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Metabolitos de excreción de dinoflagelados: nuevos retos

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Conferencia impartida por José Javier Fenández el 23 de marzo de 2012 en el marco de los Viernes Científicos, actividad organizada por la Facultad de Ciencias Experimentales de la Universidad de ...

Conferencia impartida por José Javier Fenández el 23 de marzo de 2012 en el marco de los Viernes Científicos, actividad organizada por la Facultad de Ciencias Experimentales de la Universidad de Almería

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Metabolitos de excreción de dinoflagelados: nuevos retos Metabolitos de excreción de dinoflagelados: nuevos retos Presentation Transcript

  • Metabolitos  de  excreción  de  dinoflagelados:   Nuevos  retos      José  Javier  Fernández    Ins$tuto  Universitario  de  Bio-­‐Orgánica  “Antonio  González”  (IUBO),  Universidad  de  La  Laguna   (ULL),  Astro@sico  Francisco  Sánchez  2,  38206  La  Laguna,  Tenerife    
  • Dinoflagelados   Producción de poliéteres TOXINAS HERRAMIENTAS FARMACOLÓGICASAlmería  –  2012  
  •  Poliéteres  fusionados     Maitotoxina Organismo:   Gambierdiscus toxicus   Actividad:   ↑ [Ca2+] intracelular por canales de cationes no selectivos Intoxicación:   CFP     Yessotoxina Brevetoxina B   Organismo:   Protoceratium reticulatum   Organismo:   Karenia brevis Lingulodinium polyedrum Gymnodinium breve Actividad:   Acción sobre fosfodiesterasa   Actividad:   Interacciona con Intoxicación:   DSP   canales de Na+ dependientes de voltaje.   Intoxicación:   NSP  Almería  –  2012  
  •  Macrociclos   ANFIDINOLIDA A   Organismo:   Amphidinium sp. Actividad:   Anticancerígeno:   leucemia L1210 cáncer de colón carcinoma epidermis KB Intoxicación:   -----   ZOOXANTELATOXINA B   Organismo:   Symbiodinium sp. Actividad:   Vasoconstrictora   GONIODOMIN A   Intoxicación:   -----   Organismo:   Goniodoma sp.   G. pseudogoniaulax Actividad:   Reorganiza citoesqueleto   Antifúngico Intoxicación:   -----   Almería  –  2012  
  • Poliéteres  lineales   ÁCIDO OKADAICO   Organismo:   Prorocentrum: arenarium, belizeanum, concavum, faustiae, hoffmanianum, lima, maculosum.   Dinophysis: acuminata, acuta, fortii, mitra, norgevica, rotundata, sacculus, tripos Actividad:   Inhibición PP1 y PP2A   Intoxicación:   DSP   PALITOXINA   ANFIDINOL   Organismo:   Organismo:     Ostreopsis siamensis Amphidinium klebsii   O. ovifrons Actividad:   Disruptor de membrana   Actividad:   Interviene en las Hemolítico bombas Na+ y K+ Antifúngico Intoxicación:   CFP   Intoxicación:   ----   Almería  –  2012  
  • Poliéteres  lineales   ÁCIDO OKADAICO   Organismo:   Prorocentrum: arenarium, belizeanum, concavum, faustiae, hoffmanianum, lima, maculosum.   Dinophysis: acuminata, acuta, fortii, mitra, norgevica, rotundata, sacculus, tripos Actividad:   Inhibición PP1 y PP2A   Intoxicación:   Diarrhetic Shellfish Poisoning (DSP)   43 Dinophysis sp. Prorocentrum sp. O OH 9 11 17 41 39 O O 14 24 HO 1 31 O OH 7 O O 20 26 44 38 OH O O 35 42 OH 40 O 18 OH 11 3 O O 24 8 33 HO 19 25 O OH 7 O O 26 38 34 OH 20 O O 35 OHAlmería  –  2012  
