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GENÉTICA
MOLECULAR E
BIOTECNOLOGIA

TÉCNICAS DE DESINFECÇÃO DO MATERIAL
VEGET...
Índice
Introdução ...........................................................................................................
Introdução
“In vitro” ("em vidro") é uma expressão latina que designa todos os processos
biológicos que têm lugar fora dos...
Desinfecção e Importância dos métodos
Pré – tratamento: retirar o lixo existente no material e passar abundantemente
por á...
Caules:
1 – Passagem por etanol a 70%, agitamos, durante 30 segundos;
2 – Passagem por uma solução de ácido cítrico (150 m...
Material de laboratório:
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Erlenmeyers

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Pinças

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Bisturis

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Etanol a 70%

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Placas de petri

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Frascos com meio ...
Os frascos serão colocados num fitoclima a 25ºC e com um fotoperíodo de 12
horas de luz.

Resultados
Tabela dos resultados...
Tabela dos resultados observados nas culturas de caules:

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Técnicas de desinfecção do material

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VEGETAL (EXPLANTS)

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  1. 1. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro GENÉTICA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA TÉCNICAS DE DESINFECÇÃO DO MATERIAL VEGETAL (EXPLANTS) Docente: Fernanda Leal Discentes: CRISTIANA VALENTE Nº 33708; DAVID RODRIGUES Nº 33714; FRANCISCO PINTO Nº 33707; LUÍS SAMPAIO Nº 33706; PEDRO VEIGA Nº 33698
  2. 2. Índice Introdução ..................................................................................................................................... 3 Desinfecção e Importância dos métodos .................................................................................. 4 Métodos de desinfecção utilizados nos diferentes "explants” ................................................. 4 Objectivos...................................................................................................................................... 5 Material utilizado .......................................................................................................................... 5 Procedimentos .............................................................................................................................. 6 Resultados ..................................................................................................................................... 7 Discussão ....................................................................................................................................... 9 Conclusões .................................................................................................................................... 9 2
  3. 3. Introdução “In vitro” ("em vidro") é uma expressão latina que designa todos os processos biológicos que têm lugar fora dos sistemas vivos, no ambiente controlado e fechado de um laboratório e que são feitos normalmente em recipientes de vidro. A cultura “in vitro” de plantas refere-se ao cultivo de sementes, embriões ou fragmentos de tecido vegetal sob condições assépticas, em meios nutritivos adequados, dispondo de luz, temperatura e humidade controladas, com o objectivo de obter uma rápida multiplicação de plantas, isentas de pragas e doenças. Como principais vantagens a cultura “in vitro” apresenta as seguintes:  Pode ser a única forma de as propagar vegetativamente;  As plantas têm geralmente um crescimento mas rápido;  Podemos fornecer todas as condições óptimas;  Podemos obter maior número de plantas em menor tempo;  Obtêm-se plantas iguais à planta-mãe;  Se usarmos outro “explant” também podemos ter variabilidade;  Permite juntar espécies muito diferentes. Apesar de todas estas vantagens, a cultura “in vitro” possui igualmente diversas desvantagens sendo algumas delas as seguintes:  A propagação massiva não pode ser aplicada actualmente em todas as espécies vegetais;  A regeneração pode não ser possível, especialmente para árvores lenhosas adultas. Existem mais problemas para obter raízes que rebentos;  Podem não ter um crescimento uniforme e em lugar disso ter diferentes taxas de crescimento e maduração “in vitro”;  É um processo muito dispendioso e pode ter um custo laboral superior a 70%;  Uma planta infectada pode produzir clones infectados. Isto é incomum, já que as plantas em stock são seleccionadas e vedadas com cuidado para evitar isto. 3
