Micropropação da videira
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Micropropação da videira

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Micropropagação é um termo que foi utilizado pela primeira vez por Hartman e Kester (1975) que passou a ser empregado para definir os processos de propagação vegetativa na cultura de tecidos ...

Micropropagação é um termo que foi utilizado pela primeira vez por Hartman e Kester (1975) que passou a ser empregado para definir os processos de propagação vegetativa na cultura de tecidos vegetais

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Micropropação da videira Document Transcript

  • 1. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro GENÉTICA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA MICROPROPAGAÇÃO DE VIDEIRA Docente: Fernanda Leal Discentes: CRISTIANA VALENTE Nº 33708; DAVID RODRIGUES Nº 33714; FRANCISCO PINTO Nº 33707; LUÍS SAMPAIO Nº 33706; PEDRO VEIGA Nº 33698
  • 2. Índice Introdução ..................................................................................................................................... 3 Aplicações da Micropropagação ............................................................................................... 4 Vantagens da micropropagação................................................................................................ 4 Desvantagens da micropropagação .......................................................................................... 5 Fases da micropropagação ........................................................................................................ 5 Principais classes de hormonas vegetais e suas características................................................ 6 Auxinas .................................................................................................................................. 6 Citoquininas/citocininas ........................................................................................................ 6 Giberelinas ............................................................................................................................ 7 Objectivos do trabalho prático...................................................................................................... 7 Material utilizado .......................................................................................................................... 7 Procedimentos ............................................................................................................................... 8 Cultura da videira ...................................................................................................................... 8 Resultados ..................................................................................................................................... 8 Discussão ..................................................................................................................................... 12 Conclusão .................................................................................................................................... 13 Bibliografia .................................................................................................................................. 14 ANEXO ......................................................................................................................................... 15 2
  • 3. Introdução Micropropagação é um termo que foi utilizado pela primeira vez por Hartman e Kester (1975) que passou a ser empregado para definir os processos de propagação vegetativa na cultura de tecidos vegetais (2). A micropropagação, ou propagação vegetativa in vitro, é uma das aplicações da cultura de tecidos de mais larga utilização. Destina-se principalmente àquelas espécies que são de difícil propagação pelos métodos convencionais, permitindo a obtenção de grande número de plantas sadias e geneticamente uniformes em curto período de tempo (3). Sua aplicabilidade está baseada na teoria da totipotência, a qual estabelece que qualquer parte do vegetal, por menor que seja, tem capacidade de originar uma nova planta, desde que sejam fornecidas as condições adequadas. Com base nesta teoria, pode-se inferir que qualquer espécie vegetal tem a capacidade de ser micropropagada, a partir de qualquer parte da planta. Contudo, na prática, muitas espécies são difíceis de serem micropropagadas e são chamadas de recalcitrantes (3). Para que se criem plantas por micropropagação, é necessário obter uma ou várias células indiferenciadas (células potencialmente mais totipotentes) do parênquima (tecido pouco especializado que forma a parte interior de muitos órgãos) ou um explante da planta-mãe (4). A indução da multiplicação de explants cultivados in vitro dá-se através da interação entre o potencial inerente do explant utilizado e os fitorreguladores. Quando nesta multiplicação ocorre a formação direta de uma ou mais gemas, esta é chamada de organogênese direta. E quando antes da formação de uma nova gema ocorre a formação de calos, esta é chamada de organogênese indireta (3). A pequena quantidade de tecido que forma o explante pode ser tão pequeno como um pequeno conjunto de células, e é colocado num meio de cultura adequado ao seu crescimento, contendo nutrientes e hormonas, nomeadamente sacarose como fonte de energia e hormonas de crescimento. O tecido da planta começa então a crescer, formando uma massa de células indiferenciadas denominada tecido caloso. Este tecido continua a crescer e a diferenciar-se em novos tecidos específicos, 3
