ISOLASI RNA PADA SEL     PROKARIOTIK      OLEH :    TRI UTAMI   RIA OKTAMI  WIKA PUTRIANA TITIEN YULIASTIFERLY TRINOVELDI ...
PENGERTIAN RNA     RNA merupakan singkatan dariRibonukleatid    Acid     atau    Asamribonukleat. RNA merupakan substansig...
STRUKTUR RNAHal yang perlu diperhatikandala memahami struktur RNA : Gula Ribosa Urasil dan Timin Polinukleotida
JENIS RNA 1. mRNA 2. tRNA 3. rRNA 4. RNA Genom
ELEKTROFORESIS GELElektroforesis gel merupakan salah satu teknik utamadalam biologi molekular. Prinsip dasar teknik ini ad...
Sel Prokariotik    Berdasarkan keadaan intinya, sel dibedakan dalam dua macam, yaitu: selprokariotik dan sel eukariotik. S...
PRINSIP ISOLASI RNA• Isolasi RNA yang harus diperhatikan adakah aktivitas RNAasedan struktur RNA yang utas tunggal. RNAase...
Ekstraksi RNA Prokariot (1)mRNA merupakan materi genetik yang mengkode suatuprotein. Jumlah populasi mRNA akan lebih bany...
Ekstraksi RNA Prokariot (2)Kotoran akibat lisis sel dipisahkan dengan cara sentrifugasi.Kemudian molekul nuleotida (DNA d...
ISOLASI RNA DENGAN METODE GTC (1)• Sampel yang berasal dari lapangan harus dicuci bersih duludan ekstrak RNA disimpan dala...
ISOLASI RNA DENGAN METODE GTC (2)Tahapan isolasi metode GTC terdiri dari lisis, pemisahan, pencucian RNA dan presiptasi d...
Tahapan secara umum:a.Chloroform ditambahkan untuk memisahkan RNA denganpengkotornyab.RNA dipresipitasi dengan penambahan ...
ISOLASI RNA DENGAN METODE REVERSE TRANSCRIPTASE POLIMERASE CHAINREACTION (RT PCR) Teknik ini merupakan pengembangan dari ...
Pp biokim
Pp biokim
Pp biokim
Pp biokim
Pp biokim
Upcoming SlideShare
Loading in...5
×

Pp biokim

1,500

Published on

Published in: Education
0 Comments
0 Likes
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

  • Be the first to like this

No Downloads
Views
Total Views
1,500
On Slideshare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
0
Actions
Shares
0
Downloads
29
Comments
0
Likes
0
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

