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Manualbiok

  1. 1. ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA I.P.N. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE FORMACIÓN BÁSICA DISCIPLINARIA ACADEMIA DE BIOQUÍMICA MÉDICA I MANUAL DE LABORATORIO SEMESTRE ENERO – JUNIO 2011ALUMNO: Grupo: 2CM PROFESORESTITULAR:LABORATORIO:LABORATORIO:LABORATORIO: PRÁCTICA AUTORIZACIÓN 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11Laboratorio de Bioquímica Médica 1 1
  2. 2. ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA I.P.N. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE FORMACIÓN BÁSICA DISCIPLINARIA ACADEMIA DE BIOQUÍMICA MÉDICA I TITULARES DE GRUPO JUAN GUILLERMO ORDORICA VARGAS FRANCISCO JAVIER CASTAÑEDA IBARRA MIGUEL ANGEL ORDORICA VARGAS FELICIANO TAMAY CACH JOSÉ GUADALUPE TRUJILLO FERRARA ALFREDO MONTIEL MÁRQUEZ MARTHA CECILIA ROSALES HERNÁNDEZ ARTURO DÍAZ MARTÍNEZ MARÍA DE LA LUZ VELÁZQUEZ MONROY SANDRA GISSELA MÁRQUEZ RAMÍREZ REYNA ELIZABETH BARBOSA CABRERA JESSICA ELENA MENDIETA WEJEBE IO STEPHANIE ZAMUDIO VEGA LETICIA ARACELI RAMÍREZ DURÁN EUNICE DALET FARFÁN GARCÍA LUZ MARÍA CHIRINO CASTILLO MARÍA DEL ROSARIO LEÓN REYES LABORATORIO CLAUDIA CAMELIA CALZADA MENDOZA ERÉNDIRA YADIRA CARRERA GARCÍA SANDRA CASELÍN CASTRO CRISTINA LOPEZ GLORIA ARGENTINA HERNANDEZ RAMOS MARIA TERESA LÓPEZ VENEGAS ARTURO RAMIREZ CRUZ ANAYETZIN TORRES RIVERA Auxiliares de Laboratorio: José Luis Martínez Vásquez Alex Hernández Aguilar Julio César Aguilar Rentería Manual Versión Enero de 2011 Editado por: Dra. Luz María Chirino Castillo y Dr. Arturo Díaz MartínezLaboratorio de Bioquímica Médica 1 2
  3. 3. ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA I.P.N.ÍNDICENo. TEMA Página: 1 INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO 4 2 SOLUCIONES 9 3 ELECTROLITOS Y pH 16 4 SOLUCIONES REGULADORAS 19 5 PROTEÍNAS 24 6 CINÉTICA QUÍMICA Y CATÁLISIS 32 7 CINÉTICA ENZIMÁTICA 40 8 GLÚCIDOS 46 9 OXIDACIONES BIOLÓGICAS 5210 LÍPIDOS 5811 ÁCIDOS NUCLEICOS 62Laboratorio de Bioquímica Médica 1 3
  4. 4. ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA I.P.N. 1. INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA MÉDICA IS e revisan conceptos y procedimientos de importancia para el trabajo en el laboratorio. El alumno deberá previamente haber leído, entendido, comprendido, estar de acuerdo con, y sujetarse al Reglamento de laAcademia de Bioquímica. • Las actividades de laboratorio constituyen una parte importante del aprendizaje de la bioquímica médica y complementan las actividades de la materia impartidas en el aula. • Es obligación del alumno la asistencia puntual, así como la participación activa, la recolección de resultados de los experimentos y la entrega de reportes de los mismos. • Es de la mayor importancia cumplir meticulosamente con las medidas de seguridad tanto en comportamiento, uniforme y accesorios como guantes, anteojos de protección o caretas transparentes, cubre bocas, bata larga, y otros como pre pipetas. DISTRIBUCIÓN DE LOS ALUMNOSEJERCICIO 1Antes de entrar al laboratorio, todos los alumnos deberán portar, debidamenteabotonada, su bata de laboratorio y tener listo su material de trabajo. a)Cuando el profesor lo indique, los alumnos colocarán su mochila en el lugar que les sea asignado. b)Siguiendo las instrucciones de su profesor, localice su mesa de trabajo e inmediatamente diríjase a ella. c)En su mesa, localice las tomas de corriente, desagües, tuberías y sitios donde puede trabajar. d)Ubique la posición de su mesa de trabajo con respecto de la mesa de la campana, instalaciones de seguridad, extintores, zonas de seguridad y rutas de evacuación. e)Con base en la explicación recibida, identifique el uso de cada una de las tuberías que encuentre en su mesa de trabajo y márquelas con masking tape. Espere a que su profesor confirme que su etiquetado es correcto. f)Localice la posición de las válvulas de seguridad de cada tubería. 1.Dibuje un esquema de su mesa señalando la posición de las tomas decorriente, desagües y válvulas de flujo. 2.Dibuje un esquema simple del laboratorio e indique en él las zonas deseguridad, la posición del equipo de seguridad y marque la ruta de evacuación desdesu mesa. 3.En el esquema de la mesa de trabajo que elaboró en el ejercicio anterior,marque la posición de las válvulas de seguridad.Laboratorio de Bioquímica Médica 1 4
