 /min gemessen. Aufgrund von ε340 = 6,22 mM-1cm-1 ist dieAktivitätskonzentration im Ansatz 0 ,53 U  = 0,085  6 ,22  ml  Gleichung 36 : Aktivitätskonzentrtion im Ansatz In der verwendeten Enzymlösung ist die Aktivitätskonzentration U  12.000 ∗ 0 ,085 = 1.020    ml  Gleichung 37 : Aktivitätskonzentration in der Enzymlösung und die spezifische Aktivität 1.020 U  = 204   5 mg  Gleichung 38 : Spezifische AktivitätBestimmung von Substratkonzentrationen durch einen optischen Test Unter Reaktionsbedingungen, bei denen im Gleichgewichtszustand das Verhältnis von Produkt zu Substrat sehr großist, oder wenn das gebildete Produkt durch eine weitere Reaktion laufend aus dem Gleichgewicht entfernt wird, wird zumAnsatz zugegebenes Substrat praktisch quantitativ in Produkt umgesetzt. Die Menge des gebildeten Produkts und des inder Reaktion ebenfalls umgesetzten Coënzyms ist dann ein Maß für die ursprünglich zugegebene Menge von Substrat.Die umgesetzte Menge Coënzym lässt sich im optischen Test aus der maximal erzielten Extinktionsänderung, ∆E340,ermitteln gemäss: ΔE 340 c( Substrat im Ansatz ) = ε 340 ,mM Gleichung 39 : Substratkonzentration im Ansatz Die gesuchte millimolare Konzentration der zum Ansatz zugegebenen Substratlösung [S0] erhält man durchMultiplikation der aus Gl. 39 erhaltenen Konzentration mit dem Verdünnungsfaktor ΔE 340 [S0 ] = ×Verdünnungsfaktor ε 340 ,mM Gleichung 40 : Konzentration der zugesetzten Substratlösung Beispiel: In einem Ansatz vom Volumen 3,0 ml, der 0,15 ml einer Pyruvatlösung unbekannter Konzentration und einenÜberschuss an NADH enthält, wird nach Zugabe von Lactat-Dehydrogenase eine maximale Extinktionsabnahme∆E340 = 0,59 gemessen. Die anfängliche Substratkonzentration im Ansatz beträgt 0 ,59 = 0 ,095[mM ] 6 ,22 Gleichung 41 : Anfängliche Substratkonzentration im Ansatz - 37 -
  • 32. Bioanalytik Die gesuchte Konzentration der Pyruvatlösung beträgt 0 ,095 ∗ 20 = 1,90[ mM ] Gleichung 42 : Konzentration der Pyruvatlösung Bei einer Molekularmasse von 88 Da4 für Pyruvat beträgt die Massenkonzentration der Pyruvatlösung  μg  1,90 ∗ 88 = 167 ,2    ml  Gleichung 43 : Massenkonzentration der Pyruvatlösung4 Dalton - 38 -
  • 33. BioanalytikMolekularbiologische Methoden Die Technik der DNA-Rekombination, auch als Gentechnik bezeichnet, erlaubt die Isolierung von DNA-Abschnitten(genomische oder cDNA), deren Sequenzbestimmung, Modifikation und Expression. Zu diesem Zweck gelangen einigegrundlegende Schritte immer wieder zur Anwendung, nämlich gezielte Verdauung von DNA mit Restriktions-Endonucleasen, Verknüpfen von DNA-Molekülen durch Ligase, Einfügen von DNA in Plasmide (oder andere geeigneteTräger-DNA-Moleküle, sog. Vektoren), Einschleusen und Expression rekombinierter DNA in Bakterien odereukaryotische Zellen, Selektion transfizierter Zellen und Isolierung klonierter Plasmid-DNA.Plasmide Bakterien verfügen häufig über sogenannte Plasmide. In Wildtypbakterien tragen Plasmide die Gene für dieKonjugation von Bakterienzellen und gelegentlich auch für Antibiotikaresistenz (Resistenzplasmide). Plasmide, die Genefür die Inaktivierung von Antibiotika tragen, vermitteln dem Wirtsbakterium die Fähigkeit der Antibiotikaresistenz.Durch den als Konjugation bezeichneten Vorgang, bei dem eine kurzfristige Zell-Zell Verbindung geschaffen wird,können Plasmide unter Bakterienzellen verbreitet werden. Plasmide sind ringförmige doppelsträngige DNA-Moleküle,die aus einigen tausend Basenpaaren bestehen. Unter Nutzung der Wirtsmaschinerie replizieren sich Plasmideunabhängig von chromosomaler DNA und exprimieren ihre Gene. Eine Bakterienzelle kann bis zu einigen hundertKopien eines Plasmids enthalten, die nach Lyse der Bakterien relativ einfach isoliert werden können (Ausfällung vonProteïnen und chromosomaler DNA, Fällung von Plasmid-DNA mit Alkohol). Andererseits können intakte BakterienDNA aufnehmen, wenn sie durch geeignete Vorbehandlung (Erhöhung der extrazellulären Calcium-Konzentration,Erhöhung der Temperatur) „kompetent" gemacht werden. Dieser Vorgang wird als Transfektion bezeichnet (gelegentlichauch als Transformation von Bakterien). Abbildung 22 : Elektronenmikroskopische Aufnahme von Plasmiden (unterschiedliche Überspiralisierung).Restriktionsenzyme Restriktionsenzyme sind bakterielle Endonucleasen mit hoher Spaltungsspezifität, die bestimmte Stellen in einemDNA-Doppelstrang erkennen und durchtrennen. Die Enzyme erkennen Sequenzen von 4 - 8 Basen, die meist einPalindrom darstellen, d.h. beide Stränge vom 5-Ende gelesen haben die gleiche Sequenz (= punktsymmetrisch). An denSpaltstellen entstehen je nach Restriktionsenzym stumpfe oder versetzte DNA-Enden. Durch ein bestimmtesRestriktionsenzym gebildete DNA-Enden können durch DNA-Ligase verknüpft werden. Überlappend komplementäreDNA-Enden, sog. „sticky ends", eignen sich dazu besonders gut, weil sie Basenpaarungen bilden können. DefiniertesDurchtrennen und Zusammenfügen von DNA bildet die Grundlage zur Klonierung von DNA. Restriktionsenzym Erkennungssequenz5 (| =Spaltstelle) EcoR I 5’ G|AATTC 3’ Bgl I 5’ GCCNNNN|NGGC 3’ BamH I 5’ G|GATCC 3’ 6 5’ CCC|GGG 3’ Sma I 6 5’ C|CCGGG 3’ Xma I Pst I 5’ CTGCA|G 3’ Tabelle 8 : Erkennungssequenz einiger Restriktionsendonucleasen Es sind heute über 2.000 Restriktionsenzyme mit nahezu 200 verschiedenen Sequenzspezifitäten bekannt(verschiedene Restriktionsenzyme, aber gleiche Erkennungssequenz!). Die Bezeichnung der Restriktionsenzyme setztsich aus dem ersten Buchstaben der Bakteriengattung und den zwei Buchstaben der Spezies, gefolgt vom Serotyp oderStamm und ev. einer römischen Zahl (falls ein Bakterium mehr als ein Restriktionsenzym bildet) zusammen. So wird z.B.EcoR I von Escherichia coli des Stammes RY13 gebildet (dieser E. coli Stamm bildet 4 weitere Restriktionsenzyme).Bacillus globigii bildet Bgl I und Bgl II.5 Üblicherweise wird nur einer der DNA-Stränge angegeben6 Beispiel für Enzyme, welche die gleiche Sequenz erkennen aber nicht notwendigerweise am gleichen Ort spalten - 39 -