  • Almería  –  2012  
  • Líneas  de  inves$gación   I.  Estudio de elucidación estructural de nuevas toxinas II.  Estudios biosintéticos III.  Aproximación al modo de acción y estudios SARAlmería  –  2012  
  • Ácido  Okadaico   43 O OH 9 11 17 41 39 O O 14 24 HO 1 31 O OH 7 O O 20 26 44 38 OH O O 35 42 OH 40 O 18 OH 11 3 O O 24 8 33 HO 19 25 O OH 7 O O 26 38 34 OH 20 O O 35 OHAlmería  –  2012   J.  Med.  Chem.  2004,  47,  10-­‐13;  Org.  Le..  2007,  9,  4191-­‐4194      
  • Toxinas  DSP:  análisis    y  control   43 O OH 9 11 17 41 39 O O 14 24 HO 1 31 O OH 7 O O 20 26 44 38 OH O O 35 42 OH 40 O 18 OH 11 3 O O 24 8 33 HO 19 25 O OH 7 O O 26 38 34 OH 20 O O 35 OH Ensayo  ratón     Deriva;zar  con     Unidad  ratón   ADAM   Almería  –  2012   Toxicon  2010,  56,  191-­‐217  
  • Toxinas  DSP:  análisis    y  control   43 O OH 9 11 17 41 39 O O 14 24 HO 1 31 O OH 7 O O 20 26 44 38 OH O O 35 42 OH 40 O 18 OH 11 3 O O 24 8 33 HO 19 25 O OH 7 O O 26 38 34 OH 20 O O 35 OH Ensayos  de  inhibición  de  proteína  fosfatasa  Almería  –  2012   Toxicon  2010,  56,  191-­‐217  
  • Derivados  del  Ácido  Okadaico   O OH O O RO O OH O O OH O O OH OH OH OH OH OH OH OH OOH OH OH OH OH OH H OH O Toxicon  2010,  56,  191-­‐217  
  •    Nuevas  toxinas  DSP   OA  diol  C-­‐10   DTX  5c   Toxicon  2006,  47,  920-­‐924;  Toxicon  2007,  50,  470-­‐478,  Toxicon  2010,  56,  191-­‐217   Almería  –  2012          
  • Toxinas  DSP:  análisis    y  control   Análisis  con  ratón   Análisis  HPLC/MS   Toxicon  2006,  47,  920-­‐924;  Toxicon  2007,  50,  470-­‐478,  Toxicon  2010,  56,  191-­‐217  Almería  –  2012          
  • Prorocentrum  belizeanum   Cepa  PBMA01   Isla  Reunión     (Océano  Índico)      Almería  –  2012  
  •  Cul$vos  a  gran  escala  de  Procentrum  belizeanum   INÓCULO INICIAL 3 ml (7000 células/ml) ERLENMEYERS 50 ml CULTIVO PARALELO 20 ml DE CULTIVO ERLENMEYERS 50 ml 20 días 20 ml DE CULTIVO ERLENMEYERS 250 ml 100 ml DE CULTIVO 20 días 20 días ERLENMEYERS 5 L 2 LITROS DE CULTIVO Medio Guillard-K 20 días Temperatura: 22 ºC TANQUES DE 60 L Irradiancia: 160 µE/m²s 42 LITROS DE CULTIVO Ciclo luz/oscuridad: 16/8 50 días TRATAMIENTO DEL CULTIVO VOLUMEN TOTAL > 1000 LAlmería  –  2012  
  • Almería  –  2012  
  • Tratamiento  del  cul$vo   CULTIVO Prorocentrum belizeanum 1000 L (1)  Decantación (2)  Centrifugación, 4 ºC BIOMASA 7000 rpm, 10 min MEDIO DE CULTIVO Extracción con Acetona EXTRACTO EN RESTOS MATERIAL ACETONA CELULARES RETENIDO 18,45 g 1,52 g Diaion® HP-20 Extracción 1,5 litros/hora con Metanol EXTRACTO EN RESIDUO METANOL 14,95 gAlmería  –  2012  