  5. 5. ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA I.P.N. EL VALE DE MATERIAL DE LABORATORIOEJERCICIO 2 a)Localice en la charola de material de laboratorio el vale, el cual es undocumento que enlista el material que se le confía para la realización de cadapráctica. De acuerdo con esta lista identifique y revise cuidadosamente cada una delas piezas, indicando en el vale cualquier defecto que encuentre. b)Rotule cada pieza identificada con una etiqueta de masking tape. Reúna en lacharola el material de nombre y/o empleo desconocidos, o de cuyo estado tengaduda, y pregunte a su profesor. Espere a que su profesor compruebe que suidentificación del material es correcta. c)Una vez revisado todo el material, complete los datos solicitados en el vale,(fecha, grupo, equipo, responsable, etc.) y entréguelo al personal técnico delaboratorio. 1.¿Cuál es el uso de cada una de las siguientes piezas de material delaboratorio? Pipeta Mortero Bureta Tubo de ensayo Probeta MANEJO DEL MECHERO FISHEREJERCICIO 3 a)No encienda el mechero hasta que su profesor se lo indique. b)Si es necesario, conecte el tubo de plástico del mechero a la llave de gas, laque deberá estar completamente cerrada, con la manija en posición transversalrespecto de la salida del gas. Recuerde que la tubería de gas es de color amarillo. c)Asegúrese que el tornillo de control de flujo de gas esté abierto más o menosa la mitad de su capacidad total. El flujo de gas se disminuye girando el tornillo en elsentido de las manecillas del reloj y se aumenta en sentido contrario. d)Encienda el mechero aproximando la flama de un cerillo o encendedor alborde de la parte superior del mechero inmediatamente después de abrir la llave degas, lo cual debe hacerse lentamente, avanzándola hasta que esté aproximadamentea 45 grados con el tubo del gas. Tenga cuidado de no acercar su rostro, pelo uobjetos inflamables al mechero al momento de encenderlo ni cuando estéencendido. Al usar el mechero no deberá portar guantes clínicos hechos delátex o polietileno, tenga cuidado, ya que son inflamables. e)Ajuste la cantidad de aire que entra, usando el arillo de control de flujo deaire, hasta que la flama tenga una zona central de color azul claro rodeada de otra decolor azul oscuro o violeta. La parte más caliente se encuentra en la punta de la zonainterna. Cuando la combustión es incompleta, por falta de oxigeno, la flama tienecolor amarillo. f)Deje el mechero encendido para usarlo en el ejercicio siguiente.Laboratorio de Bioquímica Médica 1 5
  6. 6. ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA I.P.N. 1) Elabore un esquema del mechero de FISHER, en el que se indique la posición del tornillo de control de flujo de gas, el arillo de control de flujo del aire y la entrada del gas. COMO CALENTAR UN LÍQUIDO EN UN TUBO DE ENSAYOEJERCICIO 4 a)Todos los miembros del equipo deben usar los anteojos deprotección. b)Llene el tubo de ensayo hasta un 20% de su capacidad con agua de la llave ysujételo con las pinzas para tubo de ensayo. c)En caso necesario quitarse los guantes de látex antes de iniciar elcalentamiento d)Coloque el tubo sobre la flama del mechero, inclinado aproximadamente a 70grados y cuidando que la flama caliente la parte superior del líquido. Nunca calienteun tubo de ensayo en el fondo o en posición vertical porque se puedeproyectar su contenido. e)Mueva el tubo cuidadosamente, sin sacarlo de la flama, para que el líquido secaliente de manera uniforme f)Durante el calentamiento dirija la boca del tubo hacia un lugar en queno se encuentre ninguna persona o material que se pueda dañar. g)Jamás mire directamente la boca de un tubo de ensayo que se estácalentando, aunque esté fuera de la flama del mechero. h)Continúe el calentamiento hasta lograr que el agua hierva, sin proyectarse. i)Nunca caliente solventes orgánicos en tubo de ensayo directamenteen la flama del mechero. Hágalo siempre en baño maría. 1.Elabore un esquema de la forma correcta de calentar un líquido en un tubo deensayo. MANEJO DE REACTIVOS LÍQUIDOSEJERCICIO 5a a)Para manejar con seguridad los reactivos líquidos se usa siempre la prepipeta. b)Después de abrir un frasco de reactivo, coloque el tapón sobre la mesa enposición invertida, para evitar contaminación. c)Para extraer el líquido utilice una pipeta o un gotero limpios. Nunca viertareactivos directamente del frasco para evitar escurrimiento. d)Usando la pipeta de 10 mL, transfiera 5 mL de agua de un vaso deprecipitados a un tubo de ensayo. Repita la maniobra hasta que pueda realizarla conseguridad. 1)Describa la forma como ensambló su pre pipeta.EJERCICIO 5bLaboratorio de Bioquímica Médica 1 6