  • 34. BioanalytikAgarose-Gelelektrophorese Bei neutralem pH-Wert wandert die durch die Phosphatgruppen negativ geladene DNA im elektrischen Feld gegen dieAnode. Im Gelzustand bildet Agarose (aus Algen isoliertes, unter Erwärmung lösliches Polysaccharid) ein räumlichesNetzwerk. Im Agarose-Gel wird DNA unterschiedlicher Länge und Form getrennt. Kurze DNA wandert schnell, langeDNA langsam. Zirkuläre DNA (Plasmid, Abb. 22) wandert anders als lineare DNA gleicher Länge. Die zirkulärePlasmid-DNA ist u.a. überspiralisiert (Superhelix, engl. supercoiled) und dadurch sehr kompakt. Durch unterschiedlicheSuperspiralisierung der Plasmid-DNA entstehen bei der Elektrophorese verschiedene Banden. Ethidiumionen, die imAgarose-Gel enthalten sind, lagern sich zwischen benachbarten Basenpaaren in DNA ein. DNA mit gebundenemEthidium fluoresziert unter UV-Licht (Abb. 23) und kann dadurch im Agarose-Gel sichtbar gemacht werden. Abbildung 23 : Agarose-Gelelektrophorese Es besteht eine lineare Beziehung zwischen der Wanderungsdistanz und dem Logarithmus der Anzahl DNA-Basenpaare. Wird die Wanderungsdistanz von DNA bekannter Länge gegen log(DNA-Länge) graphisch alsKalibrierkurve aufgezeichnet, kann daran die Länge von DNA-Proben abgelesen werdenRestriktionskarten Bei der Verdauung von DNA mit einem Restriktionsenzym entstehen genau definierte Fragmente, die in einemAgarose-Gel entsprechend der Größe getrennt werden können und ein bestimmtes Muster bilden. VerschiedeneRestriktionsenzyme führen aus derselben DNA zu unterschiedlichen Mustern von Fragmenten. Aus der relativenAnordnung von Restriktionsfragmenten können sogenannte Restriktionskarten gezeichnet werden. Restriktionsstellenbilden dabei „Landmarken" und die lineare Folge von Restriktionsstellen bildet eine „Landkarte von DNA". Solche„Landkarten" werden u.a. häufig benutzt, um nach der Sequenzierung von größeren Restriktionsfragmenten die kompletteSequenz anhand überlappender Teilsequenzen zu ermitteln (Abb. 24). Abbildung 24 : Elektrophoretische Trennung von DNA-Fragmenten a) Muster der elektrophoretischen Trennung von DNA-Fragmenten nach der Verdauung eines DNAMoleküls mit den Restriktionsenzymen Hind III, BamH I oder mit beiden Enzymen. b) Die Restriktionskarte aufgrund des elektrophoretischen Fragmentmusters aus obiger Abbildung (bis auf die rechts/links Seitenorientierung ist die gewonnene Information ausreichend, um eine eindeutige Abfolge der Restriktionsstellen festzulegen). - 40 -
  • 35. BioanalytikRestriktionsfragment-Längenpolymorphismus In der medizinischen Diagnostik und Grundlagenforschung haben Restriktionsmuster eine wichtige Bedeutung. AufGrund von größtenteils stummen Mutationen in kodierenden und nicht-kodierenden Regionen unterscheidet sich dasmenschliche Genom von zwei nicht nahe verwandten Individuen in etwa 0,2% aller Basen (=1:500). Durch solcheVariationen kann eine Erkennungsstelle für ein Restriktionsenzym so verändert werden, dass die DNA dort nicht mehrgeschnitten wird. Wenn die Restriktionserkennungsstelle im DNA-Molekül des einen Chromosoms vorhanden ist,während sie auf dem anderen Chromosom fehlt, entsteht aus dem Chromosom mit der Schnittstelle ein kürzeresFragment und aus dem anderen Chromosom ein längeres. Damit kann man die beiden Chromosomen einer Personaufgrund dieses RFLP7 unterscheiden. Die betreffende Person ist heterozygot für diesen RFLP. Ein weiterer Längen-Polymorphismus beruht auf repetitiven DNA-Sequenzen, die im Genom verstreut und in variabler Anzahl von Tandem-Wiederholungen vorkommen. Restriktionsfragmente, die solche Tandem-Wiederholungen enthalten, können sich deshalbin ihrer Länge unterscheiden. Da der RFLP wie ein Gen vererbt wird, kann man die einzelnen Chromosomen vonGeneration zu Generation verfolgen, indem man die Vererbung des Markerfragments nachweist. Für die praktischeDurchführung benötigt man allerdings sogenannte DNA-Sonden, welche die gewünschten Markerfragmente aus dentausenden von Restriktionsfragmenten durch ein als Hybridisierung bezeichnetes Verfahren gezielt sichtbar machenkönnen. Zu diesem Zweck werden die Restriktionsfragmente nach der Elektrophorese denaturiert (=Trennung der beidenStränge der DNA-Doppelhelix) und auf eine Membran transferiert (=Southern Blot). Unter geeigneten Bedingungenlagert sich die DNA-Sonde an die Stelle mit komplementärer Basensequenz. Am häufigsten werden Sonden verwendet,die repetitive DNA-Abschnitte erkennen. RFLP und weitere DNA-Polymorphismen gelangen u.a. in der Rechtsmedizinzur Anwendung. Mit solchen auch als „DNA-Fingerabdruck" (Fingerprint) bezeichneten Verfahren kann die genetischeVerwandtschaft von Menschen untersucht werden (Abb. 25). Abbildung 25 : Entlastende DNA-Fingerprint-Analyse bei einem VaterschaftsprozessDie Pfeile zeigen Restriktionsbanden beim Kind, die nicht bei der Mutter X, aber auch nicht beim Probanden Y vorkommen Wenn man vermutet oder durch genetische Analysen nachweisen kann, dass ein RFLP relativ nahe beim postuliertenGen einer Erbkrankheit lokalisiert ist, kann man ihn als Marker benützen. Je kürzer ein RFLP vom gesuchten Genentfernt ist, desto geringer ist die Chance, dass bei der Meïose eine Rekombination zwischen Gen und RFLP stattfindet.Bei einer sog. Kopplungsanalyse verfolgt man die gemeinsame Vererbung eines Markers und eines Gens in einer Familie.Mit aufwendigen Untersuchungen an vielen Stammbäumen und mit einer großen Zahl von RFLP-Markern kann esmanchmal gelingen, Gene für eine bestimmte Erbkrankheit zu isolieren, deren Ursache bisher unbekannt war. Diese Artder Genisolierung wird auch als positionelle Klonierung bezeichnet. Beispiele und Meilensteine für dieses Verfahren sinddie Entdeckung der Gene für Mukoviszidose und schwerwiegende neurologische Erkrankungen wie die Duchenne-Muskeldystrophie (vom Neurologen Duchenne beschrieben) oder die sog. Chorea-Huntington oder HuntingtonscheKrankheit (schwere Bewegungsstörung; im deutschsprachigen Raum auch als Veitstanz bezeichnet wegenMuskelzuckungen und unwillkürlichen, fahrigen Bewegungen). Dieser Untersuchungsablauf direkt von der Gensequenzzur Genfunktion wird auch als reverse Genetik bezeichnet.Polymerase-Kettenreaktion Mit PCR (engl. polymerase chain reaction) können spezifische DNA-Abschnitte