  • Esquema  cromatográfico  de    aislamiento   Prorocentrum  belizeanum     Extracto  de  acetona   22.1  g   Sephadex  LH-­‐20   FracTon  A   CH2Cl2:MeOH:n-­‐Hex  (1:1:2)   FracTon  B   FracTon  C   4.65  g   8.11  g   7.14  g   Lobar  Lichroprep  RP-­‐18   MeOH:H2O  (17:3)   FracTon  B1   FracTon  B2   FracTon  B3   FracTon  B4   1742  mg   209  mg   5231  mg   138  mg   Lobar  Lichroprep  RP-­‐18   Lobar  Lichroprep  RP-­‐18   CH3CN:H2O  (1:1)   CH3CN:H2O  (1:1)   FracTon  B2a   FracTon  B2b   FracTon  B4d   13  mg   135  mg   14  mg   HPLC  XTerra   Lobar  Lichroprep  RP-­‐18   CH3CN:H2O  (1:1)   MeOH:H2O  (7:3)   HPLC  XTerra   MeOH:CH3CN:H2O  (5:3:2)   Belizeanic  Acid   19-­‐epi-­‐Okadaic  Acid   Okadaic  Acid   Corozalic  Acid   Okadalactone   0.5  mg   1.0  mg   70  mg   0.6  mg   1.9  mg  Almería  –  2012  
  • Ácido  19-­‐epi-­‐Okadaico  :  estudio  estructural   Ácido  19-­‐epi-­‐Okadaico   Ácido  Okadaico   43 O OH 9 11 17 41 39 O O 14 24 HO 1 31 O OH 7 O O 20 26 44 38 OH O O 35 42 OH 40Almería  –  2012   O 18 OH 11 3 24
  • Ácido  19-­‐epi-­‐Okadaico  :  estudio  estructrual   Ácido  Okadaico   Ácido  19-­‐epi-­‐Okadaico  Almería    –2012  
  • Ácido  19-­‐epi-­‐Okadaico  :  estudio  conformacional   43 O OH R*   41 39 O 14 O HO 1 19 25 O 7 O O 44 OH O O 38 OH 42 30 OH 40 C24 C24 C1 C1 Ácido 19-epi-Okadaico Ácido OkadaicoAlmería  –  2012   Org.  Le..  2007,  9,  3045-­‐3048,  Mar.  Drugs  2008,  6,  489-­‐495  
  • Ácido  Belizeánico   43 OH 41 39 O 9 11 HO 24 OH 31 1 O 14 S*   19 26 O HO 38 O O O 44 OH 7 16 S*   35 OH 42 OH OH 40 Acido Belizeánico Acido OkadaicoAlmería  –  2012   Chem.  Eur.  J.  2008,  14,  6948-­‐6956  
  • Ácido  Corozálico   O OH O O HO 25 O 16 O 38 HO OH OH O 30 O OH 43 OH OH OH 16 O 44 7 OH OH 12 O 25 O 38 8 HO O 30 O O 43 OH OAlmería  –  2012   Chem.  Eur.  J.,  2010,  16,  11576-­‐11579  
  • Nuevas  toxinas  de  $po  DSP   43 O OH 9 11 17 R* 41 39 O O 14 24 HO 1 31 O OH 7 O O 20 26 44 38 OH O O 35 42 OH 40 Ácido 19-epi-Okadaico O 43 OH OH O O O HO 41 39 9 11 HO OH 25 24 OH 31 OO O O 14 16 O 19 18 26 38 HO HO 1 OH OH 11 38 3 O O 8 16 OO O24 30 OO 44 OH 7 35 33 HO OHOH 43 O OH 19 25 OH OH 26 O OH 7 O 42 40 34 38 OH 20 O O 35 OH Ácido Belizeanico OH OH 16 O 44 7 OH OH 12 O 25 O 38 8 HO O 30 O O 43 OH O Ácido CorozalicoAlmería  –  2012  
  • Tratamiento del medio de cultivo CULTIVO Prorocentrum belizeanum 1000 L (1)  Decantación (2)  Centrifugación, 4 ºC BIOMASA 7000 rpm, 10 min MEDIO DE CULTIVO Extracción con Acetona EXTRACTO EN RESTOS MATERIAL ACETONA CELULARES RETENIDO 18,45 g 1,52 g Diaion® HP-20 Extracción 1,5 litros/hora con Metanol EXTRACTO EN RESIDUO METANOL 14,95 gAlmería  –  2012  
  •  Cromatogra@a  de  las  aguas  de  cul$vo   Material Retenido 1,52 g Lobar® Lichroprep RP-8 CH3OH : H2O 50:50 Fracción H1 Fracción H2 Fracción H3 0,47 g 0,38 g 0,55 g Sephadex® LH-20 CH3OH : CHCl3 33:66 Fracción H31 Fracción H32 Fracción H33 Fracción H34 0,21 g 0,19 g 0,07 g 0,04 g HPLC, XTerra® Prep MS C18 CH3OH : AcONH4 2 mM 70:30 Fracción H32A Fracción H32B HPLC, XTerra® Prep MS C18 0,12 g 0,04 g AcONH4 2 mM : CH3CN : CH3OH 56:6:38 HPLC, Microsorb® 100-8 C18 CH3OH : AcONH4 2 mM 80:20 Ácido belizeanólico Belizeanolido Ácido okadaico 69,3 mg 6,7 mg 1,7 mg Actividad citotóxica moderadaAlmería  –  2012  