  7. 7. ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA I.P.N. a)Prepare una serie de 4 tubos de ensayo. Numere los tubos del 1 al 4.Coloque en el tubo número uno 2.5 mL de agua. En el tubo número dos, 1.25 mL deagua. En tanto que en el tubo número tres deposite 0.8 mL de agua y en el tubonúmero cuatro, deposite 0.6 mL de agua. b)Utilice para cada tubo de ensayo una pipeta de capacidad adecuada. Repitaeste ejercicio hasta que pueda realizarlo con seguridad y precisión. 1.Elabore un esquema que describa este experimento.EJERCICIO 5c a)Monte el dispositivo de titulación según indicaciones de su profesor yaprenda a manejar con soltura y seguridad la llave de su bureta. Familiarícese con elprocedimiento de dejar gotear el líquido de la bureta, en este caso agua, o dejar salirde la misma cantidades fijas como por ejemplo, de un mL cada vez, de 5 mL cadavez, etc. Asimismo, deberá aprender a leer con precisión la escala de la bureta. 1.Elabore un esquema del dispositivo de titulación. MANEJO DE REACTIVOS SÓLIDOSEJERCICIO 6 a)Prepare una charola de papel usando una hoja de papel limpio, de preferenciaencerado. Esta charola se prepara doblando el papel aproximadamente a uncentímetro de cada borde y colocándolos en ángulo recto para formar una pared en laperiferia del papel. El tamaño de la charola depende de la cantidad de reactivo apesar. b)Encienda la balanza y espere a que se estabilice la lectura. Coloque la charolade papel en el plato de la balanza. Cuando se estabilice, por medio del botón detarar, tare a cero la balanza. c)Abra el recipiente del reactivo y coloque la tapa sobre la mesa, boca arriba,para evitar la contaminación. d)Por medio de espátula saque el reactivo del recipiente y colóquelo sobre lacharola de papel. Si se rebasa la cantidad deseada, regrese el exceso de reactivo alrespectivo recipiente usando la espátula. Nunca regrese al recipiente original unreactivo que caiga fuera de la charola de papel o sobre la mesa. e)Pese la cantidad de cloruro de sodio que le indique su profesor y colóquelaen el sobre de papel que se le proporciona. Escriba en el sobre el nombre y lacantidad de reactivo que contiene. f)Cierre inmediatamente el frasco de reactivo para evitar que se hidrate ocontamine. Asegúrese de que la mesa y la balanza queden limpias. 1) Elabore un diagrama de la balanza, señalando la posición del botón de encendido y apagado y del botón de tara. TARAR TUBOS PARA CENTRIFUGAREJERCICIO 7 a)En este ejercicio se usará la balanza de dos platillos.Laboratorio de Bioquímica Médica 1 7
  8. 8. ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA I.P.N. b)Coloque las pesas de medición en la posición de cero. Asegúrese de que laaguja o fiel de la balanza esté en posición cero. Si no lo está, gire cuidadosamente laspesas de ajuste en el sentido que sea necesario hasta lograr el equilibrio. c)Coloque un frasco gerber en cada platillo, cuidando que el más pesado quededel lado izquierdo. d)Deslice las pesas de medición de la balanza hasta lograr que el fiel vuelva ala posición de equilibrio. e)Coloque en cada frasco una camisa de la centrífuga con un tubo adecuadopara centrifugar dentro. f)Usando una pipeta, añada agua de la llave entre la camisa y el tubo más ligerohasta lograr que el fiel de la balanza regrese al equilibrio. 1) Elabore un esquema de la balanza de platillo señalando la posición de las pesas de ajuste y las de medición.Laboratorio de Bioquímica Médica 1 8