  • 4. originando uma planta. Numa fase final, as plantas são transferidas para o solo, ou, mais comummente, para vasos com composto orgânico para um crescimento contínuo através dos métodos convencionais (4). Num sistema comercial de micropropagação, o objetivo é a multiplicação o mais fiel possível do material original (clonagem), para que sejam mantidas as características comerciais deste material. Assim, para a manutenção desta fidelidade, é importante que se evite a organogênese indireta, pois a formação de calii pode dar origem a instabilidades genéticas indesejáveis que virão a se multiplicar durante o processo de micropropagação, vindo a produzir indivíduos com características diferentes do original (3). Aplicações da Micropropagação (5): •Produção de plantas livres de patógenos; •Produção de sementes sintéticas; •Pesquisa básica de fisiologia vegetal; •Produção de metabólitos secundários; •Armazenamento e manejo de germoplasma; •Propagação em massa; •Seleção in vitro; •Aumento da variabilidade genética; •Resgate de embriões imaturos; •Quebra de barreiras de incompatibilidade genéticas; •Clonagem em pequena escala de genótipos especiais; Como todas as técnicas, a micropropagação apresenta vantagens e desvantagens (2). Vantagens da micropropagação  Produz plantas livres de doenças.  Produz plântulas enraizadas prontas para a plantação e crescimento, o que é melhor do que o recurso a sementes e a estacas. 4
  • 5.  Possui uma fecundidade extremamente elevada, pelo que se obtêm milhares de plantas enquanto que através das técnicas convencionais se obtém apenas entre dezenas a centenas de plantas no mesmo período de tempo.  É o único método viável para a regeneração de células genéticamente modificadas e para células resultantes da fusão de protoplastos.  É um bom método de multiplicar plantas que não produzam sementes ou que apenas produzam em quantidades pouco lucrativas.  A micropropagação produz plantas mais resistentes, com um crescimento mais rápido do que as plantas produzidas através de métodos convencionais. Desvantagens da micropropagação  É um processo muito dispendioso e pode ter um custo laboral superior a 70%.  Uma planta infectada pode produzir clones infectados. Isto é incomum, já que as plantas em stock são seleccionadas e vedadas com cuidado para evitar isto.  A maioria das plantas irá naturalmente produzir sementes, que normalmente são livres de doenças e que crescerão rapidamente sob boas condições. O número de semente produzidas varia, mas é normalmente aceitável para a multiplicação e é de graça. Por esta razão, muitos criadores de plantas nunca recorrerão à micropropagação devido ao seu custo proibitivo. Fases da micropropagação 1) Escolha da planta mãe, desinfecção e instalação em cultura do material vegetal; 2) Multiplicação dos explants (rebentos), pelo uso de citoquinina; 3) Alongamento dos rebentos, primeiro individualiza-se os rebentos e coloca-se em meios com auxina; 4) Enreizamento, podendo ser necessário utilizar uma auxina diferente da anterior; 5) Aclimatização, adaptação da plântula às condições do meio exterior (temperatura, humidade e luminosidade). (6) Os explants são colocados em meios de cultura adequados ao seu crescimento, contendo: sais minerais, vitaminas, fontes de ferro e de carbono, reguladores de 5
  • 6. crescimento (hormonas ou reguladores sintéticos) e possivelmente algumas substâncias orgânicas (6). O tecido começa a desenvolver-se e origina uma massa de células indiferenciadas, o tecido caloso. Este continua o seu processo de crescimento e diferenciação dando origem a tecidos especializados e formando uma plântula (6). Na fase final da micropropagação (aclimatização) as plântulas são transferidas normalmente para vasos com composto orgânico ou para o solo. O desenvolvimento da planta é condicionado pela interacção de factores intrínsecos e pela variação das condições ambientais. As plantas são organismos muito organizados quer em forma quer em função, sendo as hormonas os agentes responsáveis pelos processos de crescimento e de organização. Consoante as características químicas e os efeitos que as hormonas exercem sobre as plantas, podemos agrupa-las em classes. Principais classes de hormonas vegetais e suas características Auxinas – são compostos que conduzem ao alongamento celular, são sintetizadas nos meristemas apicais