Guia tp enfermeria 2011
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Guia tp enfermeria 2011 Guia tp enfermeria 2011 Document Transcript

  • Andrés Bello UniversidadFacultad Ciencias BiológicasDepartamento de Ciencias BiológicasLaboratorio de Microbiología GUIA DE TRABAJOS PRÁCTICOS MICROBIOLOGÍA BIO 050 CARRERA: ENFERMERÍA
  • 2 TRABAJO PRÁCTICO N°1 PROCEDIMIENTOS BÁSICOSNORMAS DE BIOSEGURIDAD EN LOS TRABAJOS PRÁCTICOS DEMICROBIOLOGÍADurante el desarrollo de las actividades prácticas se debe mantener una serie de normas,cuyo propósito fundamental es la preservación de la salud del alumno, sus familias y lacomunidad.1. Cada alumno debe usar delantal blanco abrochado para evitar la contaminación de susropas.2. Al comenzar y al terminar las actividades, cada alumno debe lavarse las manos.3. El alumno debe ingresar al laboratorio con el pelo tomado.4. Está estrictamente prohibido comer, beber, comer, fumar, masticar chicle, o llevarsecualquier objeto a la boca, por el riesgo de contagio.5. No ingresar bolsos o chaquetas a la sala de trabajos prácticos.6. Las asas de platino deben ser esterilizadas antes y después de su uso. Al enfriarla, evitesalpicar, los aerosoles son muy contagiosos.7. Toda pipeta Pasteur utilizada debe ser sellada y desechada en las cajas de materialcortopunzante.8. Las placas de Petri sólo deben abrirse en el momento de siembra y a una distancia menora los 30cm del mechero Bunsen encendido.9. Los tubos deben flamearse antes y después de ser utilizados.10. Frente al derrame de un medio de cultivo o muestra debe informar al profesor, estotambién se recomienda frente a cualquier accidente como quemaduras, cortaduras o contactocon material contaminado.
  • 311. Es de primordial importancia el cuidado del microscopio. Éste sólo debe encenderse almomento de la observación de la preparación. La que debe retirarse terminada laobservación, para limpiar el lente de inmersión con Xilol y papel tissue.12. Las superficies de trabajo deben ser descontaminadas antes y después de realizado eltrabajo prácticoEl estudio de bacterias, virus, parásitos y hongos potencialmente patógenos para el hombre,animales u otros seres vivos, involucra riesgos dependientes del agente infecciosos y losprocedimientos empleados. Las normas de bioseguridad buscan reducir a un nivel aceptableel riesgo asociado a su manipulación. Deben considerarse para lograr que el personal quemanipula estos agentes infecciosos en el ámbito hospitalario esten mínimamente expuestas aadquirir una enfermedad infecciosa o de otro tipo.BIOSEGURIDAD: corresponde al conjunto de medidas protectivas, destinadas a protegerla salud de las personas frente a los posibles riesgos asociados a los agentes biológicos,físicos o químicos en el laboratorio, como también indirectamente al ambiente.AGENTE INFECCIOSO: todo microorganismo, incluidos los genéticamente modificados,presentes en forma latente y los portados por el personal de salud, capaces de originarcualquier infección, alergia o toxicidad.CONTROL DE LA CONTAMINACIÓN EN EL LABORATORIOEl laboratorio tiene importancia central en el diagnóstico etiológico, de modo que resultafundamental evitar la contaminación de las muestras, ya sea desde el operador como desdelas otras muestras (contaminación cruzada).Con este fin, se debe trabajar con TÉCNICA ASÉPTICA y utilizando material ESTÉRIL.Algunos conceptos que debemos conocer y manejar son:DESINFECCIÓN: proceso que busca eliminar la mayoría de los microorganismospatógenos, excepto esporas y algunos virus, en objetos inanimados.
  • 4ASEPSIA: proceso que utiliza agentes químicos para impedir infección de piel, mucosas uotros tejidos en seres vivos. Los antisépticos actúan provocando muerte de losmicroorganismos patógenos o impidiendo su multiplicación.SANITIZACIÓN O HIGIENIZACIÓN: Proceso que utiliza lavado mecánico o agentesquímicos para REDUCIR el número de patógenos presentes en un objeto hasta nivelesaceptables para la salud pública.ESTERILIZACIÓN: proceso físico o químico destinado a destruir TODA vida microbiana,incluyendo esporas, en materiales u objetos inanimados.TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN1.- Métodos Físicosa) CalorEs el método más usado, económico y fácil de controlar. Proceso rápido al cual la totalidadde los microorganismos resulta sensible.Pasteurización: uso para prevenir infecciones asociadas a productos lácteos (Tuberculosis,Brucelosis, Salmonelosis) y retrasar descomposición de la leche.Autoclave (vapor saturado a presión): Entre los métodos de esterilización, es el más efectivoy de menor costo; es el método de elección para instrumental médico de uso repetido.Llama y flameado: utilizado para esterilizar asas de siembra en el laboratorio. A través delflameado se evita la contaminación de tubos y matraces., al someterlos directamente a lallama.b) RadiacionesRayos ultravioleta (U.V): lesionan el DNA bacteriano, inhibiendo la correcta replicacióndel DNA durante la replicación celular.
  • 5Se usa principalmente en ambientes de quirófanos, sala de prematuros, esterilización desuperficies.Radiaciones ionizantes: los rayos gamma principalmente, son utilizados para esterilizaciónen frío de materiales desechables como: jeringas, bisturís, catéteres, prótesis, guantes decirugía y equipos de transfusión.2.- Métodos MecánicosOndas sónicas y ultrasónicas: afectan el metabolismo bacteriano, produciendodesnaturalización de proteínas y muerte celular.Filtración: usado en el control de microorganismos presentes en sustancias líquidas o gases,mediante su paso a través de sustancias porosas denominadas filtros. Su utilidad principal esla esterilización de sueros o líquidos que contengan proteínas o metabolitos termolábiles.3.- Métodos Químicos (antisépticos y desinfectantes)La penetración de estos agentes es más rápida en bacterias Gram positivas, debidoprincipalmente a la presencia protectora de la membrana externa en las bacterias Gramnegativas.Los agentes químicos pueden causar ocasionalmente infecciones nosocomiales alencontrarse contaminados con bacterias, siendo el género Pseudomonas el más habitual.Esto es de suma importancia y para evitarlo es imprescindible que el personal de saludcuente con un acabado conocimiento del tema.
  • 6 El siguiente cuadro resume los principales agentes químicos y su utilidadAGENTE ACCIÓN APLICACIÓNAlcoholes 70% Sobre formas vegetetivas Piel y superficies inertes (no esporas). Desnaturaliza proteínasCloro Bactericida. Actúa oxidando Útiles de cocina, chatas, grupos sulfhidrilos libres patos, baños, unidades de diálisisYodo/povidona yodada Bactericida. Actúa sobre formas Piel heridas, material vegetativas y esporas, hongos y quirúrgico algunos virus. Interfiere procesos de oxido – reducción y fosforilación bacterianos.TÉCNICAS BÁSICAS DE MICROBIOLOGÍAEl objetivo principal del práctico es la adquisición de conocimientos básicos en lo querespecta a la manipulación de cultivos bacterianos. Esto incluye manejo del concepto deesterilidad, siembra en medios líquidos, en medios sólidos (diferenciales, selectivos, etc) ysiembra en condiciones anaeróbicas.El cumplimiento de las tareas en microbiología clínica exige la realización de tresactividades: la primera de ellas, aislamiento e identificación de microorganismos, se iniciacon el cultivo de las muestras de distinto origen, en medios específicos y en condicionesdefinidas, y va seguido de examen microscópico y pruebas bioquímicas al microorganismoaislado; la segunda actividad, involucra el conocimiento de la resistencia o sensibilidad aantibióticos, biotipificación y serotipificación; y por último, la tercera actividad involucra laidentificación epidemiológica o comparación de los aislamientos de la misma especie con elfin de hacer el control de la infección o análisis de población.Para poder realizar la primera de estas actividades, es imprescindible contar con un cultivopuro que debe ser mantenido en condiciones de laboratorio, para esto es necesario eindispensable emplear material completamente estéril (Tabla Nº 1).Para poder mantener las bacterias en condiciones de laboratorio se utiliza otro procedimientoimportante en el área de la microbiología que es la siembra o cultivo. Esta consiste en
  • 7colocar a los microorganismos en un ambiente adecuado para que se desarrollen ymultipliquen. En el laboratorio este medio ambiente lo constituyen los medios de cultivocorrientes o básicos y especiales, operación que debe realizarse en forma aséptica.Generalmente las muestras contienen una flora mixta, que se manifiesta por el desarrollo dedistintas especies bacterianas: algunas son saprófitas (flora normal) o contaminantes delproceso de muestreo y otras son las que tienen un rol patógeno.Obtener una cepa bacteriana aislada significa, por lo tanto, obtener un cultivo en estado depureza, condición indispensable para poder estudiar sus características morfológicas ybioquímicas y lograr así su identificación correcta.Si en la placa de agar ha crecido más de un tipo de bacterias, se debe realizar el aislamientode UNA colonia a otro medio de cultivo semejante o a medios selectivos.En el caso de los medios líquidos, una vez obtenido el crecimiento bacteriano, se deberealizar un aislamiento de UNA gota o UNA asada del cultivo a un medio sólido paraobtener colonias aisladas y puras (Tabla Nº 2).Si fuese necesario las colonias se someterán a uno o más re-aislamientos, hasta obtenercultivos puros, es decir que todas las colonias sean similares, presenten la misma morfologíay microscópicamente correspondan a un solo tipo de bacteria.Sólo en este momento se puede proceder a la identificación de la especie bacterianamediante el traspaso de UNA sola colonia a una batería de medios de identificación.MORFOLOGÍA BACTERIANA: ANÁLISIS MACROSCÓPICOUna etapa importante y básica en el estudio de las características de una bacteria, es laobservación de su morfología. Como consecuencia del pequeño tamaño que presentan no esposible distinguirlas a simple vista y, debido a esto es que tenemos que estudiar poblacionesbacterianas, llamadas colonias. Para obtener estas colonias es necesario proporcionarles a lasbacterias los requerimientos necesarios de materia orgánica, iones inorgánicos y factores decrecimientos entre otros a través de un medio de cultivo. Cada colonia corresponde en suorigen a una sola bacteria que se ha multiplicado y desarrollado en un medio de cultivosólido, hasta formar una población que se represente como una colonia visible. Por lo tantouna colonia esta formada por millones de bacterias.
  • 8El crecimiento de las bacterias en medios líquidos, no da origen a la formación de colonias.El desarrollo se evidencia mediante la turbidez del caldo, sedimento y otras características.Cabe destacar que la morfología macroscópica de las colonias (análisis macroscópico)permite un acercamiento en la identificación de los géneros bacterianos que poseencaracterísticas propias de desarrollo de sus colonias, según su forma, elevación, margen,superficie, brillo, color y hemólisis (en agar sangre). Muchas especies bacterianas presentan colonias que son muy parecidas lo que haceimposible diferenciarlas solo con la observación macroscópica de estas por lo que se hacenecesario además una observación microscópica de las células que conforman estas colonias. Esto datos proporcionan una orientación sobre las pruebas bioquímicas para laidentificación definitiva de las colonias. En la siguiente figura se observan algunas características macroscópicas de coloniasbacterianas, frecuentemente utilizadas para la descripción de una bacteria o microorganismo. Figura Nº 1: Criterios macroscópicos para la descripción de una colonia bacteriana.
  • 9de uso común en el Laboratorio de Tabla Nº 1 : Material Microbiología EsterilizaciónMaterial Tipo esterilización Tipo de material Antes de ser utilizada Después de ser utilizadaAsa de platino Directo a la llama del mechero Sí Sí Re-utilizablePipetas aforadas de vidrio* Directo a la llama del mechero Sí Sí Re-utilizablePipetas aforadas de plástico Química No No DesechablePipetas Pasteur de vidrio* Autoclave No Si Desechable AutoclaveTubos estériles** Si Si Re-utilizable Llama MecheroPlacas Petri de vidrio Autoclave Si Si Re-utilizablePuntas de Papel Absorbente Autoclave No No DesechablePlacas Petri de plástico Química No Si Desechable* Este material se pueden encontrar en cilindros metálicos o envueltas en papel, ya estériles. En el primer caso, se debe poner el cilindro en forma horizontal, destaparloy sacar una pipeta sin tocar con los dedos las otras, en el segundo caso se debe desenvolver la pipeta, de manera de no tocar su extremo inferior.** Cada vez que se destape un tubo estéril, se debe flamear su boca y repetir la operación inmediatamente antes de volver a cerrarlo. Este procedimiento pretende evitarla entrada de microorganismos del aire al interior del tubo.
  • ACTIVIDADES PRÁCTICAS1. De medios Sólidos a medios Sólidos. 1.1. Desde placa Petri a tubo con Agar tendido: a. Rotular el tubo de agar con los datos correspondientes (Nombre del microorganismo, Grupo y Fecha). b. Flamear el asa para su esterilización. c. En la placa Petri con la muestra, enfriar el asa en las zonas del agar donde no existan colonias. d. Tomar una muestra con el asa desde el medio sólido con la bacteria en estudio (Con solo tocar la colonia estará tomando la cantidad de bacteria suficiente para poder sembrar). e. Destapar el tubo con agar tendido y flamear la boca del tubo. f. Introducir el asa hasta el fondo. Posteriormente, en un sólo movimiento, deslizar el asa con movimientos en zig-zag ascendentes por la superficie del medio de cultivo. g. Flamear y tapar la boca del tubo. h. Flamear el asa para su esterilización. i. Incubar el tubo recién sembrado a la temperatura adecuada. A B C D Figura Nº 1: Siembra desde agar en placa Petri a Tubo con agar tendido.
  • 112. De medios Sólidos a medios Líquidos. 2.1. Desde placa Petri a tubo con medio de cultivo líquido: a. Rotular el tubo de caldo con los datos correspondientes (Nombre microorganismo, Grupo, Fecha). b. Flamear el asa para su esterilización. c. Enfriar el asa en las zonas del agar donde no existan colonias. d. Tomar una muestra con el asa desde el medio sólido con la bacteria en estudio (Con solo tocar la colonia estará tomando la cantidad de bacteria suficiente para poder sembrar). e. Flamear la boca del tubo con medio líquido. f. Introducir el asa dentro del tubo con caldo y agitar vigorosamente. g. Flamear la boca del tubo y el asa para su esterilización. h. Tapar el tubo e incubar a la temperatura adecuada. A B C D 18 – 24 Hrs. Figura Nº 2: Siembra desde agar en placa Petri a Tubo con caldo de cultivo.
  • 123. De medios Líquidos a medios Sólidos 3.1. Desde tubo con cultivo bacteriano líquido a placas de Petri: a. Rotular la placa en el reverso (por donde se encuentra el agar) con los datos correspondientes. b. Flamear el asa para su esterilización (hasta que se ponga rojo). c. En la placa Petri con la muestra, enfriar el asa en las zonas del agar donde no existan colonias. d. Destapar el tubo que contiene el cultivo bacteriano, flamear la boca del tubo e introducir el asa hasta el fondo. Posteriormente, agitar suavemente el asa y retirarla. e. Flamear y tapar la boca del tubo. f. Colocar la tapa de la placa sobre el mesón cerca del mechero. g. Tomar la placa por su base y realizar la siembra mediante estrías, para ello: i. Deslizar el asa con la muestra en forma de zig – zag en un pequeño sector de la placa. Flamear el asa. ii. A partir del sector ya sembrado en la placa, deslizar el asa hacia el sector contrario de la placa nuevamente en forma de zig – zag. Flamear el asa. iii. A partir de las últimas líneas realizadas, deslizar el asa hacia el sector contrario de la placa en forma de zig-zag. Flamear el asa. iv. Repetir el procedimiento descrito en iii.) hasta completar la placa. Tener cuidado de que cuando se hacen las estrías en ii.) y iii.) no tocar las que ya se encuentran en la placa. h. Tapar la placa y flamear el asa para su esterilización. i. Incubar la placa a la temperatura adecuada. A B C D 18 – 24 Hrs. Figura Nº 3: Siembra desde cultivo bacteriano líquido a agar en placa Petri.
  • 134. Técnicas de esterilización 4.1. Flameado a. Dividir una placa por la mitad. b. Tomar un asa y abrir una placa de agar nutritivo y deslizarla suavemente por una mitad del agar. Cerrar la placa. c. Flamear el asa para su esterilización, enfríela en la tapa y deslícela suavemente por la otra mitad del agar. d. Cerrar la placa. e. Incubar la placa a 37ºC.5. Desinfección y Asepsia 5.1. Cloro a. Dividir una placa de agar nutritivo en dos. b. Tomar una tórula estéril y humedecerla en suero fisiológico. c. Deslizarla rápidamente por un sector del mesón de trabajo, alejado del mechero (más de 30 cm). d. Deslizarla suavemente sobre una mitad del agar nutritivo (Zig-Zag). e. Humedecer la misma tórula con la solución de cloro, espere tres minutos. f. Ahora pasar la tórula por la otra mitad del agar (Zig-Zag). g. Incubar la placa a 37ºC por 24hr. 5.2.Yodo a. Dividir una placa en dos, por una mitad deslizar suavemente uno de sus dedos por el agar. b. Tome un trozo de algodón con yodo y aplíquelo en el dedo que utilizó, espere unos segundos. c. Pasar el dedo suavemente por la otra mitad de la placa. d. Incubar la placa a 37ºC. 5.3.Alcohol a. Repita los pasos realizados para la actividad del cloro. b. Escoja otro lugar del laboratorio de amplia exposición. c. Incubar la placa a 37ºC.