  9. 9. ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA I.P.N. 2. SOLUCIONESU na solución es un sistema homogéneo monofásico, formado por dos o más sustancias químicas y presenta las mismas propiedades fisicoquímicas en todas sus partes. Está formada por un solvente (líquido) en el cual se dispersanmolecularmente uno mas solutos (sólidos). Cuando ambos son líquidos miscibles, seacostumbra nombrar solvente al que se encuentra en mayor cantidad. La relación que existe entre las cantidades de soluto y solvente en una soluciónse llama concentración. Para explicar concentración necesitamos la definición demol. Un mol se define como el peso molecular en gramos de una sustancia, o sea lamasa de una sustancia que contiene el mismo número de átomos o moléculas quehay en 12 g de 12C. (6.022 x 1023 o Número de Avogadro). La masa molecular opeso molecular (PM) de una sustancia es la suma de los pesos atómicos de suscomponentes; por ejemplo: PM del ácido sulfúrico (H2SO4): 98 g/mol. Con un mol podemos preparar una solución 1 molar (1M) la cual contiene unmol de soluto en un litro de solución.Si dividimos los gramos de un mol entre la valencia del compuesto, y diluimos hastaaforar a un litro tendremos una solución 1 normal (1N). Existen varias formas de expresar la concentración de una solución. Las de usomás frecuente son: • MOLARIDAD (M). Número de moles de soluto en un litro de solución. Un mol es el peso molecular expresado en gramos. • MOLALIDAD (m). Número de moles de soluto en 1000 g de solvente. • NORMALIDAD (N). Número de equivalentes químicos de soluto en un litro de solución. • FRACCIÓN MOLAR (Xi). Número de moles de una sustancia en una solución entre la suma de los moles de todos los componentes de la misma. PORCENTUAL (%). Expresa el porcentaje de soluto en una solución. Existendiferentes tipos: • Porciento en peso (% p/p). Número de gramos de soluto en 100g de solución. • Porciento en volumen (% v/v). Número de mililitros de soluto en 100 mL de solución. • Porciento en peso-volumen (% p/v). Número de gramos de soluto en 100 mL de solución. PROPIEDADES DE LAS SOLUCIONES Se pueden dividir en tres categorías: Constitutivas, Aditivas y Coligativas.Constitutivas: • Dependen de la constitución química de sus moléculas, como la presencia de grupos funcionales, tipo y disposición de los átomos, etc. • Son propiedades constitutivas el carácter ácido, básico, oxidante, reductor, radioactivo, dulce, insípido, colorido, etc.Laboratorio de Bioquímica Médica 1 9
  10. 10. ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA I.P.N.Aditivas: • Dependen de la suma de las propiedades correspondientes a los constituyentes de la solución. • como la concentración, densidad, viscosidad.Coligativas: • Dependen del número de partículas por unidad de volumen. • Son muy importantes para los procesos biológicos e incluyen: a) Elevación del punto de ebullición b) descenso de la presión de vapor y/o del punto de congelación c) presión osmótica d) así como las constantes crioscópica, y ebulloscópica, etc. DIFUSIÓN, ÓSMOSIS, DIÁLISIS. Difusión es el proceso físico químico por el cual las moléculas, ya sea en estadode gas o líquido, tienden a distribuirse uniformemente por todo el espacio de quedisponen formando un medio homogéneo. En el caso de los gases, la difusión está sujeta a la “Ley General de laEnergía”, la cual establece que la velocidad con que se mueve una partícula esinversamente proporcional a la raíz cuadrada de su masa. Las propiedades dinámicas de las soluciones son: • Difusión Simple • y Difusión a través de membranas (Ósmosis y Diálisis). En los líquidos la velocidad de difusión es afectada por varios factores. Entre ellos tenemos: a)Naturaleza de la sustancia que difunde b) Área de difusión c)Tamaño y concentración de las partículas d) Temperatura Graham hizo notar estos factores que influyen sobre la difusión y Fick, de acuerdo con los mismos estableció la siguiente relación: dm dc v = ---- = KQ ---- dt ds v = velocidad de difusión K = Constante de Difusión dm = cantidad de sustancia que difunde dt = tiempo que tarda en efectuarse la difusión dc = concentración de la sustancia que difunde ds = espacio que recorre la sustancia al difundir. Así, la velocidad de difusión es directamente proporcional al gradiente de concentración y al área de sección. A temperatura, gradiente de concentración y área constantes, cada sustancia tiene una velocidad de difusión característica conLaboratorio de Bioquímica Médica 1 10