in einigen Stunden millionenfachvervielfältigt werden (Abb. 26). Voraussetzung ist, dass ein Teil der Nucleotidsequenz bekannt ist, um synthetischeOligonucleotid-Primer herstellen zu können. Ebenso wird die Tatsache ausgenützt, dass die DNA-Stränge gegenläufigsind und die Synthese durch DNA-Polymerase nur am 3-DNA-Ende stattfindet (Abb. 26 B, Pfeile). Die Proben-DNAwird durch Erhöhung der Temperatur auf 94 °C denaturiert (Abb. 26 A). Bei Abkühlung auf 55-60 °C binden die imÜberschuss zugesetzten Oligonucleotide (=Primer) durch Basenpaarung an die DNA-Stränge, nämlich an der Stelle, zuwelcher sie komplementär zur DNA sind (B). Die zugesetzte DNA-Polymerase ergänzt beide Stränge zum jeweiligenDNA-Doppelstrang (C). Bei Verwendung einer hitzestabilen DNA-Polymerase aus thermophilen Bakterien (z.B. ausGeysiren) kann der Reaktionszyklus von Denaturierung, Anhaften der Oligonucleotide und Extension zu denDoppelsträngen wiederholt werden (D-F). Ab dem 3. Zyklus (F) werden DNA-Moleküle der gewünschten Länge gebildetund exponentiell amplifiziert (F-G). Die Synthesereaktion der thermostabilen DNA-Polymerase läuft bei 72 °C optimalab.7 Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus - 41 -
  • 36. Bioanalytik Abbildung 26 : Schematischer Ablauf einer PCR - 42 -
  • 37. BioanalytikRadioaktive Isotope Isotope sind Nuclide (=Kernarten) gleicher Ordnungszahl aber verschiedener Massenzahl, z.B. 12C, 13C, 14C. Wenn einKern zu viele Neutronen enthält, ist er im allgemeinen unstabil, d.h. er zerfällt unter Bildung eines andern, stabilenNuclids und unter Abgabe von Strahlung (Radioaktivität). Die hauptsächlichsten Strahlenarten sind Heliumkerne ( α-Strahlen), Elektronen (ß-Strahlen) und elektromagnetische Quanten (γ-Strahlen). Alle drei Strahlenarten sindionisierend, d.h. sie können beim Durchgang durch Materie Ionisationen hervorrufen. Radioaktivität kann durch dieseEigenschaft nachgewiesen werden. Das Gesetz des radioaktiven Zerfalls lautet: dN − = k ∗N dt Gleichung 44 : Gesetz des radioaktiven Zerfalls 1 wobei N die Gesamtzahl der unstabilen Kerne, k die Zerfallskonstante, -dN/dt die Zerfallsgeschwindigkeit = Anzahlder Zerfallsakte pro Zeiteinheit = Abnahme von N pro Zeiteinheit. Die integrierte Form des Zerfallsgesetzes ist: − k ( t −t 0 ) N = N 0e Gleichung 45 : Gesetz des radioaktiven Zerfalls 2 wobei N0 bzw. N die Gesamtzahl der zur Zeit t0 bzw. t noch nicht zerfallenen Kerne. Das Zeitintervall, in dem N aufgenau die Hälfte von N0 gesunken ist, wird als Halbwertszeit, t1/2, bezeichnet. Sie ist umgekehrt proportional zurZerfallskonstante: 0,69 t1 / 2 = k Gleichung 46 : Halbwertszeit Die Halbwertszeit, bzw. Zerfallskonstante, ist demnach unabhängig von der Menge des vorhandenen radioaktivenMaterials (Reaktion 1. Ordnung). Sie ist charakteristisch für eine bestimmte Kernart. Neben dem Zerfallstyp (Strahlungsart) und der Zerfallszeit (Halbwertszeit) ist jedes radioaktive Isotop durch die beider Umwandlung freiwerdende Zerfallsenergie gekennzeichnet. Man versteht darunter die Energie der emittiertenStrahlung. Sie wird angegeben in Megaelektronenvolt (MeV). Diese Energie hat nichts zu tun mit der Aktivitätsangabeeines radioaktiven Präparates! Sie ist aber ausschlaggebend für das Ionisationsvermögen der Strahlung. Zusammen mitdem Strahlungstyp und der Natur des Mediums bestimmt sie die maximale Reichweite der Strahlung.In Biochemie und Medizin gebräuchliche Radioisotope: Mittlere Max. Reich- Strahlungs- Isotop Halbwertszeit Energie weite in art [MeV] Wasser [mm] 3 H β- 12,3 Jahre 0,006 0,003 14 - C β 5.760 Jahre 0,05 0,3 32 P β- 14,2 Tage 0,68 8,0 35 S β- 87,0 Tage 0,05 0,3 59 - Fe β /γ 45,0 Tage ≈ 1,30 ≈ 2 125 I γ 60,0 Tage 0,035 ≈ 2 Tabelle 9 : In Biochemie und Medizin gebräuchliche RadioisotopeBestimmung der Radioaktivität Die für die Isotopenanwendung in der Biochemie wichtigste Messgröße ist die Anzahl radioaktiver (= unstabiler)Atome (N) in einer Probe. Nach Gl. 44 ist sie proportional zur Anzahl von Zerfallsakten pro Zeiteinheit (= Radioaktivität)und lässt sich durch deren Messung quantitativ erfassen.Messmethodik Die am häufigsten benützten Isotope sind β-Strahler von geringer Reichweite. Ihre Radioaktivität wird imFlüssigkeits-Szintillationszähler gemessen. Bei diesem Verfahren wird die zu messende radioaktive Probe in einemLösungsmittel gelöst, das eine fluoreszierende Substanz (= Szintillator) enthält, die durch die Strahlung zur Fluoreszenzangeregt wird. Der entstehende Lichtblitz wird durch einen Photonenvervielfacher in einen elektrischen Stromstossumgewandelt und in einer Zähleinrichtung als Impuls („count") registriert. Die Impulsfrequenz wird in „count’s perminute" (= cpm) angegeben. - 43 -
  • 38. Bioanalytik„Background" Auch ohne radioaktive Probe werden in einem Messgerät Impulse registriert. Diese stammen von Verunreinigungendes Zählgerätes und seiner Umgebung mit radioaktivem Material, von kosmischer Strahlung und von elektronischemRauschen des Apparates. Solche Impulse werden „background count’s" genannt. Sie variieren je nachVersuchsbedingung und nach Instrument. Es ist daher nötig, die „background count’s" bei jeder Messung radioaktiverProben separat zu bestimmen und sie von den „counts" der Proben abzuziehen. Der resultierende korrigierte Wert istsomit: Probe korr. = Probe − background [ cpm] Gleichung 47 : Hintergrundkorrektur für radioaktive MessungenZählstatistik Der Zerfall eines unstabilen Kerns ist ein statistisches Ereignis. Die Wahrscheinlichkeit für das Eintreten einesZerfalls ist durch das Poissonsche Verteilungsgesetz gegeben. Nach diesem Gesetz entspricht die Standardabweichungoder Streuung eines Einzelmesswertes m seiner Quadratwurzel (= √m). Ergibt eine Einzelmessung m Impulse, so liegtder wahre Wert mit 68 % Wahrscheinlichkeit im Bereich m ± √m. Die Standardabweichung, ausgedrückt in Prozentendes Messwertes, ist 100 √m/m oder 100/√m. Bei Messungen von Proben mit 100 bzw. 10.000 Impulsen ergeben sich soStreubreiten von 10 % und 1 %. Die prozentuale Streuung nimmt also mit steigender Anzahl der gemessenen „counts"ab. Sie ist unabhängig von der Zeit, während