  • 14ACTIVIDADES PRÁCTICAS (Continuación)OBJETIVOS1. Comparar colonias bacterianas desarrolladas en distintos medios de cultivo sólido (Placas de Agar).2. Describir colonias de acuerdo a criterios macroscópicos.3. Practicar preparación de frotis bacterianos y el uso correcto del microscopio.En la siguiente sesión de trabajo práctico Ud. debe:1. Observar y describir las colonias desarrolladas en la placa de agar, considerando lossiguientes aspectos: forma, borde, elevación, superficie, características físicas (textura,color y brillo).2. Observar el crecimiento bacteriano en los medios de cultivo líquidos y sólidossembrados en la primera sesión. Describa lo observado.3. Observar las placas de agar sometidas a los procesos de: esterilización, desinfección yasepsia. Describa lo observado en ambas mitades del agar.4. Realizar análisis de morfología microscópica4.1 Preparación de frotis bacteriano a partir de una colonia.a. Colocar con el asa una gota de agua en el centro de la lámina (del tamaño de unaarveja).b. Flamear el asa para su esterilización.c. Enfriar el asa en un sector del agar donde no exista crecimiento bacteriano.d. Obtener una pequeña muestra desde la placa.e. Mezclar la muestra con la gota de agua y esparcirla por la superficie del portaobjeto,suavemente, formando una capa delgada.f. Fijar el frotis exponiéndolo a la llama del mechero hasta que se seque.4.2 Tinción simplea. Cubrir un frotis bacteriano con Azul de Metileno al 1%b. Dejar reposar 2 minutos para permitir la difusión del colorante
  • 15c. Lavar suavemente con agua.d. Secar con papel absorbentee. Observar al microscopio con aumento de 100X oilf. Describa lo que observa: forma, agrupación, color.MICROSCOPIO OPTICO: • Sistema óptico o OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Amplía la imagen del objetivo. o OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparación. Amplía la imagen de ésta. o CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación. o DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador. o FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador. • Sistema mecánico o SOPORTE: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo. o PLATINA: Lugar donde se deposita la preparación. o CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular o binocular. o REVÓLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos. o TORNILLOS DE ENFOQUE: Macrométrico que aproxima el enfoque y micrométrico que consigue el enfoque correcto.
  • 16USO CORRECTO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO CON ACEITE DEINMERSIÓN1. Colocar la preparación sobre la platina del microscopio2. Verificar que el condensador esté arriba y el diafragma abierto, ya que el objetivo deinmersión requiere mucha más luz que los objetivos secos.3. Enfocar primero con los objetivos secos en orden creciente (4x, 10x, 40x), eligiendo lazona de interés.4. Colocar el revólver a mitad de camino, entre el objetivo 40x y el de inmersión 100x(línea negra) EVITE CUALQUIER CONTACTO DE LOS OBJETIVOS SECOS CON EL ACEITE DE INMERSIÓN.5. Colocar una gota de aceite de inmersión sobre la preparación6. Cuidadosamente colocar el objetivo 100x en contacto con el aceite, el objetivo deberáestar prácticamente tocando el portaobjetos, y el aceite deberá ocupar este pequeñoespacio7. Observe con los oculares, y ajuste el foco utilizando sólo el micrométrico8. Una vez terminada la observación microscópica, LIMPIAR CUIDADOSAMENTEEL OBJETIVO, RETIRANDO EL ACEITE CON UN PAPEL LIMPIALENTES(PAPEL SUAVE) IMPREGNADO EN XILOL.9.- Una vez terminado el trabajo práctico su microscopio debe quedar limpio y apagado,con la platina abajo y el revólver puesto con el objetivo menor (4x)
  • 17TRABAJO PRÁCTICO N°2MORFOLOGÍA BACTERIANAMEDIOS DE CULTIVOUn medio de cultivo es una preparación sólida o líquida hecha específicamente para elcrecimiento, almacenamiento o transporte de bacterias. Los medios líquidos pueden serusados en tubos de ensayo o en botellas de vidrio. Los medios sólidos se obtienen de unasolución de nutrientes solidificada con agar (polisacárido obtenido de ciertas algasmarinas que actúa como agente gelificante) o gelatina y se usan en placas de Petri. Elagar es el agente gelificante más comúnmente usado ya que no es atacado por la mayoríade las bacterias y no se funde a 37ºC (Tº usada para la incubación de las bacterias).Los componentes esenciales, cualquiera sea el medio de cultivo y la variedad demicroorganismos que se desea cultivar, son: agua, componentes nitrogenados (proteínas,aminoácidos y/o sales inorgánicas que contengan nitrógeno) y fuentes de energía(carbohidratos, proteínas o sales inorgánicas).Algunos Medios de cultivo muy utilizados en clínica:- Agar nutriente (corriente): Es un medio básico usado con propósitos generales para elcultivo de muchos tipos de bacterias. Puede enriquecerse o hacerse selectivo por laadición de sustancias adecuadas.- Agar sangre: Es un medio en base a agar nutriente enriquecido con 5-10% de sangre.Es usado para el cultivo de bacterias nutricionalmente exigentes, como Bordetellapertussis (agente causal de tos convulsiva) y también para detectar hemólisis. Al calentarel agar sangre a 70-80ºC hasta obtener un color café se obtiene otro medio de cultivodenominado agar chocolate, que es más apropiado que el agar sangre para el creciminetode ciertos patógenos, como por ejemplo Neisseria gonorrhoeae.- Agar McConkey: Es un medio selectivo y diferencial, ya que contiene sales biliares ycristal violeta para inhibir el crecimiento de Gram + (selectivo) y lactosa para distinguiraquellas bacterias que la fermentan de las que no (diferencial). En agar McConkey las
  • 18bacterias entéricas que utilizan lactosa (tales como E. coli) forman colonias rojas debido aque los productos acídicos que se forman a partir de lactosa afectan el indicador de pHdel medio (rojo neutro); en cambio, las especies entéricas que no usan lactosa (porejemplo muchas cepas de Salmonella) forman colonias incoloras.Clasificación de los medios de cultivo1.- Según estado físico:a. Sólidos (solidificados por adición de agar al medio líquido o de alguna proteínacoagulada).b. Líquidosc. Semisólidos2.- Según contenido nutricional:a. Corrientes: bajo contenido nutricio (ej.: caldo de carne, agar, gelatina).b. Mejorados (o enriquecidos): por adición al medio corriente de: sangre, proteínas,hidratos de carbono, extracto de órganos o levadura.c. Sintéticos y mínimos: Los primeros son medios de fórmula perfectamente conocida,en la cual se emplean concentraciones exactas de sus componentes. Obedecen apropósitos bien definidos. Los segundos son también sintéticos, pero a su fórmula que nopermite el crecimiento bacteriano se le adiciona uno o dos sustratos o elementos, sobrelos cuales se desea conocer la actividad de una bacteria en estudio, sin interferencia deotro elemento. Al adicionar el sustrato, la bacteria crecerá sólo si esa sustancia esutilizada.3.- Según su empleo con propósitos de diagnóstico o taxonómicos.a. Selectivos: Son aquéllos que permiten, a la vez que evitan o retardan, el crecimiento deotros microorganismos. La selección se efectúa mediante el control de los ingredientesdel medio. ej.: cristal violeta es selectivamente bacteriostático para las bacterias Grampositivas, por lo tanto este colorante puede ser incorporado a un medio para examinar
  • 19patógenos entéricos que son predominantemente bacilos Gram negativos. ej.: Agar sangrecon azida de sodio, agar Petragnani.b. Diferenciales: Son medios nutricios que contienen un sustrato y un indicador de pHque permiten apreciar si fue o no metabolizado este compuesto, lo cual permite con unconjunto de pruebas de este tipo clasificar una bacteria, es lo que se llama "Taxonomíasobre base de pruebas bioquímicas".Muchos de estos medios sólidos diferenciales contienen uno o más hidratos de carbonofermentables y un indicador adecuado para la determinación de la producción de ácidos ocompuestos alcalinos. ej.: citrato (Simmons), agar triple azúcar hierro (TSI). Los cambiosproducidos en el medio por un organismo o grupo de organismos son característicos,diferenciándolos de este modo de otras cepas o grupos. Los medios diferencialespermiten identificar reacciones de fermentación de los cultivos puros de bacterias o sucapacidad para utilizar productos nutritivos. ej.: Voges-Proskauer, caldo urea.c. Selectivo-diferencial: Contienen en una sola fórmula los elementos de los mediosselectivos y diferenciales. De esta forma es posible observar el proceso de aislar yclasificar.Ej.: Medio Nº 110 para Staphylococcus, éste contiene 7.5% de NaCl, en circunstanciasque la concentración salina de la mayoría de los medios es 0,25 a 0,5 g%. Esteingrediente evita el desarrollo de casi todas las demás bacterias.Además, las pruebas de la gelatina y la fermentación del manitol permiten diferenciar lasdiversas cepas de Staphylococcus.Otro medio selectivo-diferencial es el agar McConkey. En la figura Nº 1 se observa algunas características macroscópicas de coloniasbacterianas, frecuentemente utilizadas para la descripción de microorganismos. MORFOLOGÍA BACTERIANA: ANÁLISIS MACROSCÓPICO La observación al microscopio de las bacterias nos permite conocer una serie decaracterísticas complementarias a la morfología de colonia entre las que encontramos:forma, disposición o agrupación, presencia o ausencia de estructuras (cápsulas, esporas,flagelos), movilidad, etc.
  • 20Existen numerosas técnicas para la observación microscópica de los microorganismos.En el laboratorio son fáciles de realizar las siguientes:1. Observación de bacterias vivas: Para observar las bacterias vivas, sin teñir, se utilizael microscopio de fase contrastada. Este tipo de microscopio se desarrolló para hacerposible observar células pequeñas sin teñir. Se basa en utilizar y aumentar la pequeñadiferencia de índice de refracción que existe entre las células y el medio que las circunda.Esta diferencia puede ser usada para crear una imagen con mucho mayor contraste que laque se obtiene en el microscopio de campo claro. Este microscopio usa un lente objetivoespecial y en el condensador se inserta un diafragma especial; además para aumentar elcontraste se insertan filtros verdes o azules.a. En fresco: Este método de examen permite observar el microorganismo al estado vivoy evita las deformaciones artificiales de su morfología que producen las técnicas decoloración. Su aplicación más importante se refiere al estudio de la movilidad de losmicroorganismos.b. Con fondo oscuro: Se basa en el fenómeno de Tyndall, de reflexión luminosa. Para laobservación se sustituye el condensador de Abbé por el condensador de fondo oscuro, ode ultra. Se ilumina la preparación en forma oblicua, incidiendo los rayos luminososdirectamente sobre los microorganismos sin penetrar en el objetivo del microscopio. Seemplea para la observación de bacterias muy pequeñas o de aquellas que difícilmente seobservan al microscopio de campo claro por su falta de contraste con el medio.c. Gota colgante: Consiste en suspender el microorganismo a observar en un líquido ydepositar una gota de la suspensión sobre un cubreobjeto el cual se coloca sobre unportaobjeto, luego se procede a la observación microscópica.2. Observación de bacterias muertas:a. Tinción simple: Se utiliza un sólo colorante para revelar la presencia demicroorganismos y su forma en general. Son de poco uso en bacteriología.b. Tinción negativa: Se tiñe el fondo mientras que las células permanecen sin teñir(transparentes), observándose como entidades claras sobre un fondo oscuro. Ejemplo deeste tipo de tinción es la tinción de cápsula en la que se usa tinta china.c. Tinciones especiales: Se utilizan para observar alguna estructura en particular comonucleoide, flagelo, esporas, etc.
  • 21d. Tinciones diferenciales: Las bacterias son diferentes entre sí, tanto en su estructurafísica como en su composición química, de modo que reaccionan en forma diferentefrente a los colorantes. Estas tinciones se utilizan para diferenciar los distintos grupos debacterias. La Tinción de Gram es la tinción diferencial más importante usada enbacteriología. Otra muy utilizada es la Tinción de Ziehl Neelsen. Algunas estructuras bacterianas que pueden ser diferenciadas por métodos detinción son esporas y cápsula:a. Observación de esporas: Esta tinción es un ejemplo de tinción especial. Algunosgéneros bacterianos como Bacillus y Clostridium, producen endosporas como una formade resistencia a condiciones ambientales adversas, por ejemplo sequedad o falta denutrientes. Las endosporas o esporas se caracterizan por ser altamente resistentes al calor,a las radiaciones y a la desecación. La resistencia de la espora se debe a la estructuraproteica (rica en aminoácidos azufrados) de sus capas externas, lo que también las haceresistentes a tinción. Por este motivo las esporas se tiñen en caliente.b. Observación de cápsula: se trata de una tinción negativa usando tinta china quepermite determinar la presencia de cápsulas polisacarídicas.El estudio macro y microscópico de una muestra bacteriana permite obtener unaorientación preliminar de su identidad y dirige al desarrollo de pruebas bioquímicasespecíficas que permitirán una identificación más certera y precisa.La técnica de mayor importancia en el área de la microbiología, es la tinción de Gram(Figura Nº 2), pues divide a las bacterias en dos grandes grupos: Gram positivo y Gramnegativo. Además permite diferenciar forma (cocos, bacilos) y la disposición bacteriana(pares, cadenas, racimos).La tinción Gram consiste en teñir un frotis de bacterias con cristal violeta, y luegotratarlas con una solución mordiente (fijadora) de Yodo-Ioduro. Todas las bacterias setiñen en estas condiciones. Sin embargo, sólo algunas son capaces de retener el coloranteal tratarlas con un agente decolorante como etanol o una solución decolorante de etanol-acetona. Las bacterias que retienen el colorante son Gram positivo; las que sedecoloran son Gram negativo y para observarlas deberán teñirse con un colorante decontraste (safranina). Por lo tanto, las Gram positivo se verán de color violeta y lasGram negativo de color rojo o rosado.
  • 22 La diferencia en la reacción frente a la tinción de Gram se debe a la diferencia enla composición química de las estructuras externas de las bacterias. Las bacterias Grampositivo tienen una capa gruesa de peptidoglicán o mureína, mientras que las Gramnegativo tienen menor cantidad de peptidoglicán y tienen una membrana externa(además de la membrana citoplasmática). La explicación más aceptada es que, luego dela acción de la solución decolorante, las bacterias Gram positivo son capaces deretener el colorante gracias al peptidoglicán. En cambio, las Gram negativo, pierdenparte de los lípidos de su membrana externa por acción del decolorante (un solventeorgánico como por ejemplo alcohol), lo que sumado a la menor cantidad depeptidoglicán, hace que se decoloren. Es importante destacar que la etapa crítica en latinción es la de decoloración, por lo que se debe tener especial cuidado en realizarla enforma adecuada.También es importante señalar que las bacterias Gram positivo pueden observarse comoGram negativo en algunas condiciones: en cultivos viejos (de más de 24 ó 48 horas), apH ácido y en condiciones de decoloración muy prolongada.Un género bacteriano que representa una excepción a la tinción de Gram (no se tiñen)es Mycobacterium (bacilos ácido-alcohol resistentes), cuyas especies, como M.tuberculosis (Bacilo de Koch) y M. leprae (Bacilo de Hansen) deben ser teñidos con latinción de Ziehl Neelsen.Son bacterias que se tiñen con dificultad, pero una vez teñidas, el colorante no se libera,aún por acción de decolorantes enérgicos como una solución de alcohol y ácidoclorhídrico. Esta resistencia se debe a la gran cantidad de lípidos que tiene su cubierta,incluyendo ácidos grasos de alto peso molecular que constituyen entre el 20 y 40% delpeso seco de la bacteria. El contenido inusualmente alto en lípidos le confiere a estegrupo propiedades como: hidrofobicidad (las bacterias tienden a formar grumos en mediolíquido), resistencia a la acción de anticuerpos y complemento, crecimiento lento debidoa la dificultad de absorción de nutrientes a través de esta pared celular lipídica.
  • 23Figura Nº 2: Técnica Tinción Gram.1 Cubra el frotis con Cristal violeta por 2 minutos2 Agregue solución de lugol por 1min.3 Decolore con alcohol-acetona y lave con agua4 Cubra con safranina 1% por 1min. Lave con agua y seque con papel
  • 24TABLA Nº 1: Cuadro Resumen Tipo de TincionesTINCIÓN REACTIVOS PRINCIPIO UTILIDAD Cristal Violeta, Lugol, Gram positivo retienen cristal violeta (azul) Clasificación bacteriana clásica:Gram Alcohol – Acetona, Safranina Gram negativo se tiñen con contraste (rojo) Gram Positivo y Negativo Esporas de bacilosTinción de esporas Verde de malaquita, Safranina Tiñe la espora (verde) Gram Positivo Fucsina, Acido Sulfúrico, Azul Unión ácido resistente de fucsina a escasosKinyoun Nocardia (BAA lábiles) de Metileno ácidos micólicos de la pared (fucsia) Naranja de Acridina Tiñe el DNA bacterianoAnaranjado de acridina Bacterias Gram lábiles (fluorescencia) (fluorescencia naranja) Bartonella spp,Giménez Fucsina, Verde de Malaquita Tiñe la pared de Bartonella (fucsia) corpúsculo elemental de Chlamydia Fucsina, Alcohol – Acido, Azul Unión ácido-alcohol resistente de fucsina aZiehl-Neelsen Micobacterias (BAAR*) de Metileno ácidos micólicos de pared (fucsia) Micobacterias Auramina – Rodamina Unión de auramina-rodamina al ácidoAuramina / rodamina (mayor sensibilidad que Permanganato de Potasio micólico de la pared (fluorescencia amarilla) Ziehl Neelsen)
  • 25Utilidad clínica de la tinción de Gram:Este examen permite al clínico sospechar el agente causal de una infección, que muchasveces sirve de base para el inicio de terapia antibiótica.La sensibilidad analítica (número mínimo de bacterias que la técnica puede detectar) es de100.000 bacterias /ml de muestra.La sensibilidad clínica (probabilidad que un paciente que tenga una infección tenga un testpositivo) varía según tipo de muestra:Líquido cefalorraquídeo (meningitis) : 75 %Líquido pleural (empiema pleural) : 50-80%Líquido peritoneal (peritonitis) : 25-50%Líquido articular (artritis séptica) : 50%Se debe solicitar en toda muestra clínicaDe gran importancia en infecciones mixtas por bacterias aeróbicas y anaeróbicas, pues sibien los anaerobios no crecen en los medios habituales, sí se observan en la tinción de Gram.ACTIVIDADES PRÁCTICASOBJETIVOS1. Sembrar y describir colonias bacterianas desarrolladas en medios de cultivo sólido (Placasde Agar) de acuerdo a criterios macroscópicos.2. Practicar diferentes tinciones de frotis bacterianos: tinción de Gram, tinción de cápsula ytinción de esporas.3. Observar endosporas y su disposición en formas vegetativas de Bacillus spp.4. Observar la presencia de cápsula en Klebsiella spp.5. Observar diferentes preparaciones fijadas y describirlasOBSERVACIONES MACROSCÓPICAS1.- Siembre mediante técnica de aislamiento dos de las muestras disponibles en ellaboratorio tanto en agar sangre como en agar McConkey y deje incubar a 37ºC por 24hrs.