  11. 11. ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA I.P.N. relación al peso molecular por lo que se incluye una constante K llamada constante de difusión. DIFUSIÓN SIMPLE (En líquidos) EXPERIMENTO 1 Llene casi completamente una probeta de 100 mL con agua de la llave y luego espolvoree, con un aplicador de madera, unos granitos de azul de metileno sobre la superficie del agua y observe que ocurre. Anote sus observaciones. A continuación caliente ligeramente la probeta en cualquier punto y nuevamente observe que ocurre al agregar calor. Anote sus observaciones. Una vez homogeneizado el colorante, la difusión se ha efectuado. 1)¿Es uniforme el descenso del colorante por la columna de agua? 2)¿Qué sucede si se calienta ligeramente un punto de la probeta? 3)¿Qué es disolución, convección y difusión? DIFUSIÓN A TRAVÉS DE MEMBRANAS Cuando se interpone en el sistema una membrana dialítica, permeable al agua ya solutos cristaloides pero no a coloides, la sustancia sigue difundiendo como si lamembrana no existiera dependiendo de los factores ya señalados, pero la naturalezade la membrana será un factor adicional. En estos casos, K recibe el nombre deconstante de permeabilidad. Esta difusión es inversamente proporcional a su pesomolecular. ÓSMOSIS Y PRESIÓN OSMÓTICA Si dos soluciones de diferente concentración están separadas por unamembrana semipermeable, el solvente de la solución menos concentrada difunde a lade mayor concentración. Esto se explica termodinámicamente porque la solucióndiluida tiene una tendencia de escape o presión de vapor muy grande. Esta tendenciade escape o presión de vapor es muy baja cuando la solución está concentrada. Estefenómeno es conocido como ósmosis y ejerce una presión osmótica, propiedadcoligativa de gran importancia fisiológica ya que interviene en la regulación delvolumen de sangre circulante, así como en la formación o eliminación de edemastisulares, y es la razón por la cual el paciente diabético elimina frecuentementegrandes cantidades de orina (poliuria). Esta última está ocasionada por la altaconcentración de glucosa en sangre y forma parte de la triada sintomática clásicadel diabético: Polifagia, Polidipsia y Poliuria. MEDIDA DE LA PRESIÓN OSMÓTICA MÉTODO DIRECTOEXPERIMENTO 2Esta medición se lleva a cabo mediante el dispositivo llamado OSMÓMETRO. Esterequiere de una membrana semipermeable y aunque las que más se acercan a laperfección son las de ferrocianuro de cobre y las de pergamino, por ser más fácil deconseguir, se utilizará una membrana dialítica de colodión (celulosa) que nos daráuna medida aproximada de la presión osmótica.Laboratorio de Bioquímica Médica 1 11
  12. 12. ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA I.P.N. El osmómetro consiste en un compartimiento que contiene una solución desacarosa 1M teñida con rojo neutro y el cual es el cuerpo de una jeringahipodérmica de 5 mL de capacidad y la cual presenta una banda de hule inferior quepermite la fijación de una membrana de celofán, humedecida previamente durante 5a 10 minutos. Mientras que la banda superior sirve para sellar el orificio de llenado dela cámara. Por la parte correspondiente al pivote, se le agrega el trocar metálico deun catéter el cual se introduce en el extremo de un capilar de polietileno. El extremode esta cámara se sumerge en un vaso de precipitados con agua. • Una vez hecho esto se marca el nivel de la sacarosa en el tubo capilar, • leyendo cada 15 minutos el nivel ascendido hasta que se detenga el proceso. • Anote sus resultados en la tabla.Nota: cualquier error en el montaje del osmómetro se manifestará por salida desolución coloreada del dispositivo. Tiempo Altura min. mm 15 30 45 60 75 90 105 120 1)Grafique tiempo en las abscisas (eje x) y altura en milímetros en lasordenadas (eje y). CÁLCULO DE LA PRESIÓN OSMÓTICALaboratorio de Bioquímica Médica 1 12
  13. 13. ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA I.P.N. La columna de sacarosa ejercerá finalmente una presión que se opone al pasodel agua (Presión Hidrostática). Calculando ésta, se puede conocer la presiónosmótica ya que ambas son iguales. Esto se hace mediante la fórmula: π = hρ gπ = presión osmóticah = altura a la que asciende la solución de sacarosa (en metros)ρ = densidad de la solución de sacarosa (1.088 g/mL), (convertirla a kg/m3)g = aceleración debida a la gravedad (9.81 m/s2) Efectuando esta operación encontramos la presión osmótica en Pascales. Paraobtener atmósferas usamos la siguiente equivalencia: 1Pa 1Atm = --------------- 1.013 x 105 1)¿Cuándo deberá detenerse el proceso osmótico? 