welcher gemessen wird. Bei wenig aktiven Proben kann sie durchVerlängerung der Zähldauer herabgesetzt werden.Einheiten der Radioaktivität Für viele Anwendungen reicht es, die in einer Probe vorhandene Aktivitätsmenge als gemessene und für„background" korrigierte Impulse pro min (cpm) anzugeben. Das absolute Maß für die Radioaktivität einer Probe ist dieZahl der Zerfallsakte pro Zeiteinheit (dpm = decays per minute). Diese Zerfallsgeschwindigkeit (dpm) ist immer größerals die gemessene Impulsfrequenz (cpm). Das prozentuale Verhältnis der beiden, 100 x cpmProbe,korr/dpm, wird alsZählausbeute bezeichnet. Ihre Größe ist durch verschiedene Variablen bedingt, wie die Geometrie des Messapparatesund die Fluoreszenzausbeute des Szintillators. Die Zählausbeute kann erniedrigt werden durch die Deaktivierungangeregter Zustände (chemisches Quenching z.B. durch Carbonylverbindungen wie Ketone und Carbonsäuren) oderdurch Absorption des Fluoreszenzlichts durch die Probe selbst (Farbquenching). Die Herabsetzung der Zählausbeute einerMesseinrichtung kann mit Hilfe von Standardproben bestimmt werden, für welche die Menge des radioaktiven Isotopsgenau bekannt ist. Die fundamentale Einheit für die Menge eines radioaktiven Isotops ist das Becquerel: 1 Bq = 1 Zerfall/Sekunde(1 dps). Die ältere, noch gebräuchlichere Einheit ist das Curie: 1 Ci = 3,67 x 1010 Bq. Gebräuchlicher sind die EinheitenKilobecquerel (kBq) und Megabecquerel (MBq), respektive Millicurie (mCi) und Mikrocurie (µCi).Spezifische Radioaktivität Für die meisten quantitativen Anwendungen von Isotopen in der Biochemie muss die spezifische Radioaktivitätbekannt sein. Man versteht darunter die in der Gewichtseinheit (g) oder in einem Mol einer reinen Substanz enthalteneAktivitätsmenge. Die spezifische Radioaktivität pro g-Atom eines reinen radioaktiven Isotops lässt sich nach Gl. 44 ausder Halbwertszeit und der Avogadroschen Zahl ableiten. Für 3H und 14C ergeben sich so Werte von 1,07 x 1015 Bq/g-Atombzw. 2,3 x 1012 Bq/g-Atom. Gewöhnlich werden radioaktive Isotope nicht in reiner Form, sondern in Mischung mit einem hohen Überschussstabiler Isotope des gleichen Elements verwendet. Zur Ermittlung der spezifischen Radioaktivität solcher Proben muss dieRadioaktivität und die chemisch messbare Gesamtmenge von radioaktiver und nicht-radioaktiver Substanz bestimmtwerden. Kenntnis der spezifischen Radioaktivität gestattet dann die Umrechnung von gemessenen Radioaktivitätsmengenin Gramm oder Mol der markierten Substanz. Bei kurzlebigen Isotopen müssen Korrekturen gemacht werden für dieÄnderung der spezifischen Radioaktivität während des Experiments.Wirkung radioaktiver Strahlung auf lebendes Gewebe - Radiodosimetrie Alle Strahlungsarten von radioaktiven Isotopen können lebendes Gewebe schädigen. Maßgebend für die schädigendeWirkung ist das Ionisationsvermögen der radioaktiven Strahlung bzw. die im Gewebe absorbierteStrahlungsenergiemenge. Die quantitative Messung ionisierender Strahlung wird als Radiodosimetrie bezeichnet. Die auf tote oder lebende Materie übertragene Energie wird Energiedosis genannt und in Joule/kg Materie angegeben.Die Einheit der Energiedosis ist das Gray (Gy), wobei 1 Gy = 1 J/kg. Die immer noch gebräuchliche ältere Einheit istdas rad (rd); 1 rd = 0,01 Gy = 0,01 J/kg. Noch älter ist die Einheit Röntgen (r), die streng genommen nur fürIonisierung durch γ- oder Röntgenstrahlen gilt und materialunabhängig ist. Ein r ist diejenige Menge an γ- oderRöntgenstrahlung, die in Luft zur Absorption von 8,3 x 10-6 J/g führt, was etwa 2 x 109 Ionenpaare/cm3 Luft erzeugt. InLuft und Körpergewebe ist 1 r ≈ 1 Gy. Die Energiedosis (Gy) ist unabhängig von der Art der Strahlung und sagt deshalb vorerst nichts aus über derenschädigende Wirkung. Vielmehr ist es so, dass verschiedene radioaktive Strahlung bei gleicher Energiedosisverschieden stark schädigt. Beispielsweise ist die Übertragung von 1 Gy als α-Strahlung (z.B. 219Radon) viel stärkerschädigend als 1 Gy als β-Strahlung (z.B. 14C). Als Maß für die biologische Wirkung von radioaktiver Strahlung gilt dieÄquivalentdosis. Ihre Einheit ist das Sievert (Sv). Die Äquivalentdosis berechnet man aus der Energiedosis gemäss: - 44 -
  • 39. Bioanalytik Äquivalentdosis = Energiedos is ∗Qualitätsfaktor Gleichung 48 : Berechnung der Äquivalentdosis Für β- und γ-Strahlen ist der Qualitätsfaktor 1, für α-Strahlen bis 20. Bei 14C oder 3H, beides relativ schwache β-Strahler, gilt also Energiedosis = Äquivalentdosis, resp. 1 Gy = 1 Sv. Die ältere Einheit der Äquivalentdosis ist das rem(Röntgen equivalent for man); 1 rem = 0,01 Sv. Die Äquivalentdosis/Zeit (Äquivalenzdosisleistung) kann man aus der Radioaktivitätsmenge (Bq) abschätzen. DieAbschätzung ist verschieden für äußere und innere Bestrahlung. Radioaktivitätsmenge ∗ Dosiskonstante Äquivalentdosisleist ung = ( Abstand) 2 Gleichung 49 : Äquivalentdosisleistung für äußere Bestrahlung Bei äußerer Bestrahlung nimmt demnach die Gefährdung mit dem Quadrat des Abstands zwischen derStrahlungsquelle und dem bestrahlten Objekt ab. Die Dosiskonstante ist abhängig vom Radioisotop. Die Bestrahlung miteiner Menge von 107 Bq 32P (10 MBq, 0,27 mCi) in einem Abstand von 1 m erzeugt eine Äquivalentdosisleistung von9,2 x 10-5 Sv/h (0,092 mSv/h = 9,2 mrem/h). Die gleiche Menge an 14C erzeugt keinerlei Strahlenbelastung in 1 mAbstand, da bereits wenige mm Luftschicht die Energie aus dem Zerfall von 14C vollständig absorbiert. Äquivalentdosisleist ung = DECO ∗inkorporierte Aktivitätsmenge Gleichung 50 : Äquivalentdosisleistung für innere Bestrahlung Der Wert DECO (Dosis equivalent for critical organ) ist eine für ein Radioisotop typische Konstante. Die DECO-Werte variieren sehr stark und dienen zur Klassifizierung der Radioisotope in Toxizitätsklassen. Die Radiotoxizität von intern aufgenommenen Isotopen hängt außer von der Aktivitätsmenge, der Halbwertszeit undden besonderen Strahlungseigenschaften auch von der Verweildauer im Organismus ab. Aufgrund dieser Gesichtspunktelassen sich Isotope in verschiedene Toxizitätsklassen einteilen. Einige Beispiele sind: 1. Sehr hohe Radiotoxizität: 