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Replicacion 2

  1. 1. Biología Molecular Lic. Marcelo F. Goyanes Estructura del ADNBreve reseña históricaHasta casi la mitad del siglo XX una de las preguntas que mantenía ocupados a losinvestigadores en el campo de la Biología Molecular y Celular era ¿Qué molécula poseela información genética? La mirada apuntaba principalmente a dos macromoléculas: lasProteínas y el ADN.La molécula de ADN, por ese entonces, parecía demasiado simple para “encargarse” detamaña tarea, ya que estaba constituida por solo cuatro componentes. El mismo Leveneen la década del ´20 había aseverado que, como las muestras de ADN estudiadasposeían proporciones casi iguales de las cuatro Bases nitrogenadas, el ADN debíacomportarse como un tetranucleótido, en el cual los ramilletes de a cuatro nucleótidos serepetían a lo largo de la molécula de manera más que monótona. Una molécula tanmonótona y repetitiva no se acercaba en lo más mínimo a la idea de una verdaderaportadora de la información genética.Fue hasta la década del ´50 que gracias a las experiencias y trabajos de Alfred D.Hershey y su colega Martha Chase se pudo comprobar, a través de estudios realizadoscon virus Bacterianos, que la información genética era portada por la molécula deADN.El broche de oro lo constituye el trabajo realizado por James Watson y Francis Crickquienes realizan el modelo del ADN que concordaba perfectamente con los hechosconocidos y ayudaría a explicar el papel biológico de esta molécula. No nos olvidemosque los dos jóvenes investigadores contaban ya con una suma de información más querelevante e imprescindible para el armado del modelo. Entre los datos más importantescon los que contaban podemos rescatar: Se sabía que la molécula de ADN era muy grande, larga y delgada. Compuesta por nucleótidos que contenían las bases nitrogenadas Adenina, Timina, Citosina y Guanina. Linus Pauling (1950) había demostrado que las cadenas de aminoácidos que componen las proteínas están dispuestas a menudo en forma de una hélice y se mantienen con esa conformación gracias a las uniones puente de Hidrógeno que se forman entre los aminoácidos de los distintos giros de la hélice. Pauling había sugerido que la estructura del ADN podía ser semejante a la hélice que presentaban las proteínas. Los patrones de las fotografías del ADN, obtenidas hasta este momento, reflejaban los giros de una hélice de grandes dimensiones. Erwin Chargaff analizó el ADN y confirmó que las cantidades de las Bases Púricas eran iguales a las de las Bases Pirimídicas. En síntesis, las cantidades de Adenina eran iguales a las de Timina y, las de Citosina se correspondían a las de Guanina.Con todos estos datos, Watson y Crick intentaron construir el modelo de ADN.Para llevar la gran cantidad de información genética el modelo debía considerar dosaspectos fundamentales: ser heterogéneo y variado. Armaron así el modelo en hojalatay alambre y, como quien arma un rompecabezas, encajaron cada pieza en su lugar.
  2. 2. Biología Molecular Lic. Marcelo F. GoyanesA medida que armaban el modelo, se dieron cuenta que los nucleótidos queconformaban la molécula de ADN podían encajarse en cualquier orden. Dado que lamolécula de ADN posee miles de nucleótidos de largo, la variabilidad y laheterogeneidad estaban aseguradas, puesto que la combinación de las bases se volvíaincalculable.Otra de las conclusiones a las que arribaron fue que la cadena poseía una dirección, yaque cada grupo fosfato está unido a un azúcar en la posición 5´ (el quinto carbono en elanillo de azúcar) y al otro azúcar en la posición 3´ (el tercer carbono en el anillo delazúcar). Así la cadena tiene un extremo 5´ y otro 3´.Lo interesante del trabajo fue el armado de la cadena complementaria. Las Adeninasúnicamente podían aparearse con las Timinas y las Guaninas con las Citosinas. Pero,para que esto ocurra, la dirección de las cadenas debía ser inversa. Es así como elextremo 5´ se aparea con el 3´, vale decir que ambas cadenas son Antiparalelas.Los estudios de Watson y Crick determinaron que la conformación tridimensional delADN consiste en dos cadenas enrolladas de tal manera que se constituye una dobleHélice. Las Bases Nitrogenadas están agrupadas unas sobre otras constituyendo lo quese conoce como Ordenamiento de Apilamiento.Si la cadena gira conformando una hélice, debe de existir un eje de rotación. El mismoestá conformado por las desoxirribosas que están unidas entre sí por una molécula deFosfato constituyendo entonces un enlace 3´- 5´ fosfodiester. Este eje azúcar - fosfato seencuentra en la parte externa de la molécula, mientras que las Bases Nitrogenadasquedan dispuestas hacia el lado interno de la misma.La doble hélice exige que cada una de las Bases Nitrogenadas de una cadena se apareeen forma complementaria con la base de la otra cadena. Este apareamiento tiene lugarmediante las uniones Puente de Hidrógeno que se forman entre las mismas. Entre lasBases Adenina y Timina se forman dos uniones Puente de Hidrógeno, mientras queentre la Guanina y la Citosina se establecen tres uniones de la misma naturaleza. No estademás aclarar que la unión entre las Bases Citosina y Guanina será, en consecuencia,más fuerte que la que se establece entre la Adenina y la Timina.