2)¿Depende sólo de la altura la presión osmótica? Explique. 3)¿Influye el radio del capilar en la presión osmótica? Explique. 4)¿La sacarosa y el colorante dializan? PREPARACIÓN DE SOLUCIONES PORCENTUALESExperimento 3 Utilice la cantidad de NaCl que se proporciona en un sobre con el material,(rotulado en miligramos), prepare una cantidad determinada de solución de NaCl al2% considerando que la pureza del reactivo es de 100%. 1)Describa detalladamente los cálculos que hizo para conocer la cantidad deagua destilada que es necesario añadir al NaCl del sobre para que la solución sea al2%. 2)Conserve esta solución ya que se utiliza en el experimento 4Considerando que la solución de NaCl es al 2% calcule las concentraciones siguientes: Molaridad Normalidad MEq/ml mg/ml moles % Osmolaridad DIÁLISIS Ejemplo de membranas dialíticas son el celofán y el colodión. Se deberá ponerparticular atención al hecho de que este experimento es la base del tratamiento depacientes renales descompensados por medio de diálisis, la cual es útil también paraLaboratorio de Bioquímica Médica 1 13
  14. 14. ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA I.P.N.eliminar sustancias nitrogenadas, medicamentos en exceso o exceso de acidez ensangre. Médicamente se refieren diversos tipos de diálisis de los cualesmencionaremos la Hemodiálisis y la Diálisis peritoneal.EXPERIMENTO 4Como antecedente de este experimento prepare dos tubos de ensayo, • coloque en uno de ellos 2 mL de NaCl al 2% y 5 gotas de AgNO3 (nitrato de plata). • Al otro tubo agréguele 2 mL de solución de almidón al 1% y 2 gotas de solución de Lugol. • Observe la reacción que ocurre en cada tubo. • Rotúlelos como testigo de cloruros y testigo de almidón respectivamente. Humedezca por inmersión en agua destilada durante 10 minutos la sección deltubo de colodión o celofán de aproximadamente 6 cm de largo por 2.5 cm dediámetro y cierre un extremo atándolo con hilo de algodón. • Llénelo con una mezcla de 1 mL de solución de NaCl al 2% preparado en el experimento 3 y 10 mL de solución de almidón al 1%. • Ate cuidadosamente el otro extremo del saco y suspéndalo en un vaso de precipitados con agua destilada. • Se determinará la presencia de almidón y de cloruros en el líquido del vaso de precipitados que rodea al saco, a tiempo cero, a la hora y a las dos horas. Pasado este tiempo repita las dos pruebas en el líquido contenido en elsaco. 1)¿Ha dializado el almidón a través de la membrana? 2)¿Dializó el cloruro de sodio? 3)Explique este fenómeno. PREPARACION DE SOLUCIONESEXPERIMENTO 5 Prepare 100 mL de solución 0.5M de ácido acético (CH3-COOH) tomando comobase los siguientes datos: El ácido acético tiene un peso molecular de 60, la purezadel reactivo es de 99.7% y la densidad a 20°C es de 1.06 g/mL. Una vez preparada consérvela para utilizarla en el experimentosiguiente. 1)Describa detalladamente los cálculos que hizo para conocer el volumen deácido acético concentrado que utilizó para preparar los 100 mL de dicha solución. R = _________ mL de CH3-COOH. 2)Considerando que la solución es 0.5M calcule las concentraciones siguientes: % (p/v) = Normalidad = mmoles/L =Laboratorio de Bioquímica Médica 1 14
  15. 15. ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA I.P.N. gramos/L = mEq % = Os molaridad = DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN POR TITULACIÓNEXPERIMENTO 6 En este experimento se utilizará la solución de ácido acético (CH3-COOH)(solución problema) que se preparó en el experimento 5. • En un matraz Erlenmeyer de 250 mL coloque 10 mL de la solución de ácido acético problema, midiéndolos con la mayor exactitud posible. • Añada 2 gotas de fenolftaleína y titule utilizando solución de NaOH 0.2N. Recuerde que el punto de titulación se observará cuando persista por más de un minuto un ligero color rosa. 1)¿Cuántos mL de NaOH 0.2N gastó para neutralizar los 10 mL de la soluciónde ácido acético? R = _________ mL 2)De acuerdo con los resultados que obtuvo y considerando que la solución deNaOH es exactamente 0.2N. ¿Cuál es la verdadera normalidad del ácido acéticoproblema? 3)Escriba el concepto de titulación ácido-base.Laboratorio de Bioquímica Médica 1 15