90 Sr, 239Pu, 235U 2. Hohe Radiotoxizität: 131 I, 125I 3. Mäßige Radiotoxizität: 32P, 59Fe 4. Niedrige Radiotoxizität: H, 14C, 35S 3Beispiele für innere Bestrahlung Inkorporation von 5,5 x 104 Bq (1,5 µCi) 32P erzeugt eine Strahlenbelastung von etwa 0,003 Sv (0,3 rem).Uranhaltiges Quellwasser (z.B. in gewissen Gebieten des Wallis) enthält etwa 37 Bq/m 3 238U. Bei ausschließlichemKonsum dieses Wassers (1,5 l/Tag) wird in einem Jahr eine Äquivalentdosis von 1,6 x 10-5 Sv (16 µSv) akkumuliert. Diejährliche Strahlenbelastung für den Durchschnitt der Bevölkerung beträgt 2-3 x 10-3 Sv (2-3 mSv), davon stammen etwadie Hälfte aus künstlichen Quellen, v.a. medizinische Untersuchungen.Richtlinien zum Arbeiten mit 3H- und 14C-markierten Substanzen 3 H und 14C sind schwache β-Strahler. Bei den Mengen, die in biologischen Versuchen zur Anwendung kommen,besteht keinerlei Gefahr einer Strahlenschädigung von außen. Dagegen besteht das Risiko einer inneren Kontaminationdurch Verschlucken von radioaktiven Lösungen, Einatmen flüchtiger Verbindungen oder Hautkontakt mit fettlöslichenVerbindungen. Zur Vermeidung solcher Zwischenfälle dürfen radioaktive Lösungen nie mit dem Mund direkt pipettiert werden,sondern nur mit Hilfe von mechanischen Pipettiervorrichtungen. Bei Kontamination der Haut muss sofort gründlich mitWasser gewaschen werden. - 45 -
  • 40. BioanalytikImmunologische Bestimmungsmethoden Die Immunologie umfasst sämtliche Phänomene und Wechselwirkungen, die mit der spezifischen Abwehrreaktioneines Organismus auf eindringende Fremdsubstanzen - sogenannte Antigene - zusammenhängen. ImmunologischeMethoden werden zur Diagnose von Infektionskrankheiten verwendet. Es lassen sich damit aber auch Hormone,Vitamine, Medikamente und andere Stoffe in sehr geringen Konzentrationen bestimmen, sofern spezifische Antikörpergegen sie erzeugt werden können. Folgende Eigenschaften zeichnen die Antigen-Antikörperreaktion aus: 1. Die Reaktion ist spezifisch 2. Die Bindung zwischen Antigen und Antikörper ist stark (Kd bis 10-10 m) 3. Für die Bindung zwischen Antigen und Antikörper sind die gleichen Kräfte verantwortlich wie für die Bindung von Substrat ans Enzym oder von Hormon an den Rezeptor (Wasserstoffbrücken, hydrophobe Wechselwirkungen sowie elektrostatische Kräfte). Es sind heute eine ganze Reihe von qualitativen und quantitativen immunologischen Bestimmungsmethoden inGebrauch, so z.B. der Agglutinationstest zur Blutgruppenbestimmung, der Radioimmunoassay (RIA) und derEnzymimmunoassay (EIA). Der EIA ist eine Weiterentwicklung des RIA. Bei beiden Tests ist die grundlegende Reaktiongleich. Die Bindung einer bekannten Menge radioaktiven (RIA) resp. enzymmarkierten (EIA) Antigens an Antikörperwird durch die Zugabe von nichtmarkiertem Antigen inhibiert. Das Ausmaß dieser Hemmung kann als Maß für diezugegebene Menge nichtmarkierten Antigens verwendet werden. Die Menge des gebundenen radioaktiven resp.enzymmarkierten Antigens wird beim RIA durch Messung von dessen Radioaktivität, beim EIA durch Messung vondessen Enzymaktivität bestimmt. Beide Bestimmungsmethoden (RIA und EIA) sind spezifisch und außerordentlichempfindlich. Es können noch zuverlässig Stoffmengen im ng- und pg-Bereich bestimmt werden. - 47 -
  • 41. BioanalytikAnhangAbbildungsverzeichnisAbbildung 1 : Ringbildung der Glucose (α- und β-Form)...............................................................................7Abbildung 2 : Glykoside von Glucose.............................................................................................................. 7Abbildung 3 : Disaccharide................................................................................................................................ 8Abbildung 4 : Absorptionsspektren der aromatischen Aminosäuren...........................................................9Abbildung 5 : Absorptionsspektren von Proteinen mit verschiedenem Gehaltan aromatischenAminosäuren...................................................................................................................................................... 10Abbildung 6 : Löslichkeit von β-Lactoglobulin (IEP 5,2) in Abhängigkeit vom pH-Wert bei 25 °C...........12Abbildung 7 : Schnitt durch eine Lipid-Doppelschicht.................................................................................15Abbildung 8 : Diffusion von Phospholipidmolekülen in einer Lipid-Doppelschicht..................................16Abbildung 9 : Elektropherogramm von Serum eines Menschen..................................................................23Abbildung 10 : Trennung von zwei Aminosäuren (A1 und A2) auf Kationenaustauscherharz.................26Abbildung 11 : Analyse von Aminosäuren mit Hilfe einer HPLC an einem Kationenaustausscher-Harz.26Abbildung 12 : log Molekularmasse gegen Elutionsvolumen......................................................................27Abbildung 13 : Gültigkeitsbereich des Lambert-Beer Gesetzes...................................................................29Abbildung 14 : Schematische Darstellung eines Spektralphotometers......................................................30Abbildung 15 : Abhängigkeit der Aktivität von der Substratkonzentration (v gegen [S]-Darstellung).....32Abbildung 16 : Abhängigkeit der Aktivität von der Substratkonzentration.................................................34Abbildung 17 : Abhängigkeit der Geschwindigkeit von der Enzymkonzentration.....................................34Abbildung 18 : Abhängigkeit der Enzymaktivität von der Enzymkonzentration.........................................34Abbildung 19 : Abhängigkeit der Enzymaktivität von der Temperatur........................................................35Abbildung 20 : Kompetitive Hemmung........................................................................................................... 35Abbildung 21 : Nicht-kompetitive Hemmung.................................................................................................. 35Abbildung 22 : Elektronenmikroskopische Aufnahme von Plasmiden (unterschiedlicheÜberspiralisierung)............................................................................................................................................ 39Abbildung 23 : Agarose-Gelelektrophorese................................................................................................... 40Abbildung 24 : Elektrophoretische Trennung von DNA-Fragmenten..........................................................40Abbildung 25 : Entlastende DNA-Fingerprint-Analyse bei einem Vaterschaftsprozess.............................41Abbildung 26 : Schematischer Ablauf einer PCR........................................................................................... 42 - 49 -