  3. 3. Biología Molecular Lic. Marcelo F. GoyanesFigura N° 1: Estructura de una porción de la molécula de ADN. Cada nucleótido consiste en unGrupo Fosfato, un azúcar (desoxirribosa) y una Base Nitrogenada Púrica o Pirimídica. El eje de cadacadena esta constituido por la secuencia repetida de azúcar – fosfato. Cada grupo Fosfato estáunido al carbono 5´ de la desoxirribosa y al carbono 3´ del siguiente nucleótido. Las dos cadenas semantienen unidas por medio uniones Puente de Hidrógeno, que se establecen entre las basescomplementarias (A-T y C-G). Se forman tres uniones P. de H. entre las bases C y G, mientras queentre la A y T se establecen solo dos.Las cadenas son antiparalelas, la dirección desde el extremo 5´a 3´de una es opuesta al de la otra.
  4. 4. Biología Molecular Lic. Marcelo F. GoyanesTopología de ADNLas cadenas de ADN pueden enrollarse una sobre otra de dos formas: en sentido horarioo en sentido antihorario. Es decir que si las cadenas giran a favor del movimiento de lasagujas del reloj diremos que lo hacen en sentido horario, de lo contrario el sentido queadquiere el giro será denominado antihorario. Esto determina que existan dos variantesde AND, el que se enrolla en sentido horario se denomina Right Handed ADN y el quelo hace en forma contraria se denomina Left Handed ADN o ADN Z.Right Handed ADN:Esta variante de ADN a su vez puede subdividiese en dos tipos de organización: el“ADN A” y el “ADN B”.1. ADN A: Las bases Nitrogenadas forman, al unirse con el eje azúcar – fosfato, un ángulo de 20°. Por cada vuelta de la hélice, encontraremos 11 pb (pares de bases). Es menos frecuente que el ADN B.2. ADN B: Las bases nitrogenadas forman un ángulo de 90° con el eje azúcar fosfato. Por cada vuelta de la Hélice encontraremos 10 pb. Es el tipo de ADN más frecuentemente encontrado.Left Handed ADN o ADN Z:Este tipo de ADN, como indicábamos arriba, gira en sentido antihorario. Estadisposición en el giro hace que el ADN adquiera forma de ZIG ZAG, de ahí su nombre.Por cada vuelta de hélice hay 12 pb.El ADN Z se encuentra acompañado de la unión de grupos metilo (-CH3) y juega un rolimportante en la regulación de la expresión génica. Generalmente las zonas metiladasdel ADN no se transcriben, es así como la distinta disposición del ADN Z en elgenoma de una célula intervendrá en forma activa en la diferenciación de la misma.Superenrollamiento:La mayoría de los esquemas que podemos llegar a visualizar del ADN lo muestrancomo una molécula lineal y con una estructura de doble hélice. En realidad laconformación que adquiere en el espacio dista de ello, ya que el mismo posee unaestructura cerrada, constituyendo bucles. Esta estructura la adopta ya que le sonagregadas fuerzas adicionales que lo mantienen empaquetado.Si además del giro que presenta (horario u antihorario) le agregamos otro giro alrededorde su eje, obtendremos una idea más acertada de su verdadera conformación. Este giroadicional, con el que se encuentra dispuesto en el espacio, se lo denominaSuperenrollamiento. Ahora bien, si a algo que ya posee un giro le agregamos otro, estepuede o no coincidir en su dirección con el anterior. Es así como nos veremos ante lapresencia de dos tipos de Superenrollamiento: el Positivo y el Negativo.