  16. 16. ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA I.P.N. 3. ELECTRÓLITOS y pHC uando una corriente eléctrica circula por una solución acuosa de cloruro de sodio (NaCl), hay una transferencia de materia, la cual consiste en partículas con carga llamadas iones. Los iones que se mueven hacia el ánodo (polopositivo) son los aniones, los que migran hacia el cátodo (polo negativo) son loscationes y hay liberación de hidrógeno y cloro, evidencia de la descomposición delagua, proceso al cual se le llama electrólisis. Las sustancias que permiten el paso de la corriente se conocen comoelectrólitos y a los que no manifiestan esta propiedad como no electrólitos. A estacapacidad de dar paso a la electricidad se le conoce como conductancia. Los electrólitos de clasifican en fuertes y débiles según su potencia paraconducir la corriente eléctrica. • Los electrólitos fuertes son los muy disociables como las sales minerales, los hidróxidos de metales alcalinos, y los ácidos minerales. En los líquidos del organismo encontramos como ejemplo de electrolitos fuertes al cloruro de sodio (NaCl), cloruro de potasio (KCl) y cloruro de calcio (CaCl2), entre otros. • Son electrólitos débiles la mayor parte de los compuestos orgánicos (como los ácidos láctico, pirúvico, etc.), y los compuestos nitrogenados. En el agua corporal hay muchos ejemplos de compuestos no electrólitos comoglucosa, urea y creatinina. CONDUCTIVIDAD La conductividad de las soluciones electrolíticas depende exclusivamente de lasmoléculas disociadas, y por lo tanto depende del grado de disociación y de laconcentración de los electrólitos presentes. Entre mayor sea la concentración, mayorserá la conductividad, hasta un límite determinado en el cual se hace constante yluego disminuye, explicándose esto porque cuando la concentración de cationes yaniones es grande, interfieren entre sí y en tal caso los cationes tienen una menorlibertad para desplazarse debido a la interacción con los aniones cercanos en lasolución y viceversa. Esta explicación se puede aprovechar para explicar la fuerza iónica de unasolución, ya que al no desplazarse libremente las moléculas en la solución, la“concentración activa” o “actividad” de las soluciones es menor que la concentraciónreal, por lo tanto: ∑Cz 2 I = --------- 2 La fuerza iónica (I) es la semisuma del producto de la concentración(C) del ión por la valencia (z)al cuadrado. Se sabe que las fuerzas de atracción entre iones de carga con signos contrariosdisminuye rápidamente al crecer las distancias. En las soluciones concentradas, enLaboratorio de Bioquímica Médica 1 16
  17. 17. ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA I.P.N.las que los iones se encuentran más cercanos, se hacen mayores y por lo tanto laactividad se hace menor, en las soluciones muy diluidas la actividad y laconcentración efectiva son equivalentes entre sí. ELECTRÓLISIS DEL AGUAEXPERIMENTO 1 Coloque un cristalizador sobre un fondo blanco y agregue 50 mL de soluciónde NaCl al 10%. • Introduzca en la solución electrodos de carbón conectados a una fuente de energía como el puente de Wheatstone o una pila. • Observe la formación de gas, agregue entre los electrodos 5 gotas de azul de bromofenol como indicador • y observe los cambios de coloración en la solución cercana a los electrodos. • Intente captar el olor en cada electrodo y descríbalo. a)Anote las reacciones que se llevan a cabo en cada uno de los electrodos. b)Esquematice el proceso de la electrólisis del agua. CONDUCCIÓN DE CORRIENTE EN ELECTRÓLITOS FUERTES Y DÉBILESEXPERIMENTO 2 • Coloque la solución de ácido clorhídrico (HCl) 0.5M en un vaso de precipitados en cantidad suficiente para que tenga contacto con los electrodos en una tercera parte de su longitud. • Introduzca los electrodos conectados a una fuente de energía y observe el paso de la corriente eléctrica manifestado por la intensidad de la luz emitida por el foco. • Observe también la intensidad luminosa con relación a la distancia entre los electrodos, sin ponerlos en contacto.Repita el experimento usando ácido acético (CH3COOH) 0.5M. • Anote sus resultados. Intensidad Solución Variación con la distancia luminosa HCl 0.5M CH3COOH 0.5M PREPARACIÓN DE SOLUCIONES DE pH CONOCIDO CON ELECTRÓLITOS FUERTES Y DÉBILES Los ácidos o las bases se clasifican en débiles o fuertes según su grado dedisociación, así los electrólitos fuertes son los que están más disociados y por lo tantola concentración molar del ión hidrógeno o del ión hidroxilo en sus soluciones seráigual a la normalidad, lo que simplifica el cálculo de su pH. pH = -log [H+] y pOH = -log [OH-]Laboratorio de Bioquímica Médica 1 17