  • 262.- En la siguiente sesión de trabajo práctico observe y describa las colonias desarrolladas enlos distintos medios, según sus características macroscópicas (figura 1).OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS1. Observación de muestras fijas.Observar en el microscopio óptico con un aumento de 100X (usando aceite de inmersión), laserie de preparaciones teñidas fijas (colección en caja) e identificar la forma, agrupación yafinidad tintorial.2. Tinción de Esporas.Procedimiento :a. Con el asa, colocar una gota de agua (del tamaño de una arveja) sobre el portaobjeto.b. Esterilizar el asa y obtener una pequeña muestra desde la placa de Bacillus sp.c. Mezclar la muestra con la gota de agua y fijar en el mechero hasta que se sequecompletamente (sin hervir).d. No olvidar esterilizar el asa después de usarla.e. Poner 4 capas de papel sobre el frotis y, a continuación agregar solución colorante Verdede malaquita. El colorante tiene que atravesar las 4 capas de papel y ponerse en contacto conel frotis bacteriano.f. Esta tinción se realiza en caliente: con una pinza de madera debe colocar la muestraencima de la llama del mechero hasta observar emisión de vapor durante 3 min. Nosobrecaliente para evitar que se queme su muestra o se rompa el portaobjeto.g. Si la emisión de vapor desde la muestra cesa, hay que reponer el colorante nuevamente.h. Lavar con agua de tal manera que escurra suavemente todo el colorante Verde demalaquita y el papel.i. Cubrir el frotis con el colorante de contraste Safranina, durante 1min.j. Lavar con agua.k. Secar cuidadosamente con papel absorbente y observar con lente de inmersión.
  • 27 A B C D Papel Absorbente E F G Verde Malaquita Safranina Figura Nº 3: Procedimiento Tinción de Esporas. Localización y morfología de las esporas en BacillusNOTA: Las bacterias se observan rosadas mientras que las esporas (de menor tamaño quelas bacterias) son pequeñas esferas verdes. Es posible observar esporas libres y esporasintracelulares. En estas últimas se determina si se encuentran al centro o hacia un extremo dela célula y, si la espora deforma o no al bacilo.
  • 283. Tinción de Cápsula.Procedimiento:a. En una esquina del portaobjeto colocar una gota de Tinta china del tamaño de una arveja.b. Esterilizar el asa y tomar parte del cultivo de la bacteria Klebsiella spp.c. Mezclar la tinta china con la bacteria, esterilizar el asa y repetir 3 ó 4 veces (sólo agregarla bacteria). La Tinta china impide ver si la solución tiene o no suficiente bacteria, por lomismo es necesario mezclar con suficiente cultivo.d. Tenga cuidado de no ensuciar su cultivo bacteriano con Tinta china; asegúrese deesterilizar el asa previamente y de enfriar ésta en las paredes del tubo.e. Realizar un frotis extendiendo la suspensión de manera que quede una capa delgada. Estose realiza tomando un cubreobjeto y, esparciendo la mezcla a lo largo del portaobjeto quecontiene la mezcla Tinta china-bacteria. Ver figura.f. Fijar suavemente en el mechero.g. Durante 3 min cubra completamente con colorante de contraste, Fucsina.h. Lave con agua, seque con papel absorbente y observe con lente inmersión.
  • 29A BC DE F Fucsina Bacterias Cápsula Figura Nº 4: Procedimiento Tinción de Cápsula.
  • 304. Análisis Microscópico mediante tinción de Gram1. Realice tinción de Gram a las muestras que Ud. sembró y observe al microscopio.Preparación de frotis bacteriano a partir de una colonia.a. Flamear el asa para su esterilización.b. Colocar con el asa una gota de agua en el centro de la lámina (aprox. 0,5 cm de diámetro).c. Flamear el asa para su esterilización.d. Enfriar el asa en un sector del agar donde no existan colonias.e. Obtener una pequeña muestra desde la placa.f. Mezclar la muestra con la gota de agua y esparcirla por la superficie del portaobjeto.g. Fijar el frotis exponiéndolo a la llama del mechero hasta que se seque.Tinción frotis mediante Grama. Verificar, con el dorso de la mano, que el vidrio no esté demasiado caliente.b. Cubrir el frotis completamente con cristal violeta y dejar en reposo por 2 min.c. Dejar escurrir el cristal violeta y agregar sobre la muestra una solución de Lugol. Dejarcon Lugol por 1 min.d. Lavar el lugol alternativamente con alcohol-acetona y agua dejando escurrir suavemente,hasta que se decolore completamente. (Debe primero lavar con el decolorante alcohol-acetona y luego con agua)e. Cubrir con colorante de contraste, Safranina al 1%, por 1 min.f. Lavar con agua, dejar escurrir y secar suavemente con papel absorbente.2. Observar en el microscopio óptico con aumento de 100X y aceite de inmersión.Caracterizar según criterios microscópicos (afinidad tintorial, morfología y agrupación) losmicroorganismos.
  • 31TRABAJO PRÁCTICO N°3FLORA NORMAL Y MUESTRAS CLÍNICAS DEBACTERIAS GRAM POSITIVO Como en la mayoría de los animales, el organismo humano posee lugares quenormalmente se mantienen estériles y otros donde cohabitan, también normalmente, unagran diversidad y una cantidad sorprendente de microorganismos, aún en las personas mássanas. La sangre, el líquido cefalorraquídeo, la médula ósea y las vías aéreas inferiores(bronquios y alvéolos), entre muchos otros, carecen de microorganismos debido a losmecanismos de defensa que presentan. Pero en la boca, faringe, intestinos, vagina, oídos,piel, nariz o conjuntivas residen diversos microorganismos que conforman la flora normaldel ser humano. La colonización microbiana del individuo, comienza con el nacimiento. Los primerosmicroorganismos en establecerse son aquellos transferidos desde la vagina materna y delárea perineal, hacia la piel, la boca, la nariz y región faríngea del niño. Las biotascaracterísticas de éstas y otras áreas, se desarrollan posteriormente y probablemente sederivan y seleccionan de diversas fuentes ambientales.Zona del intestino inferior: Rico en gran cantidad de substancias alimenticias, que favorecenel crecimiento de saprófitos.Zona boca, región orofaríngea y vulva: Con substancias provenientes del exterior oacumulación de restos celulares, o bien gran cantidad de pliegues que favorecen la existenciade anaerobios.Zona de la piel: Que difiere de los otros ambientes por su menor humedad y alto contenidolipídico, que tiende a seleccionar una biota algo diferente.Se debe enfatizar que los anaerobios estrictos exceden en número a las formas facultativas yaerobias por un factor de 10 a 100 o más. Existe una interacción permanente entre loscomponentes de la flora y el hospedero, que provoca fluctuaciones en la biota, tantocualitativas como cuantitativas. Los efectos de estas fluctuaciones incluyen los beneficiosos,inaparentes, hasta los perjudiciales.
  • 32Algunos de los microorganismos más frecuentemente encontrados en los cultivos de lasdiferentes regiones del cuerpo y, que se consideran integrantes de la flora normal, son:Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Streptococcus mitis, Streptococcussalivarius, Streptococcus mutans, Enterococcus faecalis, Streptococcus pneumoniae,Streptococcus pyogenes, bacterias coliformes como Escherichia coli, Proteus mirabilis,Pseudomonas aeruginosa, bacteroides, espiroquetas, lactobacilos y, clostridios comoClostridium tetani.La flora transitoria de la piel se encuentra representada principalmente por bacterias Grampositivo, como Streptococcus del grupo A, Staphylococcus aureus y, flora fúngica comoCandida albicans.Innumerables bacterias son filtradas a medida que el aire que los transporta pasa a través dela nasofaringe, la tráquea y los bronquios; la mayoría de estos microorganismos sonatrapados en la secreciones mucosas y deglutidos. Así, los senos nasales, la tráquea, losbronquios y los pulmones son habitualmente estériles. La nasofaringe es el hábitat natural debacterias y virus patógenos que causan infecciones en la nariz, garganta, bronquios ypulmones.Algunas personas se convierten en portadores nasales de estreptococos y estafilococosdescargando estos microorganismos en grandes cantidades desde la nariz hacia el aire.Normalmente existe un equilibrio entre los microorganismos de la flora y el hospedero; sinembargo este equilibrio puede romperse por:- Aumento de la masa crítica- Traslado desde el sitio original- Ruptura de barreras mecánicas por traumatismos.Esto produce una proliferación e invasión de los microorganismos, dando origen a unainfección endógena. Por lo general, se requieren algunos determinantes para que seproduzcan estas enfermedades, como son:- Deficiencia en el estado inmunitario del huésped.- Tratamiento inmunosupresor o con corticoides.- Cirugías.- Uso de antibióticos.Como ejemplos de infección endógena se pueden mencionar:
  • 33- Infección urinaria por Enterobacterias.- Endocarditis bacteriana por microorganismos de la boca (Streptococcus grupo viridans)- Diarrea por sobreinfección de Clostridium difficile, debido al uso prolongado deantibióticios.ETAPAS DEL DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICOPara llegar a la identificación de una bacteria es necesario seguir una serie de pasos. Elprimero implica la toma de muestra, siguiendo los procedimientos adecuados según lasospecha clínica.El segundo paso corresponde al examen microscópico directo, con o sin tinción.El tercer paso es el aislamiento del agente, para lo cual se debe disponer de medios decultivo adecuados donde la muestra y las bacterias, que ésta pudiese o no contener, puedanencontrar los nutrientes y factores adecuados para propiciar su crecimiento y desarrollo.El cuarto paso consiste en identificar el agente, para ello se recurrirá a determinar sumorfología bacteriana como su posible agrupación, y se aplicará distintas pruebasbioquímicas y fisiológicas destinadas a conocer sus características metabólicas.Por último se debe realizar las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana. TOMA DE MUESTRAEXAMEN MICROSCÓPICO DIRECTO (Gram o Ziehl-Neelsen)AISLAMIENTO DEL AGENTEIDENTIFICACIÓN FISIOTAXONÓMICA DEL AGENTETinción: Morfología y agrupación; Pruebas BioquímicasSUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA INFORME
  • 34SELECCIÓN, RECOLECCION Y TRANSPORTE DE MUESTRAS PARAESTUDIOS MICROBIOLOGICOS.En la recuperación del o los microorganismos causantes de la infección, lo más importantees la correcta recolección de una muestra para su estudio microbiológico.Esta recolección comprende cuatros pasos importantes: 1. Seleccionar el sitio anatómico más adecuado para tomar la muestra. 2. Usar la técnica más apropiada. 3. Poner la muestra recolectada en un envase que favorezca la viabilidad de los microorganismos causantes del proceso infeccioso, y que además impida la filtración o derrame de la muestra, como medida de protección para el personal que posteriormente la manipula. 4. Enviar la muestra en forma rápida y expedita al laboratorio, y en el caso de que esto no sea posible, asegurarse que sea almacenada a la temperatura y en los medios de transporte adecuados.Una muestra mal recolectada puede inducir a error en el aislamiento del microorganismoetiológico real, y la recuperación de contaminantes puede llevar a indicar unaantibioticoterapia incorrecta y a veces incluso perjudicial. Debe recordarse entonces, que “lacalidad del trabajo realizado en el laboratorio no puede ser superior a la calidad de lamuestra recibida”.Ya que el proceso de toma de muestra se inicia al lado del paciente siendo éste parte activa,es necesario explicarle el porqué del procedimiento y el tipo de técnica a realizar, para lograrasí su colaboración y participación, lo que lleva a la obtención de la muestra en óptimascondiciones.Recolección y transporte de la muestras:Preparación del sitio. En todos aquellos casos en que la muestra se obtenga con aguja o poraspiración, se debe desinfectar la piel. Esto se logra limpiando la piel con alcohol al 70%,seguido por povidona yodada, la que se deja actuar un minuto (esperando que se seque). Siel paciente presenta hipersensibilidad al yodo, se debe usar solo alcohol.Volumen. Si es posible obtener muestras líquidas (mediante aguja o aspiración) no debieranusarse tórulas. El volumen de muestra que se envía al laboratorio es generalmente menor delo requerido. No existe consenso sobre los volúmenes mínimos para cada tipo de muestra.
  • 35Envase y aparatos recolectores. Existen diferentes métodos de recolección, desde la tórulahasta aparatos recolectores de muestra.Las tórulas deben ser de un material que no inhiba el crecimiento bacteriano (alginato decalcio o polyster). Éstas, luego de tomada la muestra, se introduce en un envase estéril conun medio de transporte. Para muestras líquidas, lo más adecuado es usar envases plásticosestériles, o tubos con tapa rosca.Técnicas de recolección. Con el fin de obtener una muestra óptima para la recuperación delagente etiológico es necesario seguir las instrucciones dadas más adelante.Medio de transporte. No deben usarse tórulas sin medio de transporte (excepto para ciertastécnicas específicas) porque esto lleva a la desecación de la muestra y a la pérdida de laviabilidad bacteriana. Los medios de transportes recomendados cuando se usan tórulas, en elcaso de las secreciones, son del tipo tampón (Stuart, Amies). Contiene tioglicolato de sodio,el cual provee un ambiente reducido y es útil para suprimir cambios oxidativos en el mediode transporte,. De esta manera se favorece la viabilidad de los microorganismos durante suenvío al laboratorio.PROCEDIMIENTOS DE ENFERMERIA EN LA TOMA DE MUESTRASMICROBIOLOGICAS DE DISTINTAS ZONAS ANATOMICASINFECCION TRACTO URINARIO (ITU)(Orina, secreción uretral y prostática)UROCULTIVOSMuestra Miccional: Realizar aseo perineal prolijo, separando los labios en la mujer yretrayendo el prepucio en el varón durante el procedimiento. Eliminar el primer chorro deorina, a fin de arrastrar mecánicamente la flora externa del tracto genitourinario.Recibir 2 a 3 ml del segundo chorro en receptáculo estéril y sin interrumpir la micción.Tener presente de poner un tapón vaginal en la mujer a fin de evitar contaminación con laflora vaginal.Con el objeto de no alterar el recuento bacteriano la muestra debe ser sembrada dentro de lasprimeras dos horas de tomada. Debe mantenerse refrigerada a 4º C y trasladarla manteniendola cadena de frío.
  • 36Muestra por punción de catéter urinario: Desinfectar el sitio de punción del segmentoproximal del catéter con alcohol 70%, aspirar con jeringa estéril entre 2 a 5 ml de orina,vaciar en tubo estéril y transportarla al laboratorio de la misma forma que la muestramiccional.Muestras por punción suprapúbica: Antisepsia de la piel en el sitio de punción, aspirarcon técnica aséptica entre 2 a 5 ml de orina y proceder a su traslado al laboratorio de igualforma que los casos anteriores.Secreción uretral: Previo aseo genital, exprimir uretra y recibir la secreción en tórulaestéril, colocar en medio de transporte y enviar a estudio. La muestra debe tomarse a primerahora de la mañana o después de una hora de orinar.Secreción prostática:La técnica de recolección es exprimir la próstata a través de un masaje prostático por víarectal e impregnar una tórula estéril con el fluido obtenido. Colocar en medio de transporte.INFECCION RESPIRATORIA INFERIOR (IRI)(Neumonía, TBC)TOMA DE MUESTRAS NO INVASIVASPrevio a la toma de muestra, realizar aseo bucal y posterior a tos voluntaria profunda recogerla muestra en receptáculos estériles o placa de Petri, Enviar de inmediato al laboratorio, si noes posible mantenerla refrigerada transitoriamente a 4º C por no más de dos horas. Esrecomendable facilitar la expectoración con kinesiterapia respiratoria o drenaje postural. Enpacientes intubados realizar la aspiración endotraqueal con sonda estéril y técnica aséptica,introducirla evitando su contaminación con gérmenes exógenos y aspirar depositando elcontenido en tubo estéril para su estudio que puede ser cualitativo o cuantitativo. Este últimotiene mejor perfil de especificidad, por cuanto se debe de rigor al momento de realizar eldiagnóstico etiológico en pacientes conectados a ventilación mecánica.TOMA DE MUESTRAS INVASIVASCuando se trata de identificar el agente etiológico de neumonía nosocomial, las muestras quetienen mejor rendimiento; pero también mayores riesgos para el paciente, son aquellastomadas por broncoscopías (lavado broncoalveolar, aspirado telescopado protegido),Toracocentesis y Biopsia.