  5. 5. Biología Molecular Lic. Marcelo F. Goyanes Superenrollamiento Positivo:Se presenta cuando el ADN se enrolla en el espacio en sentido horario, al igual que ladoble hélice, quedando apretado. Este tipo de Superenrollamiento se produce en vivosólo en condiciones especiales. Un caso típico que genera Superenrollamiento Positivoesta dado por enzimas que rompen el ADN, lo giran y luego vuelven a unirlo. Si el giroque realizan va a favor del sentido horario el número de pb por vuelta aumentará,quedando la doble hélice apretada. Estas enzimas se denominan Topoisomerasas (serándescriptas en el capítulo referido a la autoduplicación del ADN). Un caso extremo deSuperenrollamiento estaría dado en el pasaje de ADN del tipo B al ADN del tipo Z. Eneste último caso, el ADN gira en sentido horario sobrepasando el sentido horario de lahélice original.Otro de los casos en los cuales el Superenrollamiento Positivo se hace evidente, y queveremos más adelante, lo confiere el aumento de tensión originada por delante de lahorquilla de replicación durante el proceso de autoduplicación del ADN. Superenrollamiento Negativo:En este caso, el ADN gira en sentido antihorario. De esta forma, la tensión del ADNbaja y la cantidad de pb por vuelta de la hélice se hace menor. Es sumamente importanteya que, disminuyendo la tensión de la doble hélice, se hace factible la separación de lasdos cadenas.
  6. 6. Biología Molecular Lic. Marcelo F. Goyanes Replicación del ADNUna de las características más notables del ADN essu capacidad de replicarse. Vale decir que el ADNes capaz de formar copias de sí mismo. El procesode autoduplicación del ADN se lleva a cabo en elperíodo S del ciclo celular. Esta etapa es un pasoprevio obligado para realizar la división celular en laetapa M de mencionado ciclo. Los genes debenposeer tres funciones principales, como portadoresdel material hereditario: Deben ser capaces, por medio de una replicación fiel, de transmitir la información genética de Figura N° 2: Ciclo Celular generación en generación. Deben contener la información necesaria para sintetizar todas las proteínas fundamentales para permitir el normal desarrollo de la célula. Deben aceptar cambios ocasionales como forma de evolución, es decir, deber aceptar la capacidad de mutar.La replicación permite que el ADN sea capaz de cumplir con las funcionesanteriormente mencionadas. La réplica del material hereditario es un producto directode este proceso; la información para la síntesis de las proteínas está asegurada pormedio de la replicación y los errores en la replicación posibilitan y generan cambios quepueden llevar a la evolución.La replicación del ADN es Semiconservativa, puesto que las dos cadenas del ADNsirven de patrón para la síntesis de las nuevas cadenas. Cada doble hélice hija, productodel proceso de autoduplicación, tendrá una cadena recién sintetizada (nueva) y otracadena que, con anterioridad, formaba parte de la molécula parental. Figura N° 3: Replicación Semiconservativa del ADN. Obsérvese en la figura que las cadenas del ADN parental se conservan y pasan a formar parte de las cadenas hijas. En el esquema, las cadenas nuevas se visualizan en negrita.
  7. 7. Biología Molecular Lic. Marcelo F. GoyanesLa replicación se llevará a cabo en el núcleo de la célula eucariota, e intervendrán unadotación de enzimas que se encargarán de abrir la doble hélice, incorporar losnucleótidos y disminuir la tensión que se genere por delante de ella.Enzimología de la Replicación:Con el fin de esclarecer el proceso de replicación, describiremos primero todas lasenzimas que intervienen y luego desarrollaremos el proceso en su conjunto. ADN polimerasa: Es la principal enzima de este proceso. Ella es capaz de sintetizar nuevas cadenas de ADN , a partir de una hebra patrón y las unidades estructurales correspondientes (desoxirribonucleótidos). Los desoxirribonucleótidos, para ser incorporados por esta, deben estar trifosfatados. Es decir que se necesitarán dATPs, dGTPs, dTTPs y dCTPs, para poder sintetizar las nuevas cadenas de ADN. Otra de las características principales de esta enzima, es que polimerizará los nucleótidos en la dirección 5´a 3´. Como consecuencia de esto, la dirección en la cual leera la cadena patrón de ADN será de 3´a 5´ . Un rasgo a tener en cuenta es que la ADN polimerasa NO puede iniciar su síntesis sin la existrencia de un cebador de ARN. No solamente polimeriza los nucleótidos, sino que se ha comprobado que es capaz de corregir los posibles errores que se cometan durante la autoduplicación. Helicasas: Son las enzimas encargadas de