Pp biokim

  1. 1. ISOLASI RNA PADA SEL PROKARIOTIK OLEH : TRI UTAMI RIA OKTAMI WIKA PUTRIANA TITIEN YULIASTIFERLY TRINOVELDI SRI WULANDARI PUSPA AGUSTINA AHMAD FAHZAL LAMTIAR
  2. 2. PENGERTIAN RNA RNA merupakan singkatan dariRibonukleatid Acid atau Asamribonukleat. RNA merupakan substansigenetik yang berperan sebagai perantaradalam proses pengkodean protein darigen yang terdapat di dalam DNA.
  3. 3. STRUKTUR RNAHal yang perlu diperhatikandala memahami struktur RNA : Gula Ribosa Urasil dan Timin Polinukleotida
  4. 4. JENIS RNA 1. mRNA 2. tRNA 3. rRNA 4. RNA Genom
  5. 5. ELEKTROFORESIS GELElektroforesis gel merupakan salah satu teknik utamadalam biologi molekular. Prinsip dasar teknik ini adalahbahwa DNA, RNA, atau PROTEIN dapat dipisahkanoleh medan listrik. Dalam hal ini, molekul-molekultersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannyaoleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel.Dalam proses elektroforesis, sampel molekulditempatkan ke dalam sumur (well) pada gel yangditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrikdialirkan kepadanya. Molekul-molekul sampel tersebutakan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satukutub listrik sesuai dengan muatannya.
  6. 6. Sel Prokariotik Berdasarkan keadaan intinya, sel dibedakan dalam dua macam, yaitu: selprokariotik dan sel eukariotik. Sel prokariotik adalah sel yang belummempunyai inti sejati. Ciri-ciri sel prokariotik adalah bahan genetik (DNA) tidakterstruktur dalam bentuk nucleus, DNA terdapat pada nukleoid yang tidakdiselubungi oleh membran. Pada sel prokariotik, materi inti (DNA) terdapat dalam nukleoid yang tidakdibatasi oleh membran inti. Contoh sel prokariotik ialah bakteri, dan gangangbiru yang termasuk Monera.
  7. 7. PRINSIP ISOLASI RNA• Isolasi RNA yang harus diperhatikan adakah aktivitas RNAasedan struktur RNA yang utas tunggal. RNAase merupakan enzimyang mempunyai kemampuan untuk mendegradasi RNA.• Secara umum penanganan isolasi RNA adalah dalam segalaaktivitasnya menggunakan sarung tangan karena RNAase terdapatdimana-mana dan jumlahnya banyak.• Untuk memperoleh kualitas tinggi, RNA utuh merupakan halutama dan paling penting dalam percobaan biologi molekuler,termasuk tes perlindungan nukleus, RT-PCR, pemetaan RNA,translasi in vitro dan konstruksi cDNA. Untuk itu, dilakukanserangkaian prosedur isolasi RNA sampai tahap pemurnian RNA.
  8. 8. Ekstraksi RNA Prokariot (1)mRNA merupakan materi genetik yang mengkode suatuprotein. Jumlah populasi mRNA akan lebih banyak dibandingdengan DNA. mRNA prokariot dapat dipisahkan dari DNAdengan menggunakan oligonukleotida dT. Atau RNA total jugadapat di isolasi dari sel dengan menambahkan enzim DNaseyang berfungsi untuk mendegradasi DNA.Kecepatan dalam pemurnian RNA bakteri sangat pentingkarena waktu paruh mRNA bakteri pendek dan membutuhkanwaktu yang cepat dalam proses pembekuan. Beberapa bakteridiisolasi sebelum ditambahkan enzim lytic. Jika tidakditambahkan enzim lytic tersebut akan terjadi penundaanisolasi.Ekstraksi RNA dari organisme prokariot dilakukan melaluiproses penghancuran dinding selpenghilangan protein dan DNAdan pengendapan RNA dan pemanenan.
  9. 9. Ekstraksi RNA Prokariot (2)Kotoran akibat lisis sel dipisahkan dengan cara sentrifugasi.Kemudian molekul nuleotida (DNA dan RNA) yang telahdipisahkan dibersihkan dari protein yang masih ada denganmenggunakan phenol. Dalam proses ini sebagian kecil RNAjuga dapat dibersihkan. Sedangkan choloform digunakanuntuk membersihkan sisa-sisa protein dan polisakarida darilarutan.Enzim DNAase digunakan untuk menghancurkan DNAsehingga RNA dapat diisolasi secara utuh. Pemurnian ataupurifikasi RNA dapat dilakukan dengan mencampur larutanDNA tersebut dengan PCl yang berfungsi memekatkan,memisahkan RNA dari larutan, dan mengendapkan
  10. 10. ISOLASI RNA DENGAN METODE GTC (1)• Sampel yang berasal dari lapangan harus dicuci bersih duludan ekstrak RNA disimpan dalam freser -80. Ektraksi RNAdengan menggunakan nitrogen cair atau secara langsungmenggunakan larutan ektraksi. Selalu bekerja didalam esuntuk mencegah degradasi RNA dan mengurangi aktivitasRNAse. Tahapan isolasi RNA dengan menggunakan GTCmetod. Secara umum metode isolasi RNA menggunakanmetode GTC . GTC adalah satu dari yang paling efektiv untukmendenaturasi protein untuk efisisensi denaturasi RNAseendogenus. Modifikasi GTC menggunakan trizol, satu tahapRNA isolasi dan RNase kit.
  11. 11. ISOLASI RNA DENGAN METODE GTC (2)Tahapan isolasi metode GTC terdiri dari lisis, pemisahan, pencucian RNA dan presiptasi dan pemurnian. Lisis tahapan menjerapan dan penggangguan sel. Larutan denaturasi pada GTC mengguakan trizol, lisis buffer. Separasi adalah tahapan pemisahan substansi hidrofobik dari subatansi hidrofilik seperti DNA dan RNA dan dipisahkan RNA dan DNA. Larutan yang digunakan seperti phenol, chloroform dan isoamil alcohol. Pencucian RNA dan perispitasi menggunakan NaAc atau LiCl.
  12. 12. Tahapan secara umum:a.Chloroform ditambahkan untuk memisahkan RNA denganpengkotornyab.RNA dipresipitasi dengan penambahan isopropyl (1x volume) atau 100perse etanol (2,5 x volume) dan larutan garam (1/10 volem dari 3 MNaAc pH 5,2).c.RNA presipitasi adalah sering tidak terlihat sebelum sentrifugasi tetapibanyak bentuk yang berhubugan gen di bagaian bawah tube.d.Dicuci dengan etanol (70% EtOH) RNA pelete.Pemurnian RNA adalah terlihat endapan yang berwarna putihdiperhatikan terdapat kontaminan proteinf.Pelet dikeringkan selama 5-10’ (dikering anginkan, jangan meggunakanvacuum dry).g.Bagamanapun juga Etoh harus dihilangkanh.Penggunaan RNAse dan diinkubasikan selama 1 hari.i. Divortek atau ditaping untuk menghomogenkan dengan larutan.j. RNA quantifikasi dan qualitas pengecekan
  13. 13. ISOLASI RNA DENGAN METODE REVERSE TRANSCRIPTASE POLIMERASE CHAINREACTION (RT PCR) Teknik ini merupakan pengembangan dari teknik PCR yang awalmulanya ditemukan oleh Karry B. Mullis pada tahun 1985. Metode PCRadalah suatu metode enzimatis untuk melipatgandakan secaraeksponensial suatu sekuen nukleotida tertentu dengan cara in-vitro.Teknik RT PCR merupakan suatu pengembangan dari teknik PCR untukmelakukan analisis terhadap RNA hasil transkripsi yang hanya terdapatdalam jumlah yang sedikit di dalam sel. Teknik RT PCR yangdikembangkan sangat spesifik, sehingga dapat digunakan walaupunjumlah RNA yang akan dianalisis sedikit (Yowono 2006). Bahan yang digunakan ialah daun tembakau, nitrogen cair, buffer CTAB, laruran LI,larutan LiCI, TE, larutan PCI, DEPC, MOPS, primer SOD, primer Oligo (dt), dNTP, ddH2O,RNA, enzim superskrip Reverse Transkiptase, dan DDT. Metode kerja, antara lain :1. Isolasi RNA Total . 3 Isolasi gen dengan RT-PCR2. Kuantifikasi dengan Elektroforesis 4. Pengukuran Kuantitas RNA
  1. A particular slide catching your eye?

    Clipping is a handy way to collect important slides you want to go back to later.

×