  • 42. BioanalytikFormelverzeichnisFormel 1 : Benedict-Probe.................................................................................................................................. 8Formel 2 : Enzymatischer Glucosenachweis, Schritt 1...................................................................................8Formel 3 : Enzymatischer Glucosenachweis, Schritt 2...................................................................................8Formel 4 : Peptidbindung in Proteïnen............................................................................................................. 9Formel 5 : Ninhydrin-Reaktion........................................................................................................................... 9Formel 6 : Unterschiede bei Seife, Detergens- und Gallensäuremolekülen................................................13Formel 7 : Grundstruktur der Glycerolphosphatide......................................................................................15Formel 8 : Brönstedsche Säure-Base-Definition............................................................................................19Formel 9 : Ampholyt.......................................................................................................................................... 21Formel 10 : Dissoziation von sauren und basischen Aminosäuren (Aspartat)...........................................21Formel 11 : Ionen-Austausch am Austauscherharz.......................................................................................25Formel 12 : Formaler Ablauf einer enzymatischen Reaktion........................................................................31Formel 13 : Reaktionsschema einer "normalen" enzymatischen Reaktion.................................................31Formel 14 : Einfachste Formulierung einer enzymatischen Reaktion.........................................................31Formel 15 : Enzymatische Reaktion................................................................................................................ 36 - 50 -
  • 43. BioanalytikGleichungsverzeichnisGleichung 1 : Gebräuchliche Masse-Einheiten................................................................................................ 4Gleichung 2 : Gebräuchliche Stoffmengen-Einheiten.....................................................................................4Gleichung 3 : Umrechnung: Masse in Stoffmenge und vice versa................................................................4Gleichung 4 : Gebräuchliche Volumen-Einheiten............................................................................................4Gleichung 5 : Gebräuchliche Massenkonzentrations-Einheiten....................................................................5Gleichung 6 : Gebräuchliche Stoffmengenkonzentrations-Einheiten...........................................................5Gleichung 7 : Berechnung der Sedimentationskonstanten..........................................................................11Gleichung 8 : Definition der Säuredissoziationskonstante..........................................................................19Gleichung 9 : Säuredissoziationskonstante einer schwachen Säure..........................................................19Gleichung 10 : pH-Wert einer schwachen Säure............................................................................................ 19Gleichung 11 : Dissoziationsgleichgewicht von Wasser..............................................................................19Gleichung 12 : Ionenprodukt des Wassers..................................................................................................... 20Gleichung 13 : pH-Wertes einer Lösung des Salzes einer schwachen Säure mit einer starken Base.....20Gleichung 14 : Henderson-Hasselbalch-Gleichung.......................................................................................20Gleichung 15 : IEP einer Aminosäure............................................................................................................. 21Gleichung 16 : Allgemeine Definition des Rf-Wertes.....................................................................................25Gleichung 17 : Volumenverteilung in einer "Sephadex"-Säule....................................................................26Gleichung 18 : Abhängigkeit des Elutionsvolumens einer Substanz..........................................................26Gleichung 19 : Definition der Extinktion E (optischen Dichte OD)..............................................................29Gleichung 20 : Bezeihung zwischen %D und E............................................................................................. 29Gleichung 21 : Geschwindigkeit der Produktentstehung.............................................................................31Gleichung 22 : Fliessgleichgewicht einer enzymatischen Reaktion............................................................32Gleichung 23 : Umformung der Gl. 22............................................................................................................. 32Gleichung 24 : Anfangsgeschwindigkeit der enzymatischen Reaktion.......................................................32Gleichung 25 : Michaelis-Menten-Gleichung.................................................................................................. 32Gleichung 26 : Definition der Konstanten der Michaelis-Menten-Gleichung..............................................32Gleichung 27 : Michaelis-Menten-Gleichung bei Substratkonzentrationen weit unterhalb Km................33Gleichung 28 : Michaelis-Menten-Gleichung bei Substratkonzentrationen weit oberhalb Km.................33Gleichung 29 : Lineweaver-Burk 1................................................................................................................... 33Gleichung 30 : Lineweaver-Burk 2................................................................................................................... 33Gleichung 31 : Substituierte Michaelis-Menten-Gleichung...........................................................................34Gleichung 32 : Enzymaktivität 1...................................................................................................................... 36 - 51 -