  • 37Lavado bronqueoalveolar: Realizar el procedimiento a través de broncoscopía y contécnica aséptica aspirar entre 15 a 50 ml de lavado. Transportarlas de inmediato en tuboestéril al laboratorio para su estudio.Aspirado telescopado protegido: Por broncoscopía introducir cepillo a través del catéterprotegido frotar la zona alterada y enviar en tubo estéril de inmediato al laboratorio paraestudio semicuantitativo. *Toracocentesis: Realizar el procedimiento con técnica aséptica, aspirar 10 ml si es posible.Transportar de inmediato al laboratorio para su estudio.Biopsia pulmonar: realizar el procedimiento con técnica aséptica, enviar un trocito de tejidoen tubo estéril o en medio de transporte con caldo específico. Trasladar la muestra deinmediato para su estudio.*Corte recomendado para cultivos cuantitativos en secreciones respiratorias para neumoníaes:Con recuento > 10 elevado a 6 UFC/ml en muestra por aspirado traquealCon recuento > 10 elevado a 3 UFC/ml en muestra por cepillado protegidoCon recuento > 10 elevado a 4 UFC/ml en muestra por lavado bronqueoalveolarINFECCION RESPIRATORIA ALTA (IRA)Secreción faríngea: Deprimir la lengua y frotar con tórula estéril amígdalas, pilaresanteriores y pared posterior de la faringe. Colocar en el medio de transporte y enviar deinmediato al laboratorio, si no es posible la muestra se mantiene transitoriamente atemperatura ambiente.Secreción nasal: Introducir tórula estéril más o menos 2,5 cms en mucosa nasal, rotar ycolocar en medio de transporte. Enviar al laboratorio de inmediato o mantener la muestratransitoriamente a temperatura ambienteINFECCION DE HERIDA OPERATORIA (IHO)(Superficial, profunda abscesos cerrados)Infección superficial: son aquellas que comprometen dermis, epidermis y celularsubcutáneo.Infección profunda: son aquellas que incluyen fascia y músculo, pudiendo comprometer ono cavidades u órganos.
  • 38Toma de muestra superficial: Limpiar la herida con suero fisiológico o Ringer, frotar contórula estéril el centro y los bordes internos de la superficie cruenta, colocar en medio detransporte y enviar al laboratorio para su siembra y estudioToma de muestra profunda: Limpiar la superficie cruenta con suero fisiológico o Ringer,tomar la muestra con tórula de la parte más profunda de la herida, colocar en medio detransporte y enviarla al laboratorio.Si se sospecha anaerobios: Desinfectar con antisépticos la superficie y los bordes de laherida, aspirar de la zona profunda de la herida 0,5 ml de secreción y enviar en la mismajeringa sellada al laboratorio, teniendo la precaución de eliminar toda burbuja de aire de suinterior.Si no es posible aspirar material, introducir tórula en lo más profundo de la herida ycolocarla en tioglicolato. De mayor rendimiento que lo anterior es tomar un trocito de tejido(6 mm) con pinza estéril y dejarlo caer en el tioglicolato o en suero fisiológico e incluso entubo estéril sin ningún preservante.Abscesos cerrados: Desinfectar el sitio de punción con antiséptico, aspirar material en loposible 10 ml y vaciar a tubo estéril para enviar al laboratorio. Si se sospecha de anaerobiosenviar en la misma jeringa sellada, eliminando todo el aire remanente.COMENTARIOLas muestras de pus tienen muy mal rendimiento, ya que el pH ácido de este materialdestruye rápidamente los microorganismos, siendo difícil su aislamiento posterior a lasiembra.INFECCIONES SUPERFICIALES DE PIEL Y MUCOSASSecreción conjuntival: Limpiar la superficie externa del ojo con suero estéril, frotar contórula humedecida el borde interno de la conjuntiva y colocarla en el medio de transportepara su envío al laboratorio.Secreción ótica: Limpiar el canal auditivo con jabón antiséptico, tomar la muestra contórula estéril y colocarla en el medio de transporte para su envío al laboratorio.
  • 39Secreción umbilical RN: Tomar muestra directa de la zona umbilical sin previa limpieza,colocar en medio de transporte y enviar al laboratorio.COMENTARIO.Las muestras tomadas por punción ocular u ótica deben ser enviadas en la misma jeringa oen caldo de cultivo tioglicolato.INFECCIONES GINECO – OBSTETRICASEndocervix: Previo aseo genital, introducir tórula hacia el canal cervical y rotar, colocar latórula en medio de transporte y enviar al laboratorio. Si se sospecha de Neisseriagonorrhoeae (gonococo), inocular en placa de Thayer Martin en Z la que debe ser solicitadapreviamente al laboratorio para su siembra inmediata. Enviar al laboratorio en receptáculocon una fuente que consuma oxigeno.Endometritis: A través de especulo y previo aseo genital, aspirar muestra con jeringa concatéter protegido. Enviar de inmediato en la misma jeringa tapada o dejar caer el exudado entioglicolato. NO REFRIGERAR.Douglas: Aspirar por punción del fondo de saco vaginal previo aseo genital. Enviar en lamisma jeringa tapada como para estudio de anaerobios.Secreciones vaginales: Para estudio bacteriológico y de hongos. A través de un especulofrotar con tórula estéril la mucosa vaginal e impregnarla de flujo de los fondos de saco,colocar en medio de transporte y enviar al laboratorio.Para Trichomonas, introducir suero fisiológico tibio, recoger y vaciar en tubo estéril de 3 a 5ml. Enviar de inmediato al laboratorio.Líquido Amniótico: Obtener por punción, previa desinfección con antiséptico y enviar allaboratorio en la misma jeringa o en tubo estéril entre 5 a 10 ml de muestra.Placenta y tejidos fetales: Durante el acto quirúrgico, obtener tejido o aspirados. Enviar entubo estéril o caldo tioglicolato como para estudio de anaerobios.Trompas y ovarios: Obtener muestra durante la cirugía y enviar tejido o aspirado de lamisma forma que para estudio de anaerobios.COMENTARIO
  • 40En caso de Endometritis Puerperal, los cultivos microbiológicos no son necesarios para sunotificación ya que es suficiente el criterio clínico, por otra parte la etiología espolimicrobiana y predecible.En caso de brotes de endometritis puerperal, los cultivos se realizan a fin de detectarStreptococcus beta hemolitico grupo A u otro agente no habitual.MUESTRAS DE FLUIDOS, CAVIDADES NORMALMENTE ESTERILES YCATETERESLíquido cefalorraquídeoPrevia desinfección de la zona con antiséptico y con técnica aséptica, obtener entre 2 a 3 mlde muestra y en tubo estéril enviar de inmediato al laboratorio, si no es posible enviarla almomento, transitoriamente debe mantenerse a temperatura ambiente. NO REFRIGERAR.Líquido ascíticoAspirar idealmente 10 ml de muestra a través de punción abdominal con técnica aséptica,vaciar a frasco de hemocultivo y simultáneamente 1 ml en tubo estéril seco para tinción enlaboratorio.Lecha MaternaLimpiar el pezón previo a extracción de la muestra, descartar los primeros ml y recoger entre2 a 5 ml en tubo estéril. Enviar de inmediato al laboratorio.CateterLa cateterización venosa se define como la inserción de un catéter biocompatible en elespacio intravascular, central o periférico, con el fin de administrar soluciones,medicamentos, nutrición parenteral, medios de contraste y realizar pruebas diagnósticas,entre otros.Para cultivar catéteres vasculares, existen 2 técnicas.1.- Cortar de forma aséptica la punta del catéter e introducirla en un tubo con caldo corriente.Esta técnica tiene la desventaja de que no es posible realizar el recuento de colonias, y por locual, no se puede asegurar que en un cultivo positivo en estas condiciones, no corresponda auna contaminación con flora de piel.
  • 412.- Cortar de forma aséptica la punta y el segmento intracutáneo del catéter. Introducir en unfrasco o tubo estéril y enviar al laboratorio antes de 2 horas. En el laboratorio y usando unapinza estéril, hacer rodar el catéter sobre una placa de agar sangre, al menos 4 veces haciaadelante y hacia atrás (técnica de Maki). Es una técnica semicuantitativa que permite realizarel recuento de colonias y, basándose en este recuento, determinar con mayor exactitud si uncultivo positivo corresponde a contaminación con flora de piel o a infección relacionada conel catéter.Catéter venoso central tunelizado. Catéter venoso central implantable.INFECCION GASTRO INTESTINAL (IGI)CoprocultivosIntroducir tórula limpia en la zona más alterada de las deposiciones recién emitidas (mucus osangre) y colocarlas en el medio de transporte (tubo tapa roja). Las muestras pueden tomarsedirectamente del recto, del pañal o receptáculo limpio.Para leucocitos fecales: Enviar deposiciones frescas en tubo limpio y seco sin medio detransporte. Las muestras tomadas por rectoscopía o colonoscopías tienen mayor rendimiento,por cuanto de ser posible es recomendable obtener las muestras de esta forma.Para Clostridium difficile: Enviar 5 a 10 ml de deposiciones recién emitidas en tubo ofrasco limpio y seco.Aspirado gástrico en RNAspirar por sonda nasogástrica de 1 a 3 ml de contenido y colocar en tubo estéril. Sólo sejustifica esta muestra en las primeras 24 horas de vida.
  • 42FISIOTAXONOMÍA DE BACTERIAS GRAM POSITIVO La fisiología bacteriana estudia el comportamiento de las bacterias vivas a través delas alteraciones que se producen en el medio de cultivo. Estas manifestaciones han permitidoestablecer diferencias entre ellas, las que han sido utilizadas en su clasificación en diferentesgéneros y especies.Las técnicas de identificación bioquímica de las bacterias diferencian géneros y especiesbacterianos en base a la detección de:a. Utilización de fuentes de carbono: Glucosa, Lactosa, Sacarosa, Manitol, Sorbitol,Citrato.b. Formación de productos finales o intermediarios del metabolismo microbiano: Indol,CO2, Ácido sulfhídrico (H2S), Acetilmetilcarbinol.c. Presencia de enzimas: Catalasa, Ureasa, Oxidasa, Coagulasa.d. Sensibilidad a compuestos químicos o antibióticos: Bacitracina, Optoquina,Novobiocina.Para cocáceas Gram positivo se utilizan fundamentalmente los dos últimos métodos, encambio para bacilos Gram negativo se emplean los tres primeros.En este trabajo se analizarán dos de las Familias de Bacterias Gram positivo másimportantes, como son las Micrococcaceae y Streptococcaceae (figura 1).La Familia Micrococcaceae comprende los géneros Micrococcus, Staphylococcus yPlanococcus. Son bacterias Gram positivo, esféricas (cocos) agrupadas en racimo. Soncatalasa positivo, reacción que diferencia la Familia Micrococcaceae de otros cocos Grampositivo como Streptococcus.
  • 43 Agrupación de algunas cocáceas Gram +Las especies del género Micrococcus son saprófitas, se encuentran habitualmente en la pielde mamíferos, en el suelo y el agua. Tienen metabolismo estrictamente aerobio, a diferenciade las especies del género Staphylococcus que son aerobios o anaerobios facultativos. Otracaracterística que diferencia ambos géneros, es la propiedad de Staphylococcus de fermentarglucosa en anaerobiosis, no así los Micrococcus que no tienen esta propiedad (Tabla 1).Las principales especies del género Staphylococcus son: Staphylococcus aureus yStaphylococcus epidermidis.Staphylococcus aureus es patógeno para el hombre. Produce una variedad de toxinas yenzimas responsables de su patogenicidad. Algunas enzimas son:a. Hialuronidasa: Rompe el cemento celular facilitando la invasión de los tejidos por lasbacterias.b. Fibrinolisina: Disgrega coágulos de fibrina.c. Coagulasa: Secretadas al medio extracelular y otras permanecen unidas a membrana,coagulando el plasma.d. Nucleasas: Hidrolizan DNA.Las toxinas producidas por S. aureus causan los síntomas asociados a las enfermedadesestafilocócicas. Estas toxinas son:a. Alfa toxina: hemolisina que produce lisis total de los glóbulos rojos. Es una proteínaantigénica de peso molecular 30.000.
  • 44b. Leucocidina o toxina de Panton - Valentine. Causa desgranulación de los leucocitos ymacrófagos.c. Exfoliatina: producida por algunas cepas. Causa el síndrome de piel quemada.d. Enterotoxinas: producida por algunas cepas. Causan intoxicaciones alimentarias.Aislamiento y Caracterización:El medio de cultivo utilizado para el aislamiento de S. aureus depende de si la muestra es unalimento o una muestra clínica.Para muestras clínicas como pus, heridas, secreciones, etc. se utiliza:a. AGAR SANGRE: medio enriquecido y diferencial que contiene sangre desfibrinada decordero o conejo. Permite el abundante desarrollo de las especies de Staphylococcus yademás visualizar la producción de hemolisinas, por lisis de los glóbulos rojos alrededor delas colonias (figura 2).S. aureus: produce halos de hemólisis completa alrededor de las colonias, producida por laalfa toxina.S. epidermidis : no produce hemólisis o lo hace débilmente.Micrococcus: no produce hemólisis. Tipos de hemólisis en agar sangre
  • 45 TABLA DE IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS GRAM POSITIVO Cocaceas Bacilos Catalasa Catalasa positivo Positivo Negativo Aspecto Tinción Gram Test de Bacitracina Streptococcus R S Observar Hemólisis Test de Coagulasa Micrococcus Bacilos Grandes (+) (-) Esporulados Hemólisis Hemólisis Hemólisis Bordes netos Alfa Beta GammaStaphylococcus aureus Staphylococcus Coagulasa negativo Bacillus sp Test de Latex Bilis Esculina Optoquina Optoquina NaCl 6,5 % Test de Novobiocina Bacilos finos resistente sensible S R Streptococcus Enterococcus Grupo A, B, C, Listeria S. Coagulasa negativo Staphylococcus D, F, G No saprophyticus saprophyticus Streptococcus Streptococcus Bacilo en empalizada grupo viridans pneumoniae Corynebacterium sp Bilis positivo NaCl positivo Enterococcus
  • 46b) AGAR MANITOL SALADO O MEDIO DE CHAPMAN: medio selectivo y diferencialque contiene manitol, NaCl al 7,5% y el indicador de pH rojo de fenol. Micrococcus yStaphylococcus son halotolerantes, es decir, son capaces de crecer en esta concentración deNaCl. Además se evidencia la fermentación de manitol, la que se observa por el viraje delindicador a amarillo.S. aureus: da colonias amarillas cremosas rodeadas de una zona amarilla (producto de lafermentación)S. epidermidis: generalmente no fermenta el manitolMicrococcus: no fermenta el manitol.En ambos medios (Agar Sangre y Agar Manitol Salado) se debe confirmar mediante tinción deGram la presencia de cocos Gram positivo en racimo, ya que otras especies pueden darcolonias semejantes.Una vez aisladas las colonias y habiendo observado su aspecto y características en mediosselectivos se realiza las pruebas bioquímicas para confirmar el diagnóstico. Si se sospecha quela colonia corresponde a Staphylococcus aureus, se realiza la prueba de COAGULASA.La enzima es un activador del fibrinógeno a fibrina, además, la pared de Staphylococcusaureus posee receptor de fibrinógeno lo que permite la formación de puentes entre bacteria ybacteria, formándose un coágulo.Diferencia Staphylococcus aureus de otros Staphylococcus coagulasa negativo.Ésta es una prueba de PATOGENICIDAD, la cual se puede realizar de dos formas, según eltipo de enzima:a) Técnica en tubo: detecta la coagulasa libre. Consiste en incubar plasma de conejo congotas de cultivo líquido de Staphylococcus. La reacción positiva se observa como la apariciónde un coágulo a las 4 horas.b) Técnica en portaobjeto: detecta la coagulasa unida a membrana. A partir de un cultivo deStaphylococcus en medio sólido, se hace una suspensión abundante sobre una gota de agua.Esta suspensión debe ser lo más homogénea posible. Sobre ésta se coloca una o dos gotas deplasma de conejo y se homogeniza. La reacción positiva se observa como aglutinación de lasbacterias a los 20 segundos. Comercialmente, existe un kit de aglutinación, que será empleadoen el laboratorio.Test comercial de aglutinación: sirve para diferenciar Staphylococcus aureus de otrosStaphylococcus. La metodología consiste en poner una gota de un reactivo latex sobre uncírculo de la tarjeta; a continuación se emulsiona sobre ésta la colonia sospechosa, se agita
  • 47durante unos segundos y si hay formación de grumos visibles se considera positiva. Siempre sedebe realizar un control negativo incluído en el kit (figura 3).Partículas de latex Bacterias Aglutinación de las partículascon anticuerpoAnticuerpo (Antígeno específico) = reconocen el antígeno bacteriano.(proteína A)A su vez el Género Streptococcus corresponde a cocos Gram positivos, anaerobios facultativosque se disponen en pares o cadenas y son catalasa negativo reacción que los diferencia de laFamilia Micrococcaceae. Bajo ciertas condiciones de cultivo las células son ovoides oalargadas. Se encuentran en diferentes superficies y mucosas del hombre y de algunos animalescomo cavidad oral, faringe, piel, tracto intestinal. Algunas especies son utilizadas en laindustria lechera para la elaboración de quesos, leches fermentadas y yoghurt (Streptococcuslactis).Los miembros del género Streptococcus se clasifican de acuerdo a:1.- ACTIVIDAD HEMOLÍTICA: según el tipo de hemólisis que presenten al ser cultivadasen placas de agar sangre de conejo o de cordero.a) Beta hemolíticos: producen halos limpios de hemólisis alrededor de las colonias.b) Alfa hemolíticos: producen halos de hemólisis incompleta de color verdoso (S. viridans)alrededor de las colonias.c) Gama hemolíticos: no producen hemólisis
  • 482.-SEGÚN CONSTITUCIÓN ANTIGÉNICA DE LA PARED CELULAR: clasificaciónde Lancefield. Se basa en la composición química y antigénica de un hidrato de carbonopresente en la pared celular y permite clasificar a los estreptococos en grupos serológicos quevan desde la A hasta la U.Ambas clasificaciones se asocian entre sí, así tenemos por ejemplo estreptococos betahemolíticos del grupo A como Streptococcus pyogenes, que es el más patógeno del género.Streptococcus pyogenes produce varias toxinas y enzimas responsables de su poder patógeno.Es el agente causal de infecciones locales purulentas como amigdalitis, faringitis, otitis, etc.Además provoca enfermedades sistémicas como fiebre puerperal y escarlatina.Streptococcus pneumoniae o pneumococo es otra especie importante de este género, agentecausante de neumonia lobar en el hombre. Es un diplococo no perfectamente esférico, tieneforma de cabeza de lanza (lanceolado). Su forma virulenta se encuentra rodeada por unacápsula. Es habitante normal de la faringe del hombre. Para su aislamiento las placas debenincubarse en un ambiente con 10% de CO2. En agar sangre S. pneumoniae presenta alfahemólisis y las colonias son planas con forma de fichas de damas.Estreptococos fecales o enterococos (por ejemplo Enterococcus faecalis, Enterococcusfaecium). Existen otras especies de Streptococcus que habitan el intestino del hombre yanimales y se les conoce con el nombre de estreptococos fecales o enterococos. Se caracterizanporque generalmente son no hemolíticos y pueden crecer en condiciones de alta salinidad(NaCl 6,5%), pH básico (pH 9,6) y presencia sales biliares en que otros estreptococos nopueden hacerlo. Su presencia en alimentos o agua indica contaminación fecal.Aislamiento y Caracterización:El aislamiento de Streptococcus pyogenes se efectúa sembrando la muestra sobre una placa deagar sangre. Streptococcus pyogenes presenta las siguientes características:1. Hemólisis en placa de agar sangre. Se observa hemólisis limpia alrededor de las colonias,las cuales son muy pequeñas.Se debe confirmar mediante tinción de Gram la presencia de cocos Gram positivo en cadena,ya que otras especies pueden dar colonias semejantes, por ejemplo Staphylococcus. Una vezconfirmada su presencia se realiza pruebas adicionales para confirmar el diagnóstico.a) Prueba de sensibilidad a Bacitracina. Los estreptococos beta hemolíticos del grupo A(Streptococcus pyogenes) son sensibles a Bacitracina, esta prueba se realiza en forma similar aun antibiograma. Otros estreptococos también son sensibles, sin embargo no son betahemolíticos.