caulinares, nos primórdios foliares, nas folhas jovens, e nas sementes em desenvolvimento e conseguem espalhar-se por toda a planta. Esta hormona modifica a permeabilidade da membrana plasmática e promove a formação de tecido caloso. Quando presente em doses excessivas a auxina inibe a formação de raízes, considerando-se assim a raiz mais sensível à auxina que o tecido do caule. Em doses extremamente elevadas a auxina pode estimular a síntese de etileno e causar efeitos negativos no crescimento do tecido ou mesmo a sua morte (9). Citoquininas/citocininas – as citoquininas são as hormonas vegetais responsáveis pela divisão celular. Estas são produzidas em qualquer tecido vegetal, mas é nas raízes que a sua produção se destaca. As citoquininas só actuam em conjunto com as auxinas. São responsáveis pela diferenciação celular, e por isso, tem um papel fundamental na organogénese. Esta hormona inibe a senescência (envelhecimento) (10 e 11). 6
  • 7. Giberelinas – são produzidas nas folhas, nos embriões, nos frutos e nas sementes. Promovem a germinação de sementes, uma vez que, interrompem o seu período de latência. Estas promovem o crescimento vegetativo das plantas, aceleram a distensão celular, e ainda, actuam no alongamento entre os nós. As giberelinas não são produzidas por plantas anãs (12). A micropropagação da videira esta numa fase experimental e desempenha um papel importante na multiplicação rápida deste material, permitindo assim, uma grande disponibilidade de material vegetativo com qualidade. A micropropagação é muito importante na reestruturação vinhas velhas (7). Objectivos do trabalho prático - Estudar o efeito da composição dos diferentes meios de cultura na cultura in vitro da videira. Para tal, utilizam-se cinco meios de cultura: o meio de Murashige e Skoog junto com 1 e 2 mg/l de BAP e com 1 e 2 mg/i de IBA (7). Material utilizado   Microestacas a um gomo de Vitis sp. já desinfectadas; Folhas com pecíolo de Saintpaulia ionantha já desinfectadas;  Frascos de meio de cultura:  M.S.  M.S. + 1 mg/l de BAP  M.S. + 2 mg/l de BAP  M.S. + 1 mg/l de IBA  M.S. + 2 mg/l de IBA  Pinças e bisturis;  Material de vidro diverso;  Papel esterilizado;  Folha de registos. 7
  • 8. Procedimentos O trabalho prático foi realizado na câmara de fluxo laminar, em condições de assepsia. Antes de iniciar o trabalho, embebemos algodão em álcool a 70% e limpamos a bancada, fazendo movimentos paralelos, sem passar com algodão duas vezes no mesmo local. Arregaçamos as mangas e retiramos qualquer objecto que tínhamos nas mãos ou pulsos, tais como, pulseiras e anéis, e de seguida desinfectamos as mãos com álcool. Antes de utilizarmos o material, este foi passado por álcool a 95% e flamejado. Todo o material vegetal foi manuseado junto à lamparina, e após colocar os explants no meio de cultura e antes de fechar os frascos, abertura do frasco foi passada pela chama. Cultura da videira 1) Retiramos uma folha de papel esterilizado; 2) Retiramos do goblet um rebento, o qual foi previamente sujeito a um tratamento de desinfecção: 3) Retiramos os tecidos queimados a seccionar e seccionamos o rebento em microestacas de um gomo com o auxílio de pinça e bisturi; 4) Inoculamos duas microestacas no frasco, enterrando-as cerca de 0,5 cm. Tapamos o frasco com papel de alumínio e selar com parafilm; 5) Rotulamos os frascos com o meio de cultura e material vegetal utilizado, grupo, curso e data da cultura; 6) Repetimos estas operações para inocular as microestacas no segundo frasco; 7) Colocamos todos os frascos na câmara de crescimento à temperatura de 25ºC com um fotoperíodo de 16 horas. Nas seis semanas seguintes após a colocação dos explants em cultura, observamos semanalmente o material, tendo em conta alguns parâmetros que caracterizaram o seu desenvolvimento e crescimento, tais como, número de raízes por explant, comprimento de raízes, número de rebentos e comprimento dos rebentos. Resultados Em anexo encontram-se as tabelas com os resultados a partir dos quais foram feitos os seguintes gráficos . 8
  • 9. 4 3,5 3 2,5 2 ! 1,5 1 0,5 0 MS MS+1BAP MS+1BAP+0,2NAA 1ª semana 2ª semana MS+2BAP MS+2BAP+0,2NAA 3ª semana Figura 1 – Número médio de rebentos 80 70 60 50 40 ! 30 20 10 0 MS MS+1BAP MS+1BAP+0,2NAA 1ª semana 2ª semana MS+2BAP MS+2BAP+0,2NAA 3ª semana Figura 2 - Comprimento total médio dos rebentos (mm). 9
  • 10. 4 3,5 3 2,5 2 ! 1,5 1 0,5 0 MS MS+1BAP MS+1BAP+0,2NAA 1ª semana 2ª semana MS+2BAP MS+2BAP+0,2NAA 3ª semana Figura 3 - Número médio de entrenós no rebento principal. 10 9 8 7 6 5 ! 4 3 2 1 0 MS MS+1BAP 1ª semana MS+1BAP+0,2NAA 2ª semana MS+2BAP MS+2BAP+0,2NAA 3ª semana Figura 4 - Total médio de entrenós. 10
  • 11. 9 8 7 6 5 4 ! 3 2 1 0 MS MS+1BAP MS+1BAP+0,2NAA 1ª semana 2ª semana MS+2BAP MS+2BAP+0,2NAA 3ª semana Figura 5 - Número médio de raízes. 120 100 80 60 ! 40 20 0 MS MS+1BAP MS+1BAP+0,2NAA 1ª semana 2ª semana MS+2BAP MS+2BAP+0,2NAA 3ª semana Figura 6 - Comprimento médio das raízes 11