  • 44. BioanalytikGleichung 33 : Enzymaktivität 2...................................................................................................................... 36Gleichung 34 : Enzymaktivität 3...................................................................................................................... 37Gleichung 35 : Spezifische Aktivität................................................................................................................ 37Gleichung 36 : Aktivitätskonzentrtion im Ansatz...........................................................................................37Gleichung 37 : Aktivitätskonzentration in der Enzymlösung........................................................................37Gleichung 38 : Spezifische Aktivität................................................................................................................ 37Gleichung 39 : Substratkonzentration im Ansatz..........................................................................................37Gleichung 40 : Konzentration der zugesetzten Substratlösung...................................................................37Gleichung 41 : Anfängliche Substratkonzentration im Ansatz.....................................................................37Gleichung 42 : Konzentration der Pyruvatlösung..........................................................................................38Gleichung 43 : Massenkonzentration der Pyruvatlösung.............................................................................38Gleichung 44 : Gesetz des radioaktiven Zerfalls 1......................................................................................... 43Gleichung 45 : Gesetz des radioaktiven Zerfalls 2......................................................................................... 43Gleichung 46 : Halbwertszeit........................................................................................................................... 43Gleichung 47 : Hintergrundkorrektur für radioaktive Messungen................................................................44Gleichung 48 : Berechnung der Äquivalentdosis.......................................................................................... 45Gleichung 49 : Äquivalentdosisleistung für äußere Bestrahlung................................................................45Gleichung 50 : Äquivalentdosisleistung für innere Bestrahlung.................................................................45TabellenverzeichnisTabelle 1 :Tryptophan- und Tyrosingehalt in g Aminosäure pro 100 g Proteïn.........................................10Tabelle 2 : Molekularmasse einiger Proteïne.................................................................................................. 10Tabelle 3 : Typische Werte für S...................................................................................................................... 11Tabelle 4 : Phospholipidtypen......................................................................................................................... 15Tabelle 5 : pKa- und IEP-Werte einiger Aminosäuren...................................................................................22Tabelle 6 : Chromatographietypen.................................................................................................................. 25Tabelle 7 : Ausschluss-Molekularmassen einiger "Sephadex"-Gele...........................................................27Tabelle 8 : Erkennungssequenz einiger Restriktionsendonucleasen..........................................................39Tabelle 9 : In Biochemie und Medizin gebräuchliche Radioisotope............................................................43 - 52 -
  • 45. BioanalytikGleichung 33 : Enzymaktivität 2...................................................................................................................... 36Gleichung 34 : Enzymaktivität 3...................................................................................................................... 37Gleichung 35 : Spezifische Aktivität................................................................................................................ 37Gleichung 36 : Aktivitätskonzentrtion im Ansatz...........................................................................................37Gleichung 37 : Aktivitätskonzentration in der Enzymlösung........................................................................37Gleichung 38 : Spezifische Aktivität................................................................................................................ 37Gleichung 39 : Substratkonzentration im Ansatz..........................................................................................37Gleichung 40 : Konzentration der zugesetzten Substratlösung...................................................................37Gleichung 41 : Anfängliche Substratkonzentration im Ansatz.....................................................................37Gleichung 42 : Konzentration der Pyruvatlösung..........................................................................................38Gleichung 43 : Massenkonzentration der Pyruvatlösung.............................................................................38Gleichung 44 : Gesetz des radioaktiven Zerfalls 1......................................................................................... 