separar las dos hebras del ADN. Estas enzimas son responsables de la ruptura de las uniones puente de Hidrógeno que se establecen entre las bases de las dos cadenas del ADN. Para poder separar las dos hebras del ADN se necesitará energía, que es obtenida de la hidrólisis del ATP. Por cada dos pares de bases que separan, se gastan dos moléculas de ATP. Proteínas estabilizadoras de la cadena: Una vez que las cadenas del ADN son separadas, la estabilidad de las mismas disminuye considerablemente. El ADN tiende a reasociarse y, son estas proteínas quienes impiden que el ADN vuelva a su conformación inicial. Su presencia es fundamental para mantener las cadenas estiradas. Topoisomerasas: Al producirse la duplicación, el ADN adquiere cierto grado de superenrollamiento. Imaginemos que la molécula de ADN es como una bandita elástica, a la cual le conferimos vueltas alrededor de su eje longitudinal. Si ahora tomamos uno de sus extremos y separamos cada una de sus partes veremos que, por delante de donde se produce la separación, la bandita adquirirá una mayor tensión, plegándose sobre sí misma. Lo mismo ocurre con la molécula de ADN, si la Helicasa separa las cadenas delante de donde se está produciendo la replicación aumentará, en forma más que considerable, la tensión de la molécula. Para evitar esto, las topoisomerasas cortan la doble hélice, rotan el ADN y vuelven a unirlo, evitando así que aumente la tensión por delante de la horquilla de replicación. En consecuencia, encontraremos a las Topoisomerasas por delante del lugar donde se está produciendo la duplicación. ARN polimerasa o Primasa: Esta enzima es la que sintetiza el cebador, un primordio de ARN necesario para que la ADN polimerasa pueda iniciar la síntesis de las
  8. 8. Biología Molecular Lic. Marcelo F. Goyanes nuevas cadenas. El cebador es una pequeña porción de ARN de 10 a 12 ribonucleótidos de largo que se mantendrá unido a la cadena de ADN molde hasta que sea removido.Mecanismo de la Replicación:Ya dijimos que la duplicación se llevará a cabo durante el período S del ciclo celular yque es un proceso fundamental para que la célula pueda dividirse.El ADN actuará como patrón, ya que la ADN polimerasa agregará los nucleótidos de lasnuevas cadenas por complementariedad de bases. El lugar donde transcurre lareplicación se denomina Horquilla de Replicación, esta estructura tiene forma de “Y”, yes la zona donde se sintetiza el ADN para formar las dos moléculas hijas (Ver figurasNº 4 y 5). Las horquillas de replicación se originan en una estructura denominadaBurbuja de Replicación, una región en la que las cadenas de la hélice de ADN seseparan una de otra, actuando como patrón para la síntesis de las nuevas cadenas deADN. Las zonas donde se producen las Burbujas de replicación no son aleatorias, se hademostrado que existen secuencias de bases que indican los lugares precisos donde lareplicación ha de comenzar. Cada Burbuja de Replicación posee dos Horquillas deReplicación, una de las cuales se desplaza hacia la derecha y otra hacia la izquierda.Este proceso necesita, en primera instancia, que las dos cadenas del ADN se separen.Para esto, las Helicasas se unirán a la cadena de ADN e hidrolizarán las uniones Puentede Hidrógeno que las mantienen unidas. La consecuente apertura de la doble hélice haceque las cadenas simples adquieran inestabilidad, esta es compensada por la unión de lasproteínas estabilizadoras de la cadena simple.La ADN polimerasa no es capaz de iniciar la síntesis a partir de losdesoxirribonucleótidos libres, por lo tanto necesitará que la Primasa sintetice en formaprevia el Primer o Cebador. Una vez incorporado el Cebador, la ADN polimerasaincorporará los nucleótidos en forma complementaria a las bases de la cadena patrón.Una vez que la Horquillaavance, la tensión pordelante de la mismaaumentará, para evitar estolas Topoisomerasas cortaránla doble hélice, la rotarán yvolverán a unirla.Debido a la orientaciónantiparalela del ADN, una delas cadenas de la horquilla dereplicación quedará ensentido 3´a 5´, por lo cual laADN polimerasa podrátrabajar en forma continua(recordemos que esta enzimaleía en dirección 3´a 5´y Figura N° 4: Horquilla de replicación. Síntesis de la cadena continua y de la discontinua.polimerizaba en dirección5´a 3´).En cambio, la otra cadena de la Horquilla, quedará orientada en la dirección inversa(5´a 3´), por lo cual en cada Horquilla de Replicación deberán actuar al menos dosADN polimerasas. Una de ellas podrá actuar en forma contínua, puesto que, a medidaque se abra la doble hélice se encontrará con el extremo 3´ de la cadena patrón,
