Amplificação de DNA por PCR/ISSRs

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Amplificação de DNA por PCR/ISSRs

  1. 1. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro GENÉTICA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA Amplificação de DNA por PCR/ISSRs Docente: Paula Lopes Discentes: CRISTIANA VALENTE Nº 33708; DAVID RODRIGUES Nº 33714; FRANCISCO PINTO Nº 33707; LUÍS SAMPAIO Nº 33706; PEDRO VEIGA Nº 33698
  2. 2. Índice Introdução ..................................................................................................................................... 3 Objectivos .................................................................................................................................... 4 Resultados ..................................................................................................................................... 4 Discussão ....................................................................................................................................... 7 Conclusão ...................................................................................................................................... 8 Bibliografia .................................................................................................................................... 8 2
  3. 3. Introdução O PCR (reacção em cadeia da polimerase) é uma técnica rápida e simples de amplificação enzimática in vitro de um segmento específico de DNA cerca de 106, sem intervenção de organismos multicelulares. Esta técnica foi desenvolvida nos anos 80 por Mullis, desde então têm-se desenvolvido inúmeras técnicas. O objectivo desta técnica consiste em produzir uma quantidade considerável de um segmento de DNA a partir de uma pequena quantidade. Para realizar esta técnica são necessários os seguintes materiais: uma amostra de DNA, Taq (DNA polimerase), primers (par de oligonucleótidos iniciadores), dNTP’s (desoxirribonucleótidos constituintes de DNA), MgCl2 (cofactor Mg2+, que aumenta a expressão génica), tampão específico da enzima e H20. A amplificação é efectuada por um conjunto de ciclos, neste caso 44, cada ciclo é composto por três etapas: desnaturação (94oC), hibridação – ligação dos primers a sequência iniciadora (50 a 60 oC) e extensão (72oC). No final da ampliação, teremos milhares de cópias de um fragmento de DNA, a amplificação pode ser vista por electroforese em gel de agarose. Vantagens da utilização da técnica de PCR: baixa quantidade de DNA necessário, qualidade do material genético, quantidade de amostra gerada (muito elevada), equipamento e reagentes necessários, simplificação do trabalho, sensibilidade e especificidade (tipo de sequência, temperatura de hibridação e tempo de extensão), tempo de execução (processo rápido) e custo (baixo). Desvantagens desta técnica: é necessário conhecer a sequência dos iniciadores, sensibilidade (contaminação), erros da enzima e adaptação a cada caso. Os ISSRs são marcadores baseados na amplificação de regiões entre microssatélites orientados inversamente e próximos. Os primeiros primers de ISSRs têm repetições de di, tri, tetra e pentanucleótidos. Vantagens do uso de ISSRs: não é necessária a informação da sequência, a variação pode ser encontrada em vários loci simultaneamente, sequência específica de microssatélites e o marcador é fiável principalmente em espécies relacionadas. As desvantagens do ISSRs são poucas, o marcador é dominante e a coloração do gel pode originar bandas ténues. 3
  4. 4. Objectivos     Estudar a variabilidade genética de 10 cultivares de Oliveira (Azeiteira, Blanqueta, Carrasquenha, Cobrançosa, Cordovil, Galega, Madural, Redondal, Redondil, Verdeal); Aplicação da técnica PCR-ISSRs; Visualização e análise de DNA em gel de Agarose; Determinar o peso molecular das amostras por comparação com um marcador (ISSRs). Resultados Figura 1 – Gel do Primer UBC 846 4
  5. 5. Tabela 1 – Matriz do primer UBC 846 Dendograma do primer UBC 846 5
  6. 6. Tabela 2 – Matriz final 6
  7. 7. Compilação dos dendogramas Tabela 3 – polimorfismos dos primers Primer UBC 807 UBC 809 UBC 846 UBC 855 Total Nº de bandas 9 6 10 6 31 Nº de Nº de Monomórficas Polimórficas 1 7 1 3 1 6 3 3 6 19 Nº Bandas únicas 1 2 3 0 6 % Polimorfismo 77,8% 50% 60% 50% Discussão Após análise das bandas do gel de agarose do primer UBC 846, criamos a tabela 1, onde identificamos 10 bandas, sendo 6 bandas polimórficas, isto é, variações nas sequências de DNA, fragmentos específicos de DNA estão presentes em algumas amostras e ausentes em outras; 3 bandas únicas, ou seja, fragmentos de DNA específicos de uma espécie e 1 uma banda monomórfica (banda presente em todas as espécies). Através da definição de banda polimórfica, podemos calcular a percentagem destas através de uma fórmula (% polimorfismo= (nº bandas polimorficas/ nº total de bandas amplificadas)*100). Na tabela 3 aparecem os dados referentes a todos os primers (UBC 807, UBC 809, UBC 846 e UBC 855). O primer UBC 807 apresenta 9 bandas, sendo 1 monomórfica, 7 polimórifcas, 1 banda única e a percentagem de polimorfismo é de 77,8%. O primer UBC 809 apresenta 6 bandas, sendo 1 monomórfica, 3 polimórficas, 2 bandas únicas e 50% de polimorfismo. O primer UBC 855 apresenta 6 bandas, sendo 3 monomórficas, 3 polimórficas, não existem 7
  8. 8. bandas únicas e a percentagem de polimorfismo é de 50%. No total existem 31 bandas, sendo 6 monomórficas, 19 polimórficas e 6 únicas. Nos dendogramas é possível observar as semelhanças entre espécies, a partir das características comuns. A partir do coeficiente de similaridade podemos determinar a percentagem de características comuns (neste caso genes) entre as várias espécies (neste caso cultivares). No dendograma referente ao primer UBC 846 podemos observar que os cultivares azeiteira e cobrançosa, dentro dos genes estudados, são completamente iguais (similaridade = 1), tal como a carrascanha com o redondal. Podemos observar que a galega e a redondil são os cultivares com menos semelhança com os outros cultivares estudados, partilhando apenas 57% dos genes entre si. No dendograma final (compilação dos dendogramas) podemos observar que os cultivares azeiteira e cobrançosa, dentro dos genes estudados, são os mais semelhantes, partilhando 87% dos genes, tal como a blanqueta com o cordovil e a galega com a redondil. Podemos observar que a madural é o cultivar com menos semelhança com os outros cultivares estudados, partilhando apenas 60% dos genes. Conclusão Na técnica de PCR a análise da fotografia do gel de agarose é muito subjectiva, visto que diferentes observadores podem tirar ilações distintas. No entanto, apesar desta falta de precisão é uma técnica muito utilizada como base para técnicas mais rigorosas. Podemos concluir pela análise do dendograma final que a variabilidade genética entre os cultivares estudados é de 40%, uma vez que, a similaridade é de 60%. Podemos concluir também, que quanto mais primers utilizarmos mais informação vamos possuir para identificar as semelhanças entre os cultivares. Podemos afirmar que os objectivos foram cumpridos, pois, conseguimos aplicar a técnica do PCR, visualizamos e analisamos o DNA em gel de agarose, determinamos o peso molecular a partir do peso do marcador e estudamos a variabilidade genética entre os cultivares através do dendograma. Bibliografia - Apontamentos fornecidos pela docente (apontamentos das aulas teóricas e protocolo da actividade; - http://www.e-escola.pt/topico.asp?hid=339 8

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