43Gleichung 45 : Gesetz des radioaktiven Zerfalls 2......................................................................................... 43Gleichung 46 : Halbwertszeit........................................................................................................................... 43Gleichung 47 : Hintergrundkorrektur für radioaktive Messungen................................................................44Gleichung 48 : Berechnung der Äquivalentdosis.......................................................................................... 45Gleichung 49 : Äquivalentdosisleistung für äußere Bestrahlung................................................................45Gleichung 50 : Äquivalentdosisleistung für innere Bestrahlung.................................................................45TabellenverzeichnisTabelle 1 :Tryptophan- und Tyrosingehalt in g Aminosäure pro 100 g Proteïn.........................................10Tabelle 2 : Molekularmasse einiger Proteïne.................................................................................................. 10Tabelle 3 : Typische Werte für S...................................................................................................................... 11Tabelle 4 : Phospholipidtypen......................................................................................................................... 15Tabelle 5 : pKa- und IEP-Werte einiger Aminosäuren...................................................................................22Tabelle 6 : Chromatographietypen.................................................................................................................. 25Tabelle 7 : Ausschluss-Molekularmassen einiger "Sephadex"-Gele...........................................................27Tabelle 8 : Erkennungssequenz einiger Restriktionsendonucleasen..........................................................39Tabelle 9 : In Biochemie und Medizin gebräuchliche Radioisotope............................................................43 - 52 -
  • 46. BioanalytikGleichung 33 : Enzymaktivität 2...................................................................................................................... 36Gleichung 34 : Enzymaktivität 3...................................................................................................................... 37Gleichung 35 : Spezifische Aktivität................................................................................................................ 37Gleichung 36 : Aktivitätskonzentrtion im Ansatz...........................................................................................37Gleichung 37 : Aktivitätskonzentration in der Enzymlösung........................................................................37Gleichung 38 : Spezifische Aktivität................................................................................................................ 37Gleichung 39 : Substratkonzentration im Ansatz..........................................................................................37Gleichung 40 : Konzentration der zugesetzten Substratlösung...................................................................37Gleichung 41 : Anfängliche Substratkonzentration im Ansatz.....................................................................37Gleichung 42 : Konzentration der Pyruvatlösung..........................................................................................38Gleichung 43 : Massenkonzentration der Pyruvatlösung.............................................................................38Gleichung 44 : Gesetz des radioaktiven Zerfalls 1......................................................................................... 43Gleichung 45 : Gesetz des radioaktiven Zerfalls 2......................................................................................... 43Gleichung 46 : Halbwertszeit........................................................................................................................... 43Gleichung 47 : Hintergrundkorrektur für radioaktive Messungen................................................................44Gleichung 48 : Berechnung der Äquivalentdosis.......................................................................................... 45Gleichung 49 : Äquivalentdosisleistung für äußere Bestrahlung................................................................45Gleichung 50 : Äquivalentdosisleistung für innere Bestrahlung.................................................................45TabellenverzeichnisTabelle 1 :Tryptophan- und Tyrosingehalt in g Aminosäure pro 100 g Proteïn.........................................10Tabelle 2 : Molekularmasse einiger Proteïne.................................................................................................. 10Tabelle 3 : Typische Werte für S...................................................................................................................... 11Tabelle 4 : Phospholipidtypen......................................................................................................................... 15Tabelle 5 : pKa- und IEP-Werte einiger Aminosäuren...................................................................................22Tabelle 6 : Chromatographietypen.................................................................................................................. 25Tabelle 7 : Ausschluss-Molekularmassen einiger "Sephadex"-Gele...........................................................27Tabelle 8 : Erkennungssequenz einiger Restriktionsendonucleasen..........................................................39Tabelle 9 : In Biochemie und Medizin gebräuchliche Radioisotope............................................................43 - 52 -