  • 49b) Pruebas serológicas. El diagnóstico de Streptococcus pyogenes se debe confirmar mediantereacciones serológicas con antisueros específicos para el antígeno superficial.c) Bilis/Esculina, NaCl 6,5%:Los Enterococcus crecen en presencia de NaCl 6.5%, toleran las salas biliares y puedenhidrolizar la esculina. Estas propiedades se pueden usar para distinguir los Enterococcus deotros cocos gram (+) catalasa-negativo. En la prueba positiva, el tubo donde está el medio setorna de color chocolate oscuro, característico al desdoblar la bilis esculina.d) Test de CAMP. La sigla CAMP proviene de Christie, Atkins, Munch y Petersen, losdescubridores del fenómenoLa mayoría de los Streptococcus grupo B producen una proteína extracelular difusible (factorCAMP), la que actúa sinérgicamente con la beta-hemolisina producidas por algunas cepas deStaphylococcus aureus causando la hemólisis de los eritrocitos. Sobre una placa de agar sangrese inocula los Streptococcus en estudio trazando estrías perpendiculares a una estría central deStaphylococcus aureus. Tras la incubación se observa la presencia de una zona hemolítica enforma de punta de flecha en el área de intersección, donde el factor CAMP y la beta-hemolisinahan difundido (prueba de CAMP positiva). Aproximadamente el 95% de los Streptococcus delgrupo B y de forma ocasional unas cepas de otros grupos son CAMP-positivos.Test de susceptibilidad a agentes antimicrobianos:Método de Difusión en Agar o Kirby-BauerSe utiliza para determinar la sensibilidad in vitro de las bacterias a los distintosantimicrobianos. Este método cualitativo se basa en la inoculación del microorganismo sobre
  • 50una placa de agar donde se coloca discos de papel filtro estériles impregnados con unaconcentración conocida de antibiótico.Para que los resultados sean confiables y reproducibles es necesario estandarizar algunascondiciones de laboratorio:a) Concentración de bacterias que se siembra. Requiere uso de estándares de turbidez: MacFarland 0.5b) Medio de cultivo utilizado: Agar Müller-Hinton o agar Müller-Hinton Sangre paraStreptococcusc) Concentración del antimicrobiano en el disco: característica para cada antimicrobiano.d) Temperatura (37°C), tiempo de incubación (16-24 horas) y atmósfera de incubación (en O2)A partir de una colonia aislada (es absolutamente necesario un cultivo puro), se prepara unasuspensión bacteriana con una turbidez equivalente a un Mac Farland 0.5. La siembra de lasuspensión debe ser homogénea sobre el agar (figura 4).El antibiótico en los discos difunde radialmente durante la incubación de tal manera que amedida que se aleja del disco, la concentración disminuye. En un punto determinado, laconcentración del antibiótico no podrá inhibir el crecimiento del microorganismo,produciéndose entonces una zona circular de inhibición (halo de inhibición) alrededor deldisco. El diámetro del área de inhibición puede ser convertido a las categorías de“susceptible”, “intermedio” o “resistente” de acuerdo a las tablas publicadas por el“National Committee for Clinical Laboratories Standars (NCCLS)”.Figura 4: Antibiograma mediante la técnica dedifusión con discosBacitracina: Se siembra una placa de agar sangre homogéneamente. Se coloca un disco debacitracina, se incuba 16-24 horas y después se mide el tamaño del halo.
  • 51Se considera sensible cuando existe un halo de inhibición ≥10 mm de diámetro y resistentecuando el halo de inhibición es < 10 mm de diámetro.Micrococcus es sensible a bacitracina.Staphylococcus es resistentes a bacitracina.Optoquina: compuesto químico que pone a prueba la fragilidad de la membrana celularbacteriana. A bajas concentraciones (5g/ml) permite diferenciar Streptococcus pneumoniae(sensible) de otros Streptococcus hemolíticos. El disco de Optoquina se deposita en una placade agar sangre, sembrada homogéneamente con la colonia sospechosa. Se incuba a 37°C por24 horas. Si el halo es 14 mm, corresponde a Streptococcus pneumoniae.Novobiocina: antibiótico activo por vía oral. Se utiliza para el tratamiento de infecciones porS. aureus e infecciones urinarias resistentes a otros fármacos. Es bacteriostática e interfiere conla síntesis de la pared bacteriana. Este fármaco se utiliza muy poco debido a que su uso estáasociado a una alta incidencia de reacciones adversas y a que frecuentemente emergen cepasresistentes. Se considera sensible cuando existe un halo de inhibición ≥16 mm de diámetro yresistente cuando el halo de inhibición es < 16 mm de diámetro.Amoxicilina / Ácido Clavulánico: esta asociación se indica para el tratamiento a corto plazode infecciones bacterianas en las siguientes localizaciones, cuando se sospecha que estáncausadas por cepas resistentes a Amoxicilina y productoras de beta-lactamasas. En otrassituaciones, debería considerarse la Amoxicilina sola.Infecciones del tracto respiratorio superior; en particular sinusitis, otitis media, amigdalitisrecurrente. Estas infecciones son a menudo producidas por Streptococcus pneumoniae,Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis y Streptococcus pyogenes.Infecciones del tracto respiratorio inferior, en particular exacerbaciones agudas debronquitis crónicas, bronconeumonia. Éstas son a menudo producidas por Streptococcuspneumoniae, Haemophilus influenzae y Moraxella catarrhalis.Infecciones del tracto genitourinario e infecciones abdominales, en particular cistitis(especialmente cuando sea recurrente o complicada, excluyendo prostatitis), aborto séptico,sepsis pélvica o puerperal y sepsis intraabdominal. Son a menudo producidas por
  • 52Enterobacterias (principalmente Escherichia coli, Staphylococcus saprophyticus spp. yEnterococcus spp.)Infecciones de la piel y tejidos blandos, en particular celulitis, mordeduras de animales yabscesos dentales con celulitis diseminada que son a menudo producidas por Staphylococcusaureus, Streptococcus pyogenes y Bacteroides spp. Algunas cepas de estos gérmenes producenbeta-lactamasas, de modo que no responden a Amoxicilina sola.NOTA: Lea el procedimiento por completo antes de comenzar a trabajarACTIVIDADES PRÁCTICASObjetivos1. Conocer la importancia de una buena toma de muestra2. Conocer y practicar el procesamiento microbiológico de cocáceas Gram positivo aisladas apartir de muestras clínicas así como de flora normal3. Realizar pruebas bioquímicas para la identificación de cocáceas Gram positivo4. Identificar cepas bacterianas Gram positivo, provenientes de muestras clínicas.5. Realizar estudios de susceptibilidad a agentes antimicrobianos.I. MUESTRAS CLÍNICAS1. Observe la placa sembrada con su muestra clínica. Describa macroscópicamente las coloniasbacterianas. Observe si se trata de cultivos puros.2. Realice una tinción de Gram y describa microscópicamente su muestra. Observe almicroscopio con aumento 100X oil.Recuerde que en el caso de cocáceas Gram + es de suma relevancia conocer la agrupaciónbacteriana y el tipo de hemólisis para el diagnóstico.
  • 533. Realice las pruebas bioquímicas correspondientes según la tabla de identificación debacterias Gram positivo.a. Catalasa: Busca la presencia de la enzima catalasa, que descompone el H2O2 en H2O y O2.La enzima se encuentra en la mayoría de las bacterias que contienen citocromo. La excepciónes Streptococcus que no puede descomponer el H2O2. El test permite diferenciarStaphylococcus, Micrococcus y Listeria, todos ellos catalasa +, de Streptococcus, catalasa -.Procedimiento Prueba de la catalasaa) Ponga sobre el portaobjeto una gota de H2O2b) Con un palillo desechable tome la colonia en estudio y agréguela a la gota en el portaobjeto.La aparición rápida y sostenida de burbujas (antes de 20 segundos) indica test (+).Precauciones: no tocar ni sacar agar sangre al tomar la colonia ni usar asa de platino, ya queestas sustancias dan falsos positivos.c) Anote lo observado y compare con su resultado del Gram.d) Elimine el portaobjeto y el palillo en los recipientes respectivosb. Coagulasa: Busca la presencia de la enzima coagulasa producida por Staphylococcusaureus.Procedimiento Prueba de la Coagulasa:a) Tome una tira reactiva y agregue una gota de cada reactivo en las zonas marcadas.b) Con un palillo plástico tome varias colonias desde el agar.c) Mezcle con la solución de anticuerpos del Test de aglutinación (plasma de conejo).
  • 54d) Espere unos minutos agitando constantemente con el palillo.e) Si existe la presencia de coágulos (apariencia de “leche cortada”), la reacción es positiva. Sise ve siempre homogéneo, la reacción es negativa.f) Anote lo observado e identifique al patógeno presente en su muestra.c. Test de CAMP para StreptococcusPermite confirmar la presencia de Streptococcus tipo B por la producción de una zona dehemólisis característica cuando crece en la proximidad de Staphylococcus aureus, lo que sedenomina “punta de lanza” (Ver figura adjunta)Procedimiento Test de CAMP:a) Sobre una placa de agar Sangre realice con el asa una única estría en el centro a partir de uncultivo de Staphylococcus aureus.b) Perpendicular a la estría original, realice con el asa una o más estrías con su muestra clínica.c) Incubar a 37ºC por 24 horas.d. Identificación de Streptococcus β hemolítico por aglutinación con látex:Consiste en la identificación de los distintos grupos de Streptococcus β hemolítico grupo A, B,C, D, F y G.Procedimiento prueba de aglutinación con látex:a) Agregue 1 gota de cada reactivo de látex en cada uno de los 6 pocillos de la tarjeta deaglutinación.b) Tome dos a tres colonias β hemolíticas que quiera identificar. Recuerde que debenpertenecer a un cultivo puro y al Gram ser cocáceas gram (+) en cadenas.
  • 55c) Mezcle y agite circularmente las colonias en cada pocillo de la tarjeta durante 1MINUTO4. Realice el Test de difusión por disco. Sensidiscos.a) Con el asa tome una colonia aislada desde la placa de Agar sangre y siémbrela en el tubo desuero fisiológico estéril hasta que quede turbio. Compare con el standard 0,5 Mac Farland.b) Tome la tórula estéril y (sin flamearla!!!!) sumérjala en el caldo recién inoculado. Flamee laboca del tubo y cierre.c) Deslice la tórula sobre toda la superficie del agar Müller-Hinton (Staphylococcus) o agarMüller-Hinton Sangre (Streptococcus). Al terminar elimine la tórula en el recipiente apropiado.d) Tome la pinza estéril y flaméela brevemente. Tome con cuidado cada uno de los sensidiscos(5 en total) y distribúyalos homogéneamente en la placa, cuidando de que no quedendemasiado cerca del borde de ella ni demasiado cerca entre sí.e) Incubar a 37ºC por 24 horas.RECUERDE que la elección de los sensidiscos dependerá del patógeno que haya identificadoen su muestre clínica.Nota: Asegúrese de flamear las pinzas cada vez que tome un sensidisco y enfríe en la tapa dela placa antes de sacar uno. NO FLAMEE los frascos con los sensidiscos.Trate de no tocar el agar al poner los discos, sólo déjelos caer desde cerca y presiónelossuavemente contra el agar con la pinza (sin hundirlos!!!).Lectura e interpretación del Test de Sensidiscosa) Observe los halos de inhibición y mida el diámetro de estos para determinar si la bacteria es“susceptible”, “intermedio” o “resistente” con respecto a los antibióticos dispuestos en el agar.Compare con la Tabla adjunta, según corresponda.b) Anote sus observaciones.5. Procesamiento de una muestra clínica de catéter venoso con técnica de Makia) En una placa de Agar Sangre, siembre con técnica de Maki la muestra de catéter venosoentregada.Utilice pinza estéril e incube a 37ºC por 24 hrs.b) Describa macroscópicamente las colonias obtenidas.c) Observe si se trata de un cultivo puro. Realice recuento de colonias bacterianas.
  • 56 d) Realice una tinción de Gram y describa microscópicamente su muestra. Observe al microscopio con aumento 100X oil. e) Realice las pruebas bioquímicas correspondientes según la tabla de identificación de bacterias Gram positivo. II. FLORA NORMAL 1. Para el estudio de flora normal tómese una muestra bucoranfingea, nasal o de piel con una tórula estéril previamente humedecida con suero fisiológico y siembrela en agar sangre. Sólo el primer cuadrante se siembra con la tórula y el resto con asa previamente flameada para poder obtener colonias aisladas. Incube esta placa a 37ºC por 24 horas. 2. Escoja la colonia aislada y más representativa de su cultivo. Descríbala macroscópicamente y microscópicamente. 3. Sugiera un posible agente presente en su muestra, dependiendo, por ejemplo de la zona de la muestra, características de crecimiento y sus observaciones. Interpretación de los halos de Inhibición para Staphylococcus spp (Agar Mueller – Hinton)DROGA CONTENIDO SENSIBLE INTERMEDIA RESISTENTE Observaciones DEL DISCO (Halo en mm) (Halo en mm) (Halo en mm)Oxacilina 1 µg ≥13 11-12 ≤10 Para S. aureusEritromicina 15 µg ≥23 14-22 ≤13Clindamicina 2 µg ≥ 21 15-20 ≤14Vancomicina 30µg ≥15 - - Interpretación de los halos de Inhibición para Streptococcus β -hemolíticos y Enterococcus (Mueller-Hinton con sangre de cordero) DROGA CONTENIDO SENSIBLE INTERMEDIA RESISTENTE DEL DISCO (Halo en mm) (Halo en mm) (Halo en mm) Penicilina 10 unidades ≥ 28 20-27 ≤19 Eritromicina 15 µg ≥21 16-20 ≤15 Clindamicina 2µg ≥19 16-18 ≤15 Vancomicina 30µg ≥17 - -
  • 57Interpretación de los halos de Inhibición para Streptococcus pneumoniae (Mueller-Hintoncon sangre de cordero)DROGA CONTENIDO SENSIBLE INTERMEDIA RESISTENTE DEL DISCO (Halo en mm) (Halo en mm) (Halo en mm)Penicilina 1 µg de oxacilina ≥20Eritromicina 15 µg ≥21 16-20 ≤15Trimet/sulfame 1.25/25.75µg ≥19 16-18 ≤15Vancomicina 30µg ≥17 - -
  • 58 TRABAJO PRÁCTICO N°4 FISIOTAXONOMÍA DE BACTERIAS GRAM NEGATIVO El grupo de las Enterobacterias, nombre común utilizado para referirse a la FamiliaEnterobacteriacea,incluye a bacilos Gram (-), aerobios y anaerobios facultativos, la mayoría de ellos móvilesmediante flagelos perítricos, que como característica microbiológica fenotípica común tienen lacapacidad de fermentar la glucosa y reducir los nitratos a nitritos.Tienen como habitat el intestino de animales inferiores y del hombre. Tienen además unaamplia distribución en el ambiente, se encuentran en el suelo, agua, plantas y algunas especiesde esta familia, como Proteus, cumplen una función ecológica importante: inician en elambiente la degradación de la materia orgánica y por este comportamiento se relaciona con unciclo de vida netamente ambiental, son saprófitos.Entre las numerosas especies que constituyen esta familia, encontramos algunos grupos que ensu relación con el hospedero humano son comensales, como es el caso de Escherichia coli, unconstituyente importante de la microbiota intestinal normal aerobia, especialmente a nivel de laporción distal del intestino delgado y fundamentalmente a nivel del intestino grueso. En estalocalización la presencia de E. coli resulta en un beneficio para el hospedero, pues como partede su metabolismo se sintetizan vitaminas y también participa en la degradación de ácidos ysales biliares. Debido a la presencia masiva de E. coli a nivel intestinal, su detección se utilizacomo marcador de contaminación fecal, por ejemplo se ha establecido un Índice coli paraevaluar la calidad microbiológica del agua potable o de alimentos. Si el índice coli sobrepasa lanorma considerada aceptable significa que existe contaminación fecal e indirectamente sededuce que el agua o el alimento, según sea el caso, puede contener patógenos intestinales.Otros integrantes de este grupo en cambio son patógenos intestinales como el géneroSalmonella, Shigella, Yersinia y un subgrupo de E. coli con factores de virulencia específicosque afectan el intestino y por ello se denominan E. coli diarreogénicos. Estos grupos o génerosbacterianos causan infecciones gastrointestinales que pueden expresarse clínicamente comodiarrea acuosa, diarrea con sangre (también denominada diarrea enterocólica o síndromedisentérico) y en algunos casos a partir de la infección intestinal estas bacterias pasan al
  • 59torrente sanguíneo y se puede producir una infección sistémica o bacteremia, como porejemplo la fiebre tifoidea.En el laboratorio de Microbiología el análisis de una muestra clínica o ambiental sigue, por logeneral, la siguiente secuencia:a) Toma de muestrab) Siembra y obtención del microorganismo aislado (cultivo puro)c) Observación de morfología macroscópicad) Tinciones y observación de morfología y agrupación microscópica.e) Identificación fisiotaxonómica (reacciones metabólicas específicas) con batería bioquímicaconvencional y Sistema estandarizado API 10Sf) Estudios de sensibilidad a agentes antimicrobianos.La fisiotaxonomía bacteriana estudia el comportamiento de las bacterias vivas frente a distintosmedios de cultivo a través de las alteraciones que producen en estos medios. Estas alteraciones,son producidas por enzimas específicas de las diferentes bacterias, ya que no todos losmicroorganismos poseen los mismos requerimientos nutricionales y las mismas rutasmetabólicas. De este modo esta técnica taxonómica se basa principalmente en la detección de:a) Utilización de distintas fuentes de carbono.b) Formación de productos finales.c) Presencia de enzimas.d) Sensibilidad a productos químicos o antibióticos.La identificación de una cepa bacteriana aislada puede realizarse utilizando diferentes ensayosbioquímicos que generalmente determinan la actividad de una vía metabólica (conjunto dereacciones químicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que labacteria al crecer transforma o no.Las pruebas o ensayos bioquímicos, son pruebas simples que se han desarrollado parademostrar en forma clara una característica bioquímica como la presencia o ausencia de unadeterminada actividad enzimática, grupo de enzimas o vía metabólica, crecimiento a unadeterminada temperatura, crecimiento en presencia de inhibidores, etc. No significan deninguna manera un estudio profundo del metabolismo bacteriano.Para llevarlas a cabo, se puede utilizar diversos sistemas de trabajo (medio de cultivo,indicador, revelador, etc.) que puede ser diferente aún para el mismo ensayo si se trata dedistintos microorganismos. Por ejemplo, se debe suplir con factores de crecimiento el medio de
  • 60cultivo para estudiar la fermentación de distintos azúcares cuando se sabe que elmicroorganismo en estudio es exigente.A la determinación de la especie se puede llegar según diversos sistemas (manuales deidentificación, comerciales, etc.). Los sistemas comerciales utilizan modificaciones de laspruebas bioquímicas convencionales, ya sea sustratos deshidratados, tiras de papel de filtroimpregnadas en reactivos o pequeños compartimentos con medios listos para sembrar. Entodos los casos se emplean códigos numéricos para la interpretación de resultados.I. Batería bioquímica convencional para diagnóstico microbiológico1. Agar tendido corriente: medio sólido nutritivo, que permite observar posible pigmentaciónen las colonias.2. Agar Urea de Christensen: medio sólido en el que se puede observar la presencia de laenzima Ureasa, ya que contiene además de nutrientes básicos: • Triptona. • Urea. • Indicador de pH fenolftaleina.Esta prueba se basa en la capacidad de algunas bacterias, que poseen la enzima ureasa, dedegradar urea a amoníaco y CO2. Esta reacción es fácilmente evidenciable, porque el pH varíahacia alcalino debido al efecto del amoníaco. Este cambio se observa por viraje del indicadorde pH como Fenolftaleína (Figura 1)
  • 61Figura 1: resultados medio Urea Figura 2: resultadosmedio Citrato3.- Agar Citrato: Este medio de cultivo contiene, además de sales minerales: • Fosfato de amonio. • Citrato de sodio, como única fuente de carbono. • Indicador de pH azul de bromo timol (verde a pH neutro, azul a pH alcalino).