  •  Estudio  estructural  del  Ácido  Belizeanólico  Almería  –  2012  
  •  Análisis  mediante  HPLC-­‐MS    Análisis  mediante  HPLC-­‐MS   ANÁLISIS LC/MS MODO TIC -Total Ion Current- ESI-Almería  –  2012  
  •  MLADI-­‐TOF   MALDI-TOF Ácido belizeanólico. ESI [M–H]– m/z 1441,85 MALDI [M+Na]+ m/z 1465,89 MALDI [M+K]+ m/z 1481,87 C81 H134 O21Almería  –  2012  
  •  Estudio  estructural  de  Ac.  Belizeanólico  Almería  –  2012  
  • 10 Metilos21 Metilenos alifáticos27 Metinos alifáticos 7 Metinos olefínicos 6 Metilenos tipo exo Heteronuclear Single-Quantum Correlation spectroscopy (HSQC)
  •  Estudio  estructural  de  Ac.  Belizeanólico:  fragmentos  de  espin   Correlation Spectroscopy (COSY) Total Correlation Spectroscopy (TOCSY)Almería  –  2012  
  •  Estudio  estructural  de  Ac.  Belizeanólico:  fragmentos  de  espin   Correlation Spectroscopy (COSY) Total Correlation Spectroscopy (TOCSY)Almería  –  2012  
  •  Ac.  Belizeanólico:  esqueleto  de  carbono   Heteronuclear Multiple-Bond Correlation spectroscopy (HMBC)
  •  Ac.  Belizeanólico:  iden$ficando  sistemas  de  anillos   DESPLAZAMIENTO INDUCIDO POR EFECTO ISOTÓPICO SECUNDARIO Efecto β en grupos hidroxilo ΔδC 0,09 - 0,12 ppmAlmería  –  2012  
  •  Ac.  Belizeanólico:  iden$ficando  sistemas  de  anillos   ÁCIDO BELIZEANÓLICO SINAQO  –  Córdoba  2011   Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 796.
  •  Belizeanolido  Almería  –  2012  
  •  Belizeanolido   BELIZEANOLIDOAlmería  –  2012   Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 796.
  • Líneas  de  inves$gación   I.  Estudio de elucidación estructural de nuevas toxinas II.  Estudios biosintéticos III.  Aproximación al modo de acción y estudios SARAlmería  –  2012  
  •  Experimento  biosinté$co   Cul;vos  de  Prorocentrum   Medio  Guillard  K   7  días   2,5  Litros  x  7   Adición  de  an;bió;cos   Penicilina  G  (40  U/mL)   1  día   Sulfato  de  estreptomicina  (200  U/mL)   Adición  de  precursores  enriquecidos     con  isótopos  estables  (0.67  mM)   14  días   CHCl3:MeOH   Recolección     1:1   Preparación  del  extracto   Cromatograca   Metabolitos  enriquecidos   Almería  –  2012  
  •  Experimento  biosinté$co   A) 44 40 42 39 18 5 32 35 20 43 3 28 17 21 37 13 36 11 31 6 29 33 11 17 13 29 31 21 B) 36 33 6 44 42 39 18 28 20 5 32 37 43 35 40 3 Almería  –  2012  
  •          Incorporación  de  13C  en  Ácido  Okadaico   m O m OH m c c m O m m m m m m O c c m c c HO c c c m m m O O c c Om m m m m m HO m m m c OH m c O c c O c OH m m m:  meTlo  de  acetato;  c:  carboxilo  de  acetato;  c-­‐m:  unidad  de  acetato B C D A O OH O O E HO O O O HO O O OH OH CICLO  DE  KREBS  ?   POLICÉTIDO  CLÁSICO REAGRUP.  TIPO  FAVOSKI  ? Almería  –  2012  