  4. 4. Desinfecção e Importância dos métodos Pré – tratamento: retirar o lixo existente no material e passar abundantemente por água corrente; Tratamento: passar o “expant” por etanol a 70%, seguindo-se a passagem por um agente desinfectante (hipoclorito de sódio ou cálcio, cloreto de mercúrio, peróxido de hidrogénio, etc.); Pós – tratamento: remover restos do agente desinfectante, passando o “explant” por água destilada num frasco, durante 5 a 10 minutos, repetir o processo três vezes. O tempo que dura o tratamento e o tipo de desinfectante a utilizar depende do material vegetal que estamos a trabalhar; depende, por exemplo, do tipo de “explant” e do seu grau de contaminação. Métodos de desinfecção utilizados nos diferentes "explants” Folhas: 1 – Lavagem com água corrente; 2 – Solução de hipoclorito de sódio a 4% com 2 a 3 gotas de Tween 80, 15 minutos devido à grossura; 3 – Três passagens por água destilada até à sua utilização. Sementes: 1 – Passagem por etanol a 70%, durante 3 a 4 minutos; 2 – Passagem por uma solução de hipoclorito de sódio com 2 a 3 gotas de Tween 80, durante 15 minutos; 3 – Três passagens por água destilada, cada uma delas demorando 10 minutos. 4
  5. 5. Caules: 1 – Passagem por etanol a 70%, agitamos, durante 30 segundos; 2 – Passagem por uma solução de ácido cítrico (150 mg) e ácido ascórbico (100 mg), durante 5 minutos; 3 – Imersão em etanol a 70%, durante alguns instantes; 4 – Imersão em hipoclorito de sódio (20 cm3 de lixívia comercial e 100 cm3 de água destilada), durante 20 minutos; 5 – Três passagens por água destilada. Objectivos  Ter o primeiro contacto com este material;  Perceber que devemos aplicar desinfecções diferentes consoante o tipo de “explant”;  Observar as infecções do material vegetal após instalação em cultura “in vitro” e, assim, verificar a eficácia dos tratamentos de desinfecção aplicados nos “explants”;  Cuidados a ter na execução de cultura “in vitro”. Material utilizado Material vegetal:  Sementes  Caules  Folhas  “Explant” de material já instalado em cultura “in vitro” 5
  6. 6. Material de laboratório:  Erlenmeyers  Pinças  Bisturis  Etanol a 70%  Placas de petri  Frascos com meio de cultura  Parafilm  Papel de alumínio  Papel de filtro  Marcadores  Algodão hidrófilo  Água destilada  Hipoclorito de sódio  Tween 80 Procedimentos Todos os trabalhos têm de ser realizados em condições de assepsia, sendo para tal executados numa câmara de fluxo laminar. Esta filtra o ar, não permitindo a circulação de ar contaminado, tendo de ser ligada 20-30 minutos antes para prévia desinfecção do ar dentro da câmara. São fornecidos aos alunos diferentes tipos de “explants” que são então desinfectados em etanol a 70%, posteriormente por hipoclorito de sódio e, por fim, por água destilada. Em alguns casos terá de ser efectuado um tratamento de desinfecção específico. Após esterilização dos “explants”, procede-se à instalação destes num meio de cultura (MS) previamente preparado pelos técnicos. Em cada meio de cultura será indicado o tipo de “explant”, a data da sua instalação no meio, a identificação do grupo e do curso. 6
  7. 7. Os frascos serão colocados num fitoclima a 25ºC e com um fotoperíodo de 12 horas de luz. Resultados Tabela dos resultados observados nas culturas de folhas: Semana Placa 1 2 3 4 5 Infecções no meio de cultura (número de focos) Infecções no “explant” (número de "explants" infectados/6) Formação de fenóis 1ª 2ª 3ª 1ª 2ª 3ª 1ª 2ª 3ª 1ª 2ª 3ª 1ª 2ª 3ª bactérias (1) bactérias (1) bactérias (1), fungos (1) não não não não não não não não não não fungos (1) fungos (1) fungos (1) fungos (1) fungos (1), bactérias (1) fungos (1), bactérias (1) fungos (1), bactérias (1) fungos (1), bactérias (1) Não Não Não Não bactérias (3) bactérias (3) fungos (2), bactérias (2) fungos (2), bactérias (2) fungos (2), bactérias (2) não não não não não não não não não não não não não não não Tabela dos resultados observados nas culturas de embriões de sementes: Frasco 1 2 3 4 5 Semana Infecções no meio de cultura (número de focos) Infecções no explant (número de "explants" infectados/2) Formação de fenóis 1ª 2ª 3ª 1ª 2ª 3ª 1ª 2ª 3ª 1ª 2ª 3ª 1ª 2ª 3ª não bactérias (1) bactérias (1), fungos (1) não não bactérias (1) não não não não não não bactérias (1) bactérias (1) bactérias (1) Não bactérias (1) bactérias (1) Não Não Não Não Não Não Não Não Não Não bactérias (1) bactérias (1) não não não não não não não não não não não não não não não 7