  • 62En este medio sólo pueden desarrollarse aquellas bacterias que poseen la enzima CitratoPermeasa, la que les permite transportar el citrato a través de la membrana citoplasmática.Una vez en el interior de la célula, el ión citrato es metabolizado a través del ciclo de los ácidostricarboxílicos (Figura 2)4. Agar TSI: Las bacterias pueden utilizar azúcares (hidratos de carbono) a través de variasrutas metabólicas. Los productos finales de estas reacciones dependerán de cada bacteria, delazúcar utilizado y de la ruta metabólica. En general estos productos serán ácidos (fórmico,pirúvico, láctico, etc.) y gases (CO2, H2). Existen muchos medios de cultivo que se handiseñado con el objeto de detectar la producción de ácido y gas a partir de distintos azúcares.El Agar TSI (Triple Sugar Iron) es un medio rico que contiene los nutrientes necesarios para elcrecimiento de las bacterias y que permite visualizar la utilización de azúcares. Contieneademás de nutrientes como extracto de carne, extracto de levadura, peptona, etc: • Glucosa al 0,1% • Lactosa al 1,0% • Sacarosa al 1,0% • Citrato de amonio. • Hierro. • Indicador de pH rojo de fenol (Amarillo pH ácido; Rojo pH alcalino).a. Si la bacteria inoculada es fermentadora sólo de glucosa usará ésta y se obtiene sólo unapequeña cantidad de ácido, la que en las primeras 8 a 12 horas de incubación es suficiente paraconventir ambas porciones (tendido y profundo) a un color amarillo. Dentro de las próximashoras, sin embargo, la glucosa sobrante es completamente agotada y la bacteria comienza ladegradación oxidativa de los aminoácidos en el tendido del tubo, donde hay oxígeno, lo quelleva a la liberación de aminas que neutralizan las pequeñas cantidades de ácido presente en eltendido, y en 18 a 24 horas este tendido cambia a pH alcalino y vuelve a color rojo. En laporción profunda (anaeróbica) del tubo, la degradación de aminoácidos es insuficiente paraneutralizar el ácido formado, y el medio permanece amarillo. Si el TSI es inoculado con unorganismo fermentador de glucosa y lactosa o sacarosa, aún cuando la glucosa se agota en lasprimeras 8 a 12 horas, la fermentación continúa ya que el organismo es capaz de usar lactosa osacarosa. Así, a las 18 a 24 horas, ambas porciones están amarillas.
  • 63b. Si se produce gas se observará como quiebres en el agar o separación de la columna de agardel fondo del tubo.c. Para la detección de H2S, el cual es incoloro, el medio incluye un indicador. El tiosulfat desodio es la fuente de átomos azufre en la mayoría de los medios usados para la producción deH2S. Sales de fierro (Sulfato ferroso y citrato férrico amoniacal) incorporadas en el medio decultivo reaccionan con sulfuro de hidrógeno para producir un precipitado negro insoluble(sulfuro ferroso) este reacciona con la sal de hierro dando sulfato ferroso, un compuestoinsoluble de color negro. (Figura 3)Figura 3: resultados medio TSIC: Control negativo1: Desaminación (+), fermentación glucosa, lactosa y sacarosa (-), producción de H2S (-).2: Desaminación (+), fermentación glucosa (+), lactosa y sacarosa (-), producción de H2S (-).3: Desaminación (+), fermentación glucosa (+), lactosa y sacarosa (-), producción de H2S (+).4: Desaminación (+), fermentación glucosa, lactosa y sacarosa (+), producción de H2S (-).5: Desaminación (+), fermentación glucosa, lactosa y sacarosa (+), producción de H2S (+).5. Agar LIA: Las distintas bacterias poseen enzimas inducibles que pueden actuar sobrealgunos aminoácidos, desaminándolos o decarboxilándolos. Ejemplo de estas reaccionesenzimáticas son: decarboxilación de Lisina y desaminación de Lisina.Otro efecto de las bacterias sobre aminoácidos azufrados es la remoción del grupo -hSH2,produciendo H2S (reacción que se observa también en el medio TSI).Este medio contiene además de nutrientes como peptona y extracto de levadura: • Aminoácido lisina
  • 64 • Aminoácidos azufrados • Glucosa • Citrato de hierro y amonio • Indicador de pH púrpura de bromocresol (Amarillo a pH ácido, morado a pH alcalino).a. La bacteria primero utiliza la glucosa produciendo ácido por lo que el pH baja y el indicadorvira a amarillo. Si la bacteria NO PRODUCE lisina decarboxilasa se mantendrá estacoloración amarilla (reacción K/A, negativa). Si la bacteria PRODUCE la enzima lisinadecarboxilasa, la cual remueve el grupo COOH de la lisina dando como producto CO2 y unadiamina (alcalina), entonces el indicador vira nuevamente hacia el lado alcalino y se revierte elviraje de amarillo a morado (reacción K/K, positivo). Si la bacteria es capaz de desaminar a lalisina, la superficie se verá roja y el fondo amarillo (reacción R/A).b. Si la bacteria produce H2S éste reacciona con la sal de hierro formando sulfuro ferroso(negro). (Figura 4) Figura 4: resultados medio LIA6. Medio MIO: Permite observar motilidad.a. Si el crecimiento bacteriano se observa como el enturbamiento completo del medio, lareacción es positiva. Si sólo se limita al pinchazo, es negativa.b. También es posible observar la presencia de la enzima ornitina descarboxilasa, que participaen el metabolismo de varios aminoácidos en algunas bacterias. La reacción positiva se observapor el color morado del tubo; en cambio, si la reacción es negativa el medio se torna amarillo(puede ponerse morado el fondo).
  • 65c. Además, se puede observar la presencia de indol, para lo cual hay que agregar una gota dereactivo de Kovacs. En este caso, la reacción positiva será la aparición de un aro rojo sobre lasuperficie del medio.(Figura 5) Figura 5: resultados medio MIO (Los pares están organizados sin y con reactivos de Kovacs) 1: Motilidad (-), ornitina descarboxilasa (-), indol (+) (anillo fucsia) 2: Motilidad (+), ornitina descarboxilasa (+), indol (-) (anillo amarillo) 3: Motilidad (+), ornitina descarboxilasa (+), indol (+).II. Sistemas comerciales usados en la identificación de Enterobacterias2.1- API 10S:Sistema de identificación estandarizado para Enterobacterias y otros bacilos Gram negativos,como algunos no fermentadores (Pseudomonas, Acinetobacter) que utiliza 11 pruebasbioquímicas que usan sustratos deshidratados.2.2- SensIdentEs un sistema semiautomatizados que permite identificar bacilos gram negativos fermentadoresy no fermentadores de glucosa. La identificación se hace mediante pruebas bioquímicas las quevienen liofilizadas en placas de microtitulación y se rehidratan con la suspensión bacteriana.2.3 VITEKEs un sistema automatizado (Bio-Merieux). La identificación de los bacilos gram negativosfermentadores y no fermentadores de glucosa se hace a través de pruebas bioquímicas que
  • 66vienen incluidas en tarjetas de identificación. Los tiempos de incubación varían entre 2 y 15horas. El sistema vitek determina si cada pocillo es positivo o negativo midiendo la turbidezmediante un lector óptico. Cuando finaliza el periodo de incubación, las reacciones sonanalizadas automáticamente y la identificación es impresa.3. OxidasaBusca la presencia de la enzima citocromo oxidasa y consiste en colocar directamente lacolonia sospechosa en el extremo de una varilla que contiene un reactivo oxidable. La reacciónes positiva cuando aparece un color púrpura después de 1 min.Esta prueba es positiva para Neisserias y para bacilos Gram negativos no fermentadores y esnegativa para Enterobacterias.4. Susceptibilidad a AntibióticosLos antibióticos son agentes terapéuticos producidos por organismos vivos, que inhiben odestruyen a los agentes infecciosos. Los ensayos de susceptibilidad están indicados para apoyarla terapia antimicrobiana de tratamiento en procesos infecciosos por bacterias en las que laidentidad del microorganismo no es suficiente para predecir en forma confiable sususceptibilidad. Estos ensayos son a menudo indicados cuando se piensa que el organismocausante pertenece a una especie capaz de mostrar resistencia a los agentes antimicrobianosmás comúnmente usados.Los métodos de susceptibilidad antimicrobiana o antibiogramas son métodos que determinan invitro la sensibilidad de los microorganismos a una variedad de agentes antimicrobianos bajocondiciones específicas y estandarizadas.
  • 67Actividades PrácticasObjetivos1. Realizar pruebas bioquímicas convencionales para la identificación de bacterias Gramnegativo.2. Reconocer alteraciones producidas en los medios de cultivo, por la presencia de productosintermediarios o finales, debido a la acción bacteriana.3. Realizar test comercial API 10S, para la identificación de bacterias Gram negativo.4. Realizar prueba de susceptibilidad antimicrobiana por difusión en agar.5. Identificar el agente etiológico (Género y especie) presente en una muestra clínica.Actividades1. Observe las placas de Agar Mac Conkey sembradas y describa las colonias bacterianas.Verifique si se trata de cultivos puros.2. Realice una tinción de Gram a su muestra. Observe al microscopio y describa.3. Siembra de Batería Bioquímica Convencional y sistema de identificación comercial API10S. No olvide anotar el número de muestra.4. Realice prueba de susceptibilidad (Antibiograma).3a. Pruebas bioquímicas convencionalesCada grupo contará con una batería convencional compuesta por 6 tubos. Para sembrar labatería se debe seguir las siguientes indicaciones:a. Flamear el asa para su esterilización.b. Tomar una colonia aislada de la placa de agar MacConkey con la muestra a estudiar.
  • 68c. Flamear la boca del tubo con caldo estéril o suero fisiológico, sumergir el asa con cuidado yagitar. Repetir hasta una densidad igual a 0.5 Mac Farland.d. Flamear el asa para su esterilización. El caldo recién sembrado será utilizado como inóculopara sembrar toda la batería.e. Antes de empezar, anotar los colores de los distintos medios. Esto le servirá para hacer unacomparación con el resultado final.f. Para cada tubo de la batería el asa debe ser esterilizada previamente y enfriada en las paredesdel tubo antes de sumergirla en el caldo inoculado.Posteriormente siembre en los medios teniendo en cuenta que:1. Los medios semitendidos (Agar TSI y LIA) se deben sembrar en profundidad y ensuperficie, es decir, atravesándolos hasta el fondo con el asa en punta, y luego en zig-zag por lasuperficie.2. Los medios tendidos (Agar Citrato, Agar Urea y Corriente) se siembran sólo en la superficie,es decir, se realiza un zig-zag con un asa convencional (en argolla).3. Los caldos se siembran agitando el asa con el inóculo dentro del tubo con el medio.4. Los medios semisólidos (agar MIO) se siembran sólo en profundidad con un asa en punta,pinchando el agar hasta la mitad del tubo aproximadamente.LECTURA E INTERPRETACIÓN DE LA BATERÍA.Una vez que la batería es sembrada, se incuba a 37ºC para que los microorganismos crezcan yproduzcan los cambios en los distintos medios. Posteriormente los resultados se “leen” y secomparan con las Tablas de Resultados adjuntas.Lectura Batería BioquímicaAgar UreaReacción positiva : El agar se torna fucsia.Reacción negativa : El agar no cambia de color.Agar CitratoReacción positiva : Viraje del indicador de pH a color azul (alcalino).Reacción negativa : El agar permanece de color verde (neutro).
  • 69Agar TSIUtilización de glucosa : Superficie roja (pH alcalino). Se anota KFondo amarillo (pH ácido). Se anota AUtilización de lactosa : Fondo y superficie amarilla (pH ácido). Se anota A/AReacción negativa : El tubo no varía de color. Se anota K/K.Producción de gas : Ruptura de la columna de agar. Indica reacción positivaProducción de H2S : Ennegrecimiento del agar. Indica reacción positivaAgar LIADecarboxilación de lisina positivo : todo el tubo morado (alcalino). Se anota K/KDecarboxilación de lisina negativo : superficie morada (alcalina). Se anota como Kfondo amarillo (ácido). Se anota como ADesaminación de lisina positivo : superficie roja. Se anota Rfondo amarillo. Se anota ADesaminación de lisina negativo : no hay cambio. Se anota A/AProducción de H2S : ennegrecimiento del agar. Indica reacción positivaMedio MIOMotilidad positiva : crecimiento bacteriano produce opalescencia del medio.Motilidad negativa : crecimiento bacteriano limitado al pinchazo con el asa.Presencia de indol : reacción positiva, aparición de un aro rojo en la superficie del medio, alagregar el reactivo de Kovacs.Presencia enzima ODC: el medio se observa de color morado, indicando reacción positiva : el medio se torna amarillo (puede ponerse morado el fondo), indicando reacción negativa.Agar Corriente : reacción positiva si existe coloración de las colonias.
  • 70Resultados mas frecuentes de algunas pruebas bioquimicas para la familia ENTEROBACTERIACEAE Glucosa Lactosa Sacarosa Manitol Sorbitol Gelatina Citrato H2S Motilidad Indol V-P R-M Pigmento UreaEscherichia coli AG + V + + - - - +/- + - + - -Shigella flexneri A - V V - - - - - - - + - -Shigella dispar - V - - - - - - - + - + - -Salmonella typhi A - - + + - V + + - - + - -Salmonella paratyphi A AG - - + + - - - + - - + - -Salmonella paratyphi B AG - - + + - + + + - - + - -Salmonella gallinarum A - - + + - + +/- - - - + - -Citrobacter freundii AG + +/- + + - + +/- + - - + - -Klebsiella pneumoniae AG + + + + - + - - - + - - +Enterobacter aerogenes AG + + + + -/+ + - + - + - - -Enterobacter hafniae AG V V + - - V - + - +/- -/+ - -Serratia marcescens V - + + + + + - + - + -/+ + VSerratia rubidae AV + + + - + + - +/- - + -/+ + VProteus vulgaris AV - + - - + V + + + - + - +Proteus mirabilis AG - V - - + (+) + + - -/+ + - +Pseudomonasaeruginosa* - - - - - + + - + - - - + -Alcaligenes faecalis* - - - - - - V - + - - - - -* No pertenecen a la familia EnterobacteriaceaeAG = Acido-Gas (utilización del substrato y producción de gas)V = Variable(+) = Positivo después de 3 ó 4 días+/- = Generalmente positivo-/+ = Generalmente negativo
  • 71 TABLA I Fermentación de Glucosa Positivo Fermentación de Lactosa Positivo Lisina Desaminasa Negativo Producción de H2S Positivo Negativo Indol Negativo Lisina Descarboxilasa Positivob Lisina Descarboxilasa Indol Positivo Negativo Positivo NegativoSalmonella Arizonaa Citrobacter freundii Escherichia coli Enterobacter spp. Klebsiella spp. Nota : Todos producen gas de glucosa. Todos son Citrato positivo. Excepto E. coli Todos son Ureasa negativo. Excepto Klebsiella, que puede dar positivo al 2do o 3er día a : ciertas especies de S. Arizona Fermentan la Lactosa lentamente b : ciertas especies de E. coli son Lisina Descarboxilasa negativo.