  18. 18. ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA I.P.N. Además en toda solución acuosa: pH + pOH = 14 Pero en el caso de los ácidos y bases débiles, los cuales están parcialmentedisociados, además de conocer la normalidad del ácido o base, deberá conocerse elgrado de disociación de la sustancia, o sea, la constante de disociación ácida Ka obásica Kb, la cual es diferente para cada sustancia. En el cálculo del pH se deberáaplicar la fórmula en la que se toman en cuenta la constante K de disociaciónrespectiva y la molaridad C de la solución. pH = 1/2pKa – 1/2log C y pOH = 1/2 pKb – 1/2log CEXPERIMENTO 3Empleando la fórmula que corresponda, calcule las cantidades adecuadas parapreparar 250 mL de cada una de las siguientes soluciones: • De ácido clorhídrico a partir de HCl al 37% de pureza y densidad de 1.18 g/mL. • De pH = 1.3, 1.6 y 2 • De ácido acético a partir de CH3-COOH al 99.7% de pureza, densidad de 1.06 g/mL y pKa = 4.74. • De pH = 3.02, 3.17 y 3.37 • Prepare el par de soluciones que le indique su profesor y consérvelas para el siguiente experimento. ACIDEZ VERDADERA Y ACIDEZ DE TITULACIÓNEXPERIMENTO 4 Determine colorimétricamente (con papel indicador) el pH de cada una de lassoluciones que preparó en el experimento anterior. A continuación determine el pHpotenciométrico de cada una de ellas. • Posteriormente, mida exactamente 20 mL de la solución de HCl que preparó, colóquelos en un matraz Erlenmeyer, • añada 2 gotas de solución de fenolftaleína y titúlela con NaOH 0.1N. • A continuación mida exactamente 20 mL de la solución de CH3-COOH que preparó, colóquelos en otro matraz Erlenmeyer, • añada 2 gotas de solución de fenolftaleína y titúlela con NaOH 0.1N.Con los datos obtenidos llene la tabla TITULACIÓN PH Solució Gasto de NaOH 0.1N mL concentraciónn teóric Colorimétri Potenciométric teóric Experiment (N tit x gasto)/V o co o o al prob HClCH3COOHLaboratorio de Bioquímica Médica 1 18
  19. 19. ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA I.P.N. 4. SOLUCIONES REGULADORASA las soluciones reguladoras se les pueden añadir cantidades relativamente grandes de ácidos o álcalis sin alterar de manera significativa su pH. Esta acción amortiguadora se debe a la presencia en la solución de un sistemaformado por un ácido o una base débil y su sal correspondiente. Si se toma como ejemplo una solución que contenga un ácido débil, al querepresentaremos por HA y su sal, representada por BA los hidrogeniones existentesen ella procederán únicamente de las moléculas ácidas, que se disocian como sigue: + - HA -- H + A El equilibrio de la reacción está dado por la siguiente ecuación: + - [H ] [A ] --------------------- = Ka [HA] Donde Ka es la constante de disociación del ácido. De esta ecuación se deduceque la concentración de hidrogeniones es: Ka [HA] + [H ] = ------------------ - [A ] La relación entre estas dos constantes es, sin embargo, tan sensiblementeconstante en condiciones ordinarias que podemos afirmar que la concentración de A-es igual a la concentración de la SAL. Sustituyendo una expresión por otra en laecuación anterior tenemos: [Ácido] + [H ] = Ka --------------- [Sal]Si se toman logaritmos negativos en ambos términos de la ecuación, (manipulaciónmatemática para manejar números muy pequeños o muy grandes), queda así: [Ácido] + - log [H ] = - log Ka – log --------------- [Sal] + Ahora bien, si -log [H ] es igual a pH, por analogía podemos decir que –logde Ka es igual a pKa por lo que:Laboratorio de Bioquímica Médica 1 19
  20. 20. ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA I.P.N. [Ácido] pH = pKa – log --------------- [Sal] Por otra parte por las leyes de los logaritmos, las expresiones –log de([Ácido]/[Sal]) y + log de ([Sal]/[Ácido]) son iguales y la segunda puedereemplazar a la primera, de tal modo que hechas todas las modificaciones la ecuaciónqueda finalmente como sigue: [Sal] pH = pKa + log ---------- [Ácido] Esta ecuación se conoce con el nombre de Ecuación de Henderson–Hasselbalch y nos indica que el pH de una solución que contenga un ácido débil ysu sal está determinado por el valor de