  •  Experimento  biosinté$co   ! Almería  –  2012  
  •  Propuesta  biogené$ca  para  Ácido  Okadaico  Almería  –  2012   Chem.  Rec.  2004,  4,  1-­‐9  
  •  Propuesta  biogené$ca  para  Ácido  Okadaico   43 OH 41 39 O 9 11 HO 24 OH 31 1 O 14 19 26 O HO 38 OH 7 O 16 O O 35 44 OH 42 OH OH 40 Ac.  Belizeánico  Almería  –  2012   Chem.  Eur.  J.  2008,  14,  6948-­‐6956  
  • Porpuesta biosintética para Ácido Okadaico m m O * m O m * m OH c m m * O m m * m m HO c c c * c HO cc c m m O c m OH m O c c m OH m m m OH c ** m * c OH m * OH * * m m * O m O m *m m c * m OH m m O * m c m c c m m HO c c c * c O c HO m OH m O* c c m OH m m m OH c OH m * c * m * * OH * 16 O 4 * O * 12 HO 8 O HO 43 OH *Almería  –  2012  
  • Porpuesta biosintética para Ácido Okadaico
  • O O  Propuesta  biogené$ca  para  Ácido  Okadaico   25 HO 16 O O HO OH OH 38 O 30 O OH 43 OH OH OH 16 O 44 7 OH OH 12 O 25 O 38 8 HO O 30 O O 43 OH OAlmería  –  2012   Chem.  Eur.  J.,  2010,  16,  11576-­‐11579  
  •  Propuesta  biogené$ca  para  Ácido  Okadaico   ÁCIDO COROZÁLICO +H+ SN1 -H2O ÁCIDO OKADAICOAlmería  –  2012   Chem.  Eur.  J.,  2010,  16,  11576-­‐11579  
  •  Propuesta  biogené$ca  para  Ácido  Okadaico  Almería  –  2012   Chem.  Eur.  J.,  2010,  16,  11576-­‐11579  
  • Nuevos retos 1.-­‐  Químicos   Aislamiento  y  caracterización  estructural  de  metabolitos     con  estructuras  y  esqueletos  químicos  singulares.  Estudio   de  nuevas  rutas  biosinté;cas     2.-­‐  Farmacológicos   Establecimiento  de  nuevos  modos  de  acción  e   iden;ficación  de  nuevas  dianas  moleculares     3.-­‐  Biotecnológicos   Desarrollo  de  procesos  biotecnológicos  que  permitan  la   explotación  industrial  de  las  nuevas  en;dades  químicas    Almería  –  2012  
  • Proyectos de Investigación en Curso COMPUESTOS BIOACTIVOS DE ORGANISMOS MARINOS: ESTUDIOS ESTRUCTURALES, FARMACOLÓGICOS Y BIOTECNOLÓGICOS BÚSQUEDA, CARACTERIZACIÓN Y DISEÑO DE NUEVOS COMPUESTOS BIOACTIVOS DE ORGANISMOS MARINOS BIOTECNOLOGÍA INDUSTRIAL DE MICROALGAS MARINAS DINOFLAGELADAS Y SUSTACIAS BIOACTIVAS DERIVADAS EVALUACIÓN FISIOLÓGICA Y BIOQUÍMICA DE LOS EFECTOS EN EL SNC DE FICOTOXINAS MEDIANTE SISTEMAS EXPERIMENTALES IN VITRO BASADOS ENCULTIVOS PRIMARIOS Y ORGANOTÍPICOS.PROYECTO COORDINADO SAF2011-28883-CO3  
  • Agradecimientos José Franco José Gavín Santiago Fraga Pilar Riobo Emilio Molina Grima María Teresa Fernández Francisco García Camacho Antonello Novelli Asterio Sánchez Juan José Gallardo Mª Carmen Ceron  AGL,  PPQ,  SAF  
  • AgradecimientosDr. Manuel NorteDr. Antonio H. DaranasDra. María L. SoutoDra. Patricia CruzDr. José NapolitanoDr. Francisco Cen Grupo deLcda. Tamara Vilches ProductosLcdo. Humberto Rodríguez Marinos IUBOLcdo. Alexio Ronchial
  • Isla del Hierro (Canarias)! Volcán submarino! Noviembre 2011! Muchas gracias !