  • 72 TABLA II Fermentación de Glucosa Positivo Fermentación de Lactosa Negativo Lisina Desaminasa Positivo Producción de H2S Positiva Negativo Lisina Descarboxilasa Negativo Lisina Descarboxilasa Negativo Indol Indol Positivo Citrato Positivo Negativo Negativo PositivoProteus vulgaris Proteus mirabilis Proteus morganii Proteus rettgeri Providencia spp. Nota : P. vulgaris y P. mirabilis pueden o no utilizar Citrato Todos producen un poco de gas de Glucosa Todos son Ureasa positivo. Excepto Providencia
  • 73 TABLA III Fermentación de Glucosa Positivo Fermentación de Lactosa Negativo Lisina Desaminasa Negativo Producción de H2S Positiva Negativa Lisina Descarboxilasa Lisina Descarboxilasa Positivo Negativo Positivo Negativo Indol Citrato Positivo Indol Negativo Citrato Negativo Citrato Positivo Positivo Negativo Citrobactera Indol Serratia Citrato Citrato Negativo Positivo Negativo Negativo Positivo Salmonella Paratyphi A Shigella spp.Edwarsiella Shigella spp. Yersinia enterocolitica Salmonella Typhi Salmonella Paratyphi B Salmonella Arizona Nota : Todos son Ureasa Negativo. Excepto algunas cepas de Yersinia enterocolitica. No producen gas de Glucosa Shigella, Serratia, Salmonella Typhi y Yersinia enterocolitica. El resto produce gas de Glucosa a: Ciertas especies de Citrobacter son Lactosa Negativo y pueden ser Indol Positivo o Negativo
  • 743b. Siembra y Lectura de API 10 S1. Prepare una suspensión bacteriana en 5 ml de suero fisiológico, hasta una medida dedensidad igual a 0.5 Mac Farland (estándar)2. Con una pipeta Pasteur estéril, inocule cada una de las celdas de la galería hasta el menisco,tal y como se muestra en la figura adjunta (línea azul). Evite la formación de burbujas en losmicropocillos, pues interfiere con sus resultados.3. Llene la prueba CIT hasta la cúpula4. En las pruebas LDC, ODC, URE y H2S, después de inocular, llene las cúpulas con aceitemineral, para crea un ambiente microaerofílico.5. Coloque la galería en la cámara de incubación, a la que debe colocarle previamente aguapara crear un ambiente húmedo. Que NO quede un exceso6. Cierre la cámara e incube 18 a 28 horas a 37°C.7. Después de la incubación, lea aquellos test de reacciones espontáneas:TEST REACCIONES POSITIVO NEGATIVOONPG Beta galactosidasa Amarillo IncoloroGLU Fermentación Amarillo,amarillo/ Azul, azul/verdoso /oxidación glucosa grisARA Fermentación/oxidac Amarillo Azul, azul/verdoso ión arabinosaLDC Enzima lisina Naranja Amarillo descarboxilasaODC Enzima ornitina Rojo/naranja Amarillo descarboxilasaCIT Utilización del Azul/verde, azul verde pálido/amarillo citratoH2S Producción de H2S Depósito/línea negra Incoloro/grisURE Enzima ureasa Rojo/naranja Amarillo
  • 758. Lea aquellos test que requieren agregar reactivos:TDA (Triptofano-desaminasa): agregue una gota del reactivo TDA. Coloración marrón oscuraindica positivo.IND (Producción de indol): Agregue una gota del reactivo de James. Coloración rosa indicapositivo.NO2 (Producción de nitritos): Agregue una gota del reactivo NIT1 y NIT 2 en el tubo GLU.Espere 2 a 3 minutos. Una coloración roja indica positivo.9. Realice aparte el test de oxidasa.10. Registre todas las reacciones en la hoja de resultados que le entregará su profesor.11. Codifique el conjunto de reacciones obtenidas en un perfil numérico. Sume los números decada grupo si las reacciones son positivas Se obtienen 4 dígitos que corresponden al perfilnumérico. Busque el perfil numérico en el catálogo que tendrá su profesor o en un software.12. Registre sus resultados en la cartilla y guárdelo para pegarlo en su informe4. Test de susceptibilidad a los agentes antimicrobianos, método de difusión en agar oKirby-BauerSe utiliza para determinar la sensibilidad in vitro de las bacterias a los distintosantimicrobianos. Para que los resultados sean confiables y reproducibles es necesarioestandarizar algunas condiciones de laboratorio:a) Concentración de las bacterias que se siembran: Requiere uso de estándares de turbidez:Mac Farland 0.5b) Medio de cultivo utilizado: Agar Mueller-Hintonc) Concentración del antimicrobiano en el disco: varía para cada antimicrobiano.d) Temperatura (37°C), tiempo de incubación (16-24 horas) y atmósfera de incubación (en O2)
  • 76 Una vez que se obtiene una colonia aislada (es absolutamente necesario que no existamezcla de bacterias), se prepara una suspensión bacteriana a una concentración conocida (1 a 2x 108 UFC/mL) llevando a una turbidez equivalente a un Mac Farland 0.5.a. Tome una tórula estéril y (sin flamearla!!) sumérjala en el caldo con el inoculo. Flamee laboca del tubo y cierre.b. Deslice la tórula mojada sobre toda la superficie del agar Müller-Hinton. Una vez quetermine, elimine la tórula.c. Deje secar la placa con la tapa ligeramente entreabierta.d. Tome la pinza y flaméela brevemente. Tome con cuidado cada uno de los sensidiscos ydistribúyalos homogéneamente en la placa, cuidando de que no queden demasiado cerca delborde de la placa ni demasiado cerca entre si.e. Incube a 37ºC durante 16 hrs.En este tiempo se produce la difusión del antimicrobiano en el agar y si la bacteria es sensible,se produce la inhibición del desarrollo en forma de halo. Si la bacteria es resistente habrádesarrollo hasta el disco mismo (6mm) o con halos de inhibición disminuidos.Están definidos para cada grupo de bacterias los halos de inhibición que permitirán clasificar alas bacterias en Sensibles, Intermedias o Resistentes.f. Observe y mida el diámetro del halo formado alrededor de los sensidiscos.NOTA: Los diversos tamaños de los halos de inhibición producidos por antibióticosdiferentes para una misma especie bacteriana NO PUEDEN SER COMPARADOSENTRE SI. Por ejemplo: un halo de inhibición de 30mm para Penicilina no indica mayorsensibilidad que un halo de 20 mm para Tetraciclina.
  • 77 TRABAJO PRÁCTICO N°5 LEVADURAS Y HONGOS FILAMENTOSOSOBJETIVOS1.- Conocer y caracterizar la morfología macroscópica de las colonias de hongos unicelulares(levaduras) y pluricelulares (filamentosos).2.- Conocer la morfología microscópica de hongos unicelulares (levaduras) y pluricelulares(filamentosos).MARCO TEÓRICO El ser humano está constantemente expuesto a la propagación de organismoseucariontes como son los hongos. La mayoría tolera esta exposición sin secuelas, pero algunosdesarrollan una hipersensibilidad alérgica. Esto porque un individuo sano tiene una resistenciainnata a la colonización de hongos y porque la virulencia inherente en estos microorganismo esmuy baja. Sin embargo, en individuos inmunosuprimidos, la infección puede desencadenarenfermedades que, si no son debidamente controladas, pueden llevar a un resultado fatal parael hospedero. A los hongos que se aprovechan de la debilidad del hospedero se les denominahongos oportunistas. Hongos como Candida (Candida albicans), Aspergillus (Aspergillusfumigatus) y varios Zigomicetos (Rhizopus arrhizus) son ejemplos de ellos. TALO (cuerpo macroscópico) Unicelular Pluricelular Levaduras Micelio Colonias semejantes a las Sifonado Septado bacterianas Colonias algodonosas, lanosas, aterciopeladas
  • 78 Tanto las levaduras como los hongos filamentosos se siembran en agar Sabouraud, cuyocontenido en glucosa es mayor que el de otros medios de cultivo y el pH es ácido (pH 5,6) paraimpedir la contaminación bacteriana. Generalmente se incuban a 25-30°C por un tiempo quedepende de la especie fúngica (levaduras y hongos ambientales, 48 horas aproximadamente,hongos dermatofitos, 15-30 días). Hongos Unicelulares (Levaduras) Las levaduras son organismos fúngicos unicelulares que generalmente se reproducenasexualmente por yemación. Los criterios usados para el diagnóstico son fundamentalmentemorfológicos (macroscópicos y microscópicos).Las levaduras normalmente prosperan en hábitat con abundante azúcar, tales como frutas,flores e incluso la corteza de los árboles. Algunas de ellas viven en simbiosis con animales,especialmente insectos. Las levaduras más importantes desde el punto de vista comercial sonlas cepas cerveceras y panaderas de la especie Saccharomyces cerevisiae.Candida spp.: En ciertas condiciones C. albicans, C. tropicalis, C. kefyr, y otras, son parte dela flora normal de los humanos. Pueden aislarse de las superficies mucosas sanas de lacavidad oral, vagina, tracto gastrointestinal y área rectal. Sin embargo, cuando se rompe labarrera mucosa, los microorganismos pueden llegar a la sangre e invadir pulmones, bazo,riñones, hígado, corazón y cerebro. Este género se caracteriza por un aspecto macroscópico desu colonia opaco, de color cremoso y consistencia pastosa (Figura 1)Figura 1: Observación microscópica de una muestra de esputo en que se ponen de manifiestolas levaduras en yemación y las pseudohifas de las especies de Candida.
  • 79Hongos Filamentosos:Estos pueden ser sifonados (aseptados) o septados. Los hongos sifonados son generalmentemultinucleares (ej. Mucoral) y los hongos septados presentan hifas con tabiques que sonprolongaciones de la membrana citoplasmática (ej. Aspergillus, Dermatophytos). 1) Hongos septados Estos hongos pueden presentarse como contaminantes ambientales (ej. Penicillium), comopatógenos oportunistas (ej. Aspergillus) y como patógenos (ej. Dermatophytos).Aspergillus spp.: Los microorganismos que pertenecen a éste género son extremedamentefrecuentes en el medio ambiente y de crecimiento rápido (48 hr). En contraste con la mayoríade las infecciones producidas por Candida, la aspergilosis se adquiere de fuentes exógenas.Estos microorganismos se identifican por sus características morfológicas presentandocolonias aterciopeladas, algodonosas o pulverulentas, coloreadas (crema, verde, café ynegras). Microscópicamente presentan hifas septadas de las que nace una prolongaciónno septada (conidóforo), el cual se dilata en su extremo distal (vesículas) rodeándose allíde células conidiogénicas (fiálides). Las fiálides producen conidios los que se disponen enforma de cadenas. El conjunto vesícula, fiálide y conidios se conoce como “cabezaaspergilar” (Ver Figura 2). De las aproximadamente 900 especies de Aspergillus descritas, A. fumigatus y A. flavusson las que con mayor frecuencia se asocian a enfermedad invasiva. Son ubicuitarios en elambiente y no forman parte de la flora normal del ser humano, aunque pueden producirsecolonizaciones transitorias. La aspergilosis está asociada con problemas respiratorios como ladilatación crónica de la vía aérea hasta un colapso de un segmento pulmonar. Figura 2: Estructura microscópica de especies de Aspergillus
  • 80Penicillium: Estos microorganismos son ubicuitarios en el medio ambiente y suelen aislarseen muestras de aire y como contaminantes en los cultivos de laboratorio, desarrollándose en 3-4 días. En 1929, Sir Alexander Fleming observó que una especie de Penicillium habíacontaminado su cultivo de Staphylococcus aureus, destruyendo las bacterias que seencontraban inmediatamente en contacto con el hongo. Esta observación casual llevó aldescubrimiento de la penicilina.Los hongos que petenecen a este género se caracterizan por la producción deconodióforos en el extremo de hifas septadas ramificantes. Cuando se alojan ensuperficies, como una placa de agar, germinan y crecen rápidamente produciendocolonias con aspecto polvoriento, de color verde azulado.P. marnefeii es la única especie patógena de Penicillium y es causa de infecciones espontáneasdel sistema retículoendotelial, afectando vasos linfáticos, pulmón, hígado, bazo y hueso. Verfigura 3.Figura 3:Aspecto microscópico de Penicillium.
  • 81 2) Hongos sifonados.Zigomicetos: Especies de Rhyzopus, Mucor y Absidia han sido implicados en cuadros dezigomicosis. Macroscópicamente presentan un micelio algodonoso. Microscópicamente,forman hifas aseptadas y se reproducen asexualmente produciendo esporangios en losque se desarrollan esporas (Ver figura 4). Las enfermedades asociadas a estosmicroorganismos son usualmente la mucormicosis rinocerebral. Esta infección se origina enlos senos paranasales y puede afectar órbita y el paladar, extendiéndose hacia el cerebro. Enpacientes inmunodeprimidos puede afectar el pulmón, el tracto gastrointestinal y los tejidossubcutáneos. Figura 4: Aspecto microscópico de hongos sifonados.I.- Estudio ClínicoEl reconocimiento del hongo como agente de infección se inicia por la sospecha clínica delMédico al orientar su diagnóstico hacia una micosis. Este se sustenta gracias al examen físico,la historia clínica y en infecciones profundas, se agrega el apoyo de imágenes,fundamentalmente el Scanner. Frecuentemente, en micosis oportunistas los signos y síntomasclínicos no son específicos, siendo indistinguibles de una infección bacteriana. Muchas veces,la presencia de factores predisponentes o de riego y la pobre respuesta al tratamientoantibacteriano, es señal que índica la posible presencia causal de agentes fúngicos, sospechaque debe ser indicada en la solicitud de examen para que el profesional de laboratorio orientela búsqueda y aislamiento del hongo siguiendo la metodología apropiada.
  • 82II.- Toma y Transporte de MuestrasLa recolección y transporte del material clínico depende en gran parte de la sospecha clínica,tejido afectado, tipo de lesión y estado general del paciente. Esta etapa es fundamental para eléxito del diagnóstico. Debe asegurarse una cantidad suficiente de muestra que permita realizartodos los exámenes de laboratorio. La calidad de la muestra está directamente relacionada conla sensibilidad y rendimiento del examen en el laboratorio.Si el paciente se encuentra bajo tratamiento antifúngico, se recomienda suspender eltratamiento, por lo menos 2 semanas antes de la toma de muestra. Esto se orientaprincipalmente a pacientes portadores de micosis superficiales o cutáneas y las consideradas nograves.III.- Procedimiento General del Diagnóstico de LaboratorioEn general, el examen microscópico directo (EMD) y el cultivo pueden ser realizados paratodas las muestras clínicas que se reciben. Estos exámenes forman parte del método directo deidentificación de hongos y se recomienda en todas las micosis. La microscopía proporcionainformación vital y frecuentemente una inmediata corroboración del diagnóstico presuntivo alobservar el agente fúngico en el material clínico. Los hongos filamentosos se presentan enparasitismo como hifas que pueden ser cenociticas (poco septadas) o septadas, hialinas odematiancias (oscuras) según el tipo de hongo. Algunas levaduras presentan característicasmicroscópicas particulares en parasitismo, lo cual orienta su identificación. a) El EMD puede ser realizado en frotis, fijándose la muestra al portaobjetos y usando la tinción de Gram o Giemsa, para poder observar con la objetiva de inmersión (100X). Lo más frecuente, es la preparación al fresco con soluciones clarificadoras con o sin colorantes como KOH 10 o 20%. Además, se emplea la tinta de China para observar la presencia de cápsula en levaduras del género Cryptococcus, observándose con objetivos
  • 83 de 10X y 40X de aumento. En muestras de tejido, además puede solicitarse examen histopatológico donde se verá además la reacción tisular. b) El cultivo primario del hongo es realizado en varios tubos o placas de Petri conteniendo los medios de cultivo según la sospecha clínica. Las micosis causadas por hongos filamentosos se incuban generalmente a 25ºC y el tiempo de incubación dependerá de la sospecha clínica. Así, en las dermatofitosis o tiñas los medios se incuban hasta por 30 días, debido a que estos hongos demoran aproximadamente 20 días en crecer y presentar sus estructuras micromorfológicas características que permitirán su diagnóstico a nivel de especie. Sin embargo, los hongos filamentosos oportunistas como Aspergillus spp., Penicillium spp., Fusarium spp., mucorales y dematiaceos, entre otros, crecen más rápido, obteniéndose colonias entre los 5 a 10 días de incubación. Las levaduras crecen mejor a 37ºC y sus colonias se obtienen entre las 24 y 72hrs dependiendo de la especie.1.- HONGOS FILAMENTOSOSExamen Microscópico de la ColoniaA partir del hongo filamentoso aislado in vitro, se realiza una preparación microscópica paraobservar las características morfológicas del organismo, buscando principalmente lasestructuras reproductivas, ya que son éstas las que permitirán identificar el agente. Muchasveces, como consecuencia de la fragilidad de estas estructuras, se logra aproximar eldiagnóstico a nivel de género o grupo de hongos, por tal motivo se requiere de un cultivoespecial cuyo propósito es estimular la producción de células reproductivas en medios pobres yconservar su agrupación con respecto a las hifas a partir de un microcultivo. (no se realizará)2.- IDENTIFICACIÓN DE LEVADURASa) Prueba Fisiológica de Producción del Tubo GerminativoEste examen es realizado para identificar la presencia de C. albicans. En condicionesdeterminadas de cultivo “in vitro”, esta levadura desarrolla un tubo fino que no se libera nipresenta punto de constricción en el punto de unión con la célula madre. Se inocula la levaduraen un tubo conteniendo plasma o suero humano y se incuba a 37ºC por 2 a 3 hrs. Debido a lorápida, fácil y barata, esta técnica se encuentra implementada en la gran mayoría de loslaboratorios. Sin embargo, es recomendable acompañarla siempre con estudios en
  • 84microcultivo, para comprobar la identificación de C. albicans, ya que se han descrito casos defalsos positivos y negativos.b) Prueba Fisiológica de FilamentaciónEste examen es realizado para identificar la presencia de Candida sp.. En condicionesdeterminadas de cultivo “in vitro”, estas levaduras desarrollan filamentos a partir de la célulamadre. Se inocula la levadura en un tubo conteniendo plasma humano y se incuba a 37ºC por24 hrs.c) Pruebas BioquímicasEl estudio bioquímico de levaduras comprende principalmente el análisis de asimilación dehidratos de carbono conocido como Auxanograma, sometiéndose a la cepa en estudio adiferentes azúcares dependiendo del género de levadura que se sospeche. Este examen secomplementa con asimilación de fuentes de nitrógeno, fermentación de azúcares denominadoZimograma e hidrólisis de urea. El auxanograma y la asimilación de nitratos son incubados a25ºC hasta por 3 días. Entretanto, el zimograma e hidrólisis de urea se incuba a 37ºC.El perfil bioquímico obtenido será comparado con los datos en las tablas de identificaciónrespectivas, según el género de levadura sospechado, permitiendo reconocer la o las especiesque presentan el patrón bioquímico determinado.d) Sistemas Comerciales de Identificación de LevadurasEn virtud de trabajo y experiencia que se requiere para leer e interpretar los resultadosbioquímicos realizados por el método estándar, la industria ha desarrollado progresivamentenuevos sistemas para facilitar y disminuir el tiempo de identificación de las especies delevaduras de interés clínico. La mayoría de los sistemas disponibles en el mercado son galeríasque contienen distintos nutrientes y reactivos deshidratados en los pocillos que, al serinoculados e incubados correctamente proporcionan lectura de fácil interpretación, las cuales,en su mayoría generan un código numérico de varios dígitos que son interpretados por registrospropios de cada empresa. El primer inconveniente observado por los laboratorios es lanecesidad de contar con disponibilidad de otra estufa de cultivo, ya que algunos de estossistemas se incuban a 30ºC por 24 y 48hr.