  8. 8. Tabela dos resultados observados nas culturas de caules: Semana Placa 1 2 3 4 5 Infecções no meio de cultura (número de focos) Infecções no “explant” (número de "explants"/2) Formação de fenóis 1ª 2ª 3ª 1ª 2ª 3ª 1ª 2ª 3ª 1ª 2ª 3ª 1ª 2ª 3ª não fungos (1) bactérias (1), fungos (1) não não não não não não não não não não não não fungos (1), bactérias (1) fungos (2) fungos (1) Não Não Não bactérias (2) bactérias (2) bactérias (2) bactérias (1) bactérias (1), fungos (1) bactérias (2), fungos (2) fungos (1) fungos (1) fungos (1) não não não não não não não não não não não não sim sim sim Tabela dos resultados observados nas culturas de caules desinfectados: Frasco Semana 1ª 1 2ª 3ª 1ª 2 2ª 3ª 1ª 3 2ª 3ª 1ª 4 2ª 3ª 1ª 5 2ª 3ª Infecções no meio de cultura (número de focos) Infecções no “explant” (número de "explants"/2) Formação de fenóis não não não não não não não não não não não não não não não Não Não Não Não Não Não Não Não Não Não Não Não Não Não Não não não não não não não não não não não não não não não não 8
  9. 9. Gráficos do número de focos de infecções em cada semana: 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 1ª semana 2ª semana 12 3ª semana 14 10 8 6 5 1 6 4 0 Nº de Focos de Infecções 0 Nº de Focos de Infecções 0 Nº de Focos de Infecções Discussão Podemos observar que as sementes são, entre os “explants” que não vieram de cultura “in vitro”, as que tem menor probabilidade de aparecerem infectadas. Podemos observar também que as folhas e os caules não provenientes de cultura “in vitro” apresentam um grau de infecção muito semelhante. Visivelmente podemos observar que os caules que provieram de cultura “in vitro” não apresentam nenhuma infecção, ao contrário dos caules que não provieram de cultura “in vitro”. Podemos ainda observar que com o tempo as infecções tornam-se mais frequentes. Conclusões Devido ao facto de as sementes possuírem um tegumento que protege o embrião, este está menos sujeito às contaminações e infecções pelo meio externo, apresentando após implantação uma frequência muito menor de contaminações. Ao contrário, as folhas e os caules, como estão expostos à superfície e sem protecção, apresentam maior frequência de infecções quando “in vitro”. 9
  10. 10. Logicamente podemos justificar o facto de os caules provenientes de cultura “in vitro” não apresentarem infecção por terem sido produzidos em ambiente de assépsia, sem contacto com a atmosfera exterior e possíveis fontes de contaminação, ao contrário dos caules não provenientes de cultura “in vitro” que, como estiveram expostos ao exterior durante o seu desenvolvimento, adquiriram microrganismos contaminantes que mais tarde, apesar dos métodos de desinfecção, se propagaram em colónias infectantes. A maior frequência de infecções ao longo do tempo pode ser explicada ou pela propagação das infecções já existentes ou pelo mau manuseamento dos frascos nos momentos de recolha de dados. Pode-se também justificar algumas das infecções existentes pelo mau manuseamento do material e “explants”. Como exemplos podem referir-se: possível infecção do meio de cultura durante a sua preparação; esterilização deficiente do material antes da sua utilização; manuseamento errado do material durante a utilização, levando a nova infecção deste; condições inadequadas de trabalho pelos alunos durante a implantação (trabalhar na extremidade da bancada de fluxo laminar, trabalhar próximo do rosto, não ter cuidados em caso de doença infectante, etc.); deficiente isolamento dos frascos no momento de fecho; mau manuseamento dos frascos e caixas-de-Petri durante a recolha de dados, podendo levar a novas infecções. 10

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