  9. 9. Biología Molecular Lic. Marcelo F. Goyanespudiendo así incorporar el nucleótido correspondiente. En cambio, la otra ADNpolimerasa se encontrará, cuando la apertura de la doble hélice avance, con el extremo5’ de la cadena patrón, por lo cual será necesario incorporar otro cebador de ARN parapoder continuar la síntesis. En resumen: cuando la cadena patrón presente la dirección 3´a 5´, la síntesis se realizará en forma Continua. Por el contrario, cuando la cadena patrón. presente la dirección 5´a 3´, la síntesis se realizará en forma Discontinua.Una de las consecuencias de la síntesis Discontinua es que quedarán pequeñosfragmentos de ADN, de unos 100 a 200 pb, intercalados con los cebadores. A estasporciones de ADN se los denomina Fragmentos de Okazaki, en honor al científico quelos describió por primera vez.En el caso de la cadena conductora (la que se polimeriza en forma continua) esnecesario la presencia de un solo Cebador, en cambio, en la cadena retardada (la que sepolimeriza en forma discontinua) se necesita más de un Primer.Luego de terminada la síntesis de ambas cadenas, los Cebadores son removidos por unaenzima y la ADN polimerasa agrega los nucleótidos faltantes. La enzima denominadaLigasa, se encarga de unir ambos extremos del ADN. Figura N° 5: Proceso de Replicación del ADN. Obsérvese la Horquilla de Replicación en la cual se encuentran actuando las dos ADN polimerasas. La cadena con dirección 3´a 5´ se replica en forma continua y la de dirección opuesta lo hace en forma discontinua. La Primasa sintetiza el Cebador. La Topoisomerasa actúa en forma adelantada a la Horquilla de Replicación, disminuyendo el superenrollamiento positivo.
  10. 10. Biología Molecular Lic. Marcelo F. GoyanesEnergética de la Replicación:Ya hemos mencionado que las unidades estructurales utilizadas en este proceso son losdesoxirribonucleótidos. También se dijo que los mismos debían encontrarsetrifosfatados para poder ser utilizados por la ADN polimerasa. Es así como se utilizaránDesoxiadenina trifosfato (dATP), Desoxiguanina trifosfato (dGTP), Desoxicitosinatrifosfato (dCTP) y Desoxitimina trifosfato (dTTP). Antes de incorporar el nucleótido ala cadena patrón, la ADN polimerasa escinde dos de los tres grupos fosfato de losmismos, quedando así monofosfatados y liberándose por cada uno un PPi. Esta rupturade los enlaces de alta energía que mantenía unidos a los P libera energía, que esutilizada para impulsar las reacciones catalizadas por la ADN polimerasa.Replicación en Células Procariotas y Eucariotas:La gran mayoría de la información con la que contamos, en materia de la replicación delADN, se obtuvo a partir de investigaciones realizadas en organismos Procariotas. Sinembargo, no hay diferencias sustanciales entre ambos procesos. La principal diferenciaradica en que las células Procariotas replican el ADN en forma desnuda, puesto que enlas células Eucariotas el ADN se encuentra es estado de Cromatina. Esta Cromatinaesta básicamente formada por ADN y proteínas básicas denominadas Histonas. Comoveremos más adelante, las Histonas se unen al ADN y ayudan al empaquetamiento delmismo. Las proteínas nucleares frenan el accionar de la ADN polimerasa, por lo tanto,la velocidad de replicación en las células Eucariotas es diez veces menor que en lascélulas Procariotas. Basándose en esto, también es posible explicar la diferencia entrela longitud de los Fragmentos de Okazaki. En las células Procariotas, los segmentos deOkazaki poseen una longitud de 1000 a 2000 pb en cambio, en las células Eucariotas,los Fragmentos adquieren longitudes de apenas 100 a 200 pb. Una de las explicacionesposibles es la disposición de las histonas a lo largo de la molécula de ADN, estalongitud de 200 pb coincide con los tramos de ADN que quedan desprovistos demencionadas proteínas. Figura N° 6: Replicación del ADN. La figura muestra el proceso por el cual se inicia la burbuja de replicación. A) La replicación se inicia en una secuencia de 300 pb, que indican el origen de la misma. B) La doble hélice se abre, conformando la burbuja de Replicación, la Primasa sintetiza el Cebador. C) Una vez sintetizado el cebador, la ADN polimerasa comienza a sintetizar la nueva cadena de ADN. D) Se originan dos Horquillas de replicación completas, una de las cuales se desplaza hacia la izquierda con la cadena continua en la parte superior y la retrasada en la parte inferior, y la otra hacia la derecha, con la cadena continua en la parte inferior y la cadena retrasada en la parte superior.

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