  • 85Sistema comercial Productor- Api Candida BioMérieux- ID 20C e ID 32C BioMérieux- Fungichrom I International MicrobioEn resumen, a partir del diagnóstico clínico los pasos importantes que favorecen el aislamientoe identificación del hongo son:- Apropiada recolección del material clínico y rápido transporte al laboratorio- Inmediato y oportuno procesamiento de la muestra- Adecuada elección de la o las soluciones en el examen microscópico directo- Correcta selección del o los medios de cultivos- Óptimo procedimiento de inoculación e incubación- Adecuada realización, lectura, análisis e interpretación de las técnicas de identificaciónACTIVIDADES PRÁCTICAS1.- Observación y descripción de cultivos de levadura.1.1.- Procedimientos. a) Examen macroscópico: Describa, tal como lo hacía para colonias bacterianas, forma, color, aspecto de la superficie, borde, elevación y brillo de las colonias. Anote lo que observe. b) Examen microscópico: Realice una tinción Gram tradicional. Es decir, realice un frotis con la colonia de levaduras en una gota de agua y continúe con el protocolo por usted. conocido. Observe con inmersión y dibuje lo que observa.Nota: La tinción Gram es sólo una técnica de tinción. Las levaduras no son Gram + ni Gram-. Recuerde que la característica de ser Gram+ o Gram- está relacionada con propiedades quepertenecen a las membranas bacterianas. c) Observación de tubo germinativo y filamentación en Candidas: 1. Coloque en un portaobjeto limpio una gota del cultivo de Candida que se le entragará(*) 2. Cubra con un cubreojeto. 3. Observe al fresco en aumento de 40X y dibuje lo observado
  • 86(*) Para esta prueba la levadura a estudiar se siembra en un tubo con plasma humano yse cultiva a 37°C por 4 horas para observar tubo germinativo y por 24 horas paraobservar filamentación.Recuerde que sólo C. albicans presenta tubo germinativo a las 4 horas, mientras quevarias especies de Candida presentan filamentación a las 24 horas.d) Tinción de cápsula: 1. Coloque en un portaobjeto limpio una gota de agua y una gota de tinta china. 2. Emulsione una colonia de Cryptococcus y extienda la preparación con otro portaobjeto. 3. Seque suavemente en la llama del mechero 4. Cubra con fucsina y deje reposar 2-3 minutos. 5. Lave con agua, seque y observe al microscopio con aceite de inmersión en 100X2.- Observación, y descripción de hongos filamentosos.2.1.- Procedimientos. a) Examen macroscópico: Color y aspecto (aterciopelada, algodonosa, polvorienta, lanosa) en anverso y reverso. Anote lo que observe. b) Examen microscópico: Para esto se realizará un examen al fresco.
  • 87 Examen al Fresco: 1.- Coloque una gota de azul de lactofenol sobre un portaobjeto. 2.- Flamee un asa en punta, enfríe cerca del mechero y obtenga un pequeño trozo del hongo (sin sacar agar). DEBE USAR MASCARILLA. 3.- Mezcle el fragmento del hongo con el azul de lactofenol y cubra con un cubreobjeto. 4.- Observe con aumento de 40X (sin inmersión, ni aplastando la muestra). 5.- Reconozca las estructuras microscópicas reproductivas de cada especie y dibuje. • Recuerde: el principal criterio para la identificación de estos microorganismos es el morfológico, por lo tanto, es importante que trabaje con cuidado. CULTIVO POSITIVO LEVADURAS TUBO GERMINATIVOTUBO GERMINATIVO (+) TUBO GERMINATIVO (-) Candida albicans FILAMENTACIÓN (+) FILAMENTACIÓN (-)PSEUDOHIFAS O HIFAS PSEUDOHIFAS O HIFAS HIFAS CON ARTROCONIDIAS CÁPSULA (-) CÁPSULA (+) BLASTOCONIDIAS Y CON BLASTOCONIDIAS CLAMIDOCONIDIAS Candida albicans Candida sp. API 32, PROBABLE API32, probable Cryptococcus sp. Trichosporon o Rhodotorula o Geotrichum Torulopsis ASIMILACIÓN/ FERMETACIÓN DE AZÚCARES (API 32 U OTRO))
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  • 90 TRABAJO PRÁCTICO N°6 PARÁSITOSOBJETIVOS1.- Reconocer elementos parasitarios frecuentes en muestras clínicas.2.- Observar las características más importantes de estos parásitos.MARCO TEÓRICO Se define como parásito a todo ser vivo, vegetal o animal, que pasa toda, o parte de suexistencia, a expensas de otro ser vivo, generalmente más potente que él (hospedero), del cualvive causándole o no daño, que puede ser aparente o inaparente, y con quien tiene unadependencia obligada y unilateral. Existen diversos tipos de parasitismo:1. Parasitismo obligatorio: los parásitos necesitan para vivir hacer vida parasitaria. Este estadopuede ser permanente, permanente estacionario, periódico o temporario.2. Parasitismo facultativo: son seres de vida libre que en circunstancias favorables hacen vidaparasitaria.3. Parasitismo accidental: no son parásitos verdaderos, pero ocasionalmente pueden serlo.4. Parasitismo extraviado: parásitos de los animales que anormalmente pueden encontrarse enel hombre.5. Parasitismo errático: cuando la localización del parásito, en el huésped, no es en el órgano otejido habituales.Ciclos de vida del parásito:1. Ciclos directos (monoxenicos): son aquellos en los que no es necesaria la presencia de unhuésped intermediario. Pueden ser cortos -donde la forma emitida es la infectante- o largos,donde la forma emitida necesita un determinado tiempo en el medio (generalmente el suelo)para transformarse en infectante. En general, los parásitos con ciclos directos cortos soncosmopolitas y los directos largos están condicionados por las situaciones climáticas.
  • 912. Ciclos indirectos (heteroxenicos): son los que necesitan un huésped intermediario paracompletar su ciclo. La presencia de estas parasitosis en un área determinada depende de laexistencia de ese huésped intermediario.Características más importantes de los parásitos:Resistencia al medio exterior: para enfrentar los factores climáticos y algunos agentesquímicos, los huevos, quistes o larvas se protegen con cubiertas proteicas que los hacenresistentes.Patogenicidad: está relacionada con la morbilidad y la mortalidad. Algunos parásitos sonpatógenos por sí mismos, y otros lo son, dependiendo de las características del huésped; éstohace que un mismo parásito pueda o no producir enfermedad. Por esta razón existen elportador sano y los parásitos oportunistas, que se manifiestan en pacientesinmunocomprometidos.Autoinfección: es la forma para que el parásito permanezca por más tiempo en el huésped.Puede ser autoexoinfección, en la que está en el exterior un tiempo muy corto; oautoendoinfección, en la que se multiplica dentro del huésped, y la recontaminación se hace enel interior del mismo.Prepatencia: es el tiempo que transcurre entre la entrada del parásito al huésped y lademostración de éste, o sus formas de desarrollo, ya sea por la observación directa, estudiosbioquímicos, cultivos, etc.Viabilidad: es importante que las formas emitidas al exterior por el parásito sean viables através de estructuras resistentes, tanto al medio como a los huéspedes intermediarios. Seasegura de esta forma la continuidad del ciclo y su permanencia.Diapausa: es el estado en que muchas veces las larvas de los parásitos permanecen en elorganismo del huésped en forma latente -encapsuladas o formando quistes- para evadir larespuesta inmunológica.Longevidad: la longevidad de un parásito admite dos formas: longevidad verdadera, cuandopermanecen muchos años en un organismo; o perpetuándose -por medio de la autoinfección-aunque el parásito tenga vida muy corta.Fecundidad: la capacidad para emitir determinada cantidad de formas parasitarias le sirve alparásito para perpetuarse. Es útil conocerla, ya que a través de ello (por ejemplo, en loshelmintos, postura diaria de huevos), es posible hacer el cálculo aproximado del número deparásitos que infectan al huésped.
  • 92Prevención de las parasitosis La Organización Mundial de la Salud estableció que, dado que las parasitosis sonpatologías con alto componente social, podrían ser controladas, pero difícilmente eliminadas.Las medidas de prevención están vinculadas a la modificación de los hábitos, la educación y elbienestar de la población. Incluyen: 1. Disminuir el “fecalismo” ambiental a través de medidas de saneamiento básico, como facilitar el acceso al agua potable, la correcta eliminación de excretas, etc. 2. No utilizar excrementos como abono para el cultivo de hortalizas, ni aguas servidas para riego. 3. No consumir carnes o verduras crudas. 4. Controlar los vectores mecánicos (moscas, cucarachas) y los vectores biológicos (vinchuca, mosquitos etc.). 5. Desparasitar periódicamente a los animales domésticos, sobre todo perros y gatos. 6. Prevenir las parasitosis congénitas a través del control de la mujer embarazada. 7. Evaluar parasitosis en dadores de sangre y donantes de órganos. 8. Modificar hábitos de convivencia del hombre con los animales, para evitar el contacto con las heces de los mismos. 9. Promocionar la lactancia materna, ya que se ha comprobado que ésta protege contra determinadas parasitosis, principalmente las que originan diarreas. 10. Evitar el hacinamiento, que facilita el contagio persona a persona. 11. Hervir el agua de consumo por un minuto, utilizando esta modalidad como norma, especialmente cuando la ingieran lactantes y niños. 12. No caminar descalzo o con calzado abierto en suelos de tierra o arena, sobre todo húmedos. 13. Utilización de guantes y calzado cerrado siempre que se trabaje con la tierra. 14. Antes de utilizar abono o turba de río comercial rociar el material con agua recién hervida. 15. Tratar de evitar que los niños jueguen en areneros o patios de tierra. Si ello no fuera factible, establecer un lugar delimitado para ellos, al que se rociará periódicamente, si es posible en forma diaria, o en los períodos de clima cálido y después de las lluvias, con agua recién hervida. 16. Colocar los juguetes de los niños al sol las veces que se pueda, ya que la mayoría de las formas parasitarias no resisten a la desecación y temperaturas superiores a 50ºC.
  • 93LABORATORIO DE PARASITOLOGIAOBTENCIÓN DE LA MUESTRACONDICIONES GENERALES • Los parásitos intestinales del hombre son protozoarios y/o helmintos, llamados comúnmente gusanos intestinales (Anexo A). Estos helmintos o gusanos pueden ser cilíndricos (nemátodes), anillados o segmentados (céstodes). • Para observar los trofozoítos, quistes u ooquistes de los protozoarios, así como las larvas y huevos de helmintos, se debe usar un microscopio; en cambio, la mayor parte de los gusanos o helmintos adultos son macroscópicos y su morfología puede estudiarse directamente, con ayuda de un estereoscopio o una lupa. • Los protozoarios intestinales eliminan con las heces sus formas evolutivas (trofozoíto, quiste, ooquiste y espora), según la especie involucrada. • Los helmintos intestinales adultos (proglótidos de Taenia sp., Enterobius vermicularis y Ascaris lumbricoides) pueden salir al exterior espontáneamente o después del tratamiento. • Los gusanos intestinales se eliminan con las heces. • Los métodos de diagnóstico de los parásitos intestinales pueden ser: directo o por concentración de los elementos parasitarios que se eliminan en las heces. • En las heces podemos encontrar formas adultas y microscópicas (huevos, larvas, trofozoitos, quistes, ooquistes y esporas) de los parásitos intestinales; por ello, es importante obtener una buena muestra fecal, así como la conservación óptima del espécimen. • La muestra debe ser obtenida (entre 3 y 6 gramos) lo más fresca posible (máximo 90 minutos, si se busca Entamoeba histolytica), y depositada en un frasco de boca ancha con tapa rosca y rotulada correctamente con los datos de identificación. • La muestra debe obtenerse antes del uso de medicamentos antiparasitarios, o hasta 2 a 5 días después de su administración. • Las heces depositadas en el suelo no son las recomendadas para el diagnóstico, debido a que pueden contaminarse con formas biológicas, como por ejemplo: larvas similares a los enteroparásitos del hombre, larvas de nemátodes, huevos de ácaros o insectos, etc.
  • 94 • Si el paciente no es regular en la evacuación de sus deposiciones y ha evacuado en la noche anterior al examen, se recomienda guardar la muestra en una refrigeradora o en un lugar fresco no expuesto a la luz solar, para que no se alteren las formas parasitarias. Cuando la muestra va a demorar en llegar al laboratorio varias horas o días, se recomienda adicionarle líquido fijador y/o conservador (PAF, PVA, formalina 10%, SAF, acetato de sodio, etc.).MUESTRA PARA EXAMEN PARASITOLÓGICOComprende las siguientes muestras: heces, bilis o jugo duodenal, esputo, secreción, biopsia opreparaciones histológicas, siendo heces, la más frecuente.EXAMEN DIRECTO MACROSCÓPICOFundamento.Permite observar directamente las características morfológicas de los parásitos adultos, enteroso fraccionados, así como los cambios en las características organolépticas de las heceseliminadas, (color, presencia de sangre y/o moco, consistencia, etc.).Figura Nº 1. Ascaris lumbricoides macho adulto (der.) y proglótido grávido de Taeniasolium (4X) (izq.), coloración: TioninaEXAMEN DIRECTO MICROSCÓPICOFundamento.Buscar, principalmente en muestras frescas, la presencia de formas evolutivas móviles deparásitos de tamaño microscópico (trofozoítos, quistes de protozoos: Entamoeba histolytica,Giardia lamblia, Balantidium coli, etc.; así como larvas o huevos de helmintos: Strongyloidesstercoralis, Ancylostoma duodenale, Necator americanus, Trichostrongylus sp., Paragonimus,Fasciola, etc.).
  • 95EjemplosTrofozoito de Giardia lamblia con solución lugol. Huevos operculados de Paragonimusperuvianus (izq.) y Fasciola hepatica (der.) en muestra frescaDIAGNOSTICO EN EL LABORATORIO PARASITOLOGÍA La recolección correcta de las muestras es esencial para un examen de heces confiable.Se recomienda realizar un seriado coproparasitológico, una muestra fresca en soluciónformolsal. Debe entregarse a cada paciente tres frascos o recipientes plásticos de boca anchacon cierre adecuado, Se puede solicitar al paciente que tres días antes de iniciar la recolecciónno ingiera manteca, frutas de hollejo, verduras de hoja y legumbres.Puede ingerir carnesmagras, pastas, dulces, papa. Esta dieta previa no es un requisito estricto. Se debe suspender laingesta de purgantes oleosos y sustancias radio opacas.Recolección de materia fecal en conservantes:• Seriada coproparasitológica:Se indica la recolección de un mínimo de una muestra (tamaño de una cucharada de postre) decada deposición en tres días alternos. Se le indica al paciente que defeque en una bacinica, o enun recipiente de boca ancha, limpio y seco, o sobre superficie plástica o papel no absorbente dedonde tomará la porción para colocarla en un frasco grande con formolsal al 5%.Examen macroscópico de las heces remitidas:Cuando las heces frescas son recibidas en el laboratorio deben ser examinadas bajo luz lo quepermite observar directamente las características morfológicas de los parásitos adultos, enteroso fraccionados, así como los cambios en las características organolépticas de las heceseliminadas, (color, presencia de sangre y/o moco, consistencia, etc.).
  • 96Examen microscópico de heces:La aplicación de los métodos de concentración permite detectar elementos parasitarios queestén presentes y se examina una cantidad mayor de heces en menor volumen.ACTIVIDADES PRÁCTICAS Las actividades del laboratorio de parasitología consistirán en la observación deelementos parasitarios conservados en soluciones fijadoras y disecados y/o observación dediapotecas según disponibilidad de cada laboratorio.
  • 97EJEMPLOS DE ELEMENTOS PARASITARIOS QUE PUEDEN ENCONTRARSE ENUN SERIADO DE DEPOSICIONES
  • 98