  • 12. 14 12 10 8 6 ! 4 2 0 MS MS+1BAP 1ª semana MS+1BAP+0,2NAA 2ª semana MS+2BAP MS+2BAP+0,2NAA 3ª semana Figura 7 - Diâmetro total médio de calli (mm). Discussão Podemos observar que os meios que possuem BAP (citoquinina) mas não NAA (auxina) desenvolvem mais rebentos, seguindo-se os meios que têm BAP e NAA. Podese também verificar que os que tem 2 miligramas de BAP desenvolvem menos rebentos que os que tem apenas 1 miligrama de BAP. Podemos observar que é nos meios com BAP e sem NAA que os rebentos atingem comprimentos mais longos e é nos meios com NAA que atingem comprimentos menores. Pode-se também verificar que nos meios com dois miligramas de BAP os rebentos atingem comprimentos inferiores do que nos meios com um miligrama de BAP. Podemos observar, mas com pouca diferença, que os meios que possuem dois miligramas de BAP e NAA são os que proporcionaram um maior desenvolvimento no número de entrenós no rebento principal. Nos outros meios o desenvolvimento é pouco diferenciado. Podemos observar que os meios com BAP e sem NAA são os que permitem um desenvolvimento superior de entrenós em termos de número e os que tem NAA são os seguintes. 12
  • 13. Podemos observar que os meios com um miligrama de BAP e NAA são aqueles que permitem um maior desenvolvimento do número de raízes e que os com um miligrama de BAP e sem NAA não apresentaram desenvolvimento. Podemos também verificar que os meios que tinham dois miligramas de BAP apresentaram algum desenvolvimento, mas muito inferior ao de um miligrama de BAP e NAA e ainda assim inferior ao meio com apenas MS. Podemos observar que os meios com um miligrama de BAP e NAA são aqueles que permitem um maior desenvolvimento das raizes em termos de comprimento, muito semelhante, mas ainda assim superior ao observado no meio com apenas MS. Podemos verificar que os meios com dois miligramas de BAP apresentaram um desenvolvimento muito reduzido e semelhante e que os meios com apenas um miligrama de BAP não apresentaram desenvolvimento. Podemos observar que os meios apenas com BAP não apresentaram desenvolvimento de calli e que os meios com BAP e NAA apresentaram um grande desenvolvimento deste. Podemos também observar que os meios apenas com MS apresentaram algum desenvolvimento de calli. Conclusão A partir dos resultados observados sobre o desenvolvimento de rebentos podemos concluir que o BAP o promove em número e comprimento, mas que quando em miligramas demasiado elevadas começa a inibir o crescimento. Podemos também concluir que o NAA tem efeitos de inibidor do desenvolvimento dos rebentos quando adicionado a um meio com BAP, podendo levar a um desenvolvimento inferior do que quando há uma total ausência de hormonas. A partir dos resultados observados sobre o desenvolvimento de entrenós podemos concluir que a presença de BAP favorece o seu desenvolvimento, não havendo uma distinção acentuada se se adicionou apenas um miligrama ou duas. Podemos também concluir que o NAA tem efeitos de inibidor no desenvolvimento de rebentos quando presente nos meios com BAP. Quanto ao desenvolvimento de entrenós apenas no rebento principal não podemos tirar conclusões seguras porque os resultados são muito semelhantes em todos os meios. 13
  • 14. A partir dos dados observados sobre o desenvolvimento das raízes podemos concluir que o BAP é um inibidor do desenvolvimento de raizes, não permitindo o seu desenvolvimento quando apenas em um miligrama. Apresenta no entanto algum desenvolvimento, muito reduzido, quando presentes dois miligramas desta hormona, provavelmente porque esta se inibe a si mesma quando em quantidades exageradas. Dado o vigoroso desenvolvimento das raizes quando presente NAA, especificamente no meio com apenas um miligrama de BAP, podemos concluir que esta hormona promove fortemente a rizogénese, excepto quando presentes dois miligramas de BAP. A partir dos dados observados sobre o desenvolvimento do calli podemos concluir que o BAP é um inibidor deste, pois não apresenta desenvolvimento quando este está presente, excepto quando está presente NAA, sendo portanto este um indutor. Podemos assim concluir que meios de cultura com diferentes hormonas têm diferentes efeitos no desenvolvimento dos explants. Bibliografia 12345678910111213- Foto da capa: http://portugues.torange.biz/download/5269.html?hard=1&photo=1; http://pt.wikipedia.org/wiki/Micropropaga%C3%A7%C3%A3o http://pt.scribd.com/doc/53049823/21/Micropropagacao http://osverdocas.wordpress.com/micropropagacao-vegetativa-2/ http://pt.scribd.com/doc/28390758/MICROPROPAGACAO-Propagacao-Vegetativa-inVitro; Apontamentos das aulas Protocolo http://www.cultivando.com.br/termos_tecnicas_multiplicando_micropropagacao.htm l http://pt.wikipedia.org/wiki/Auxina http://pt.wikipedia.org/wiki/Citocinina http://www.mundoeducacao.com.br/biologia/citocininas.htm http://www.mundoeducacao.com.br/biologia/giberelinas.htm http://br.monografias.com/trabalhos/estabelecimento-in-vitro-portaenxertos/estabelecimento-in-vitro-porta-enxertos.shtml 14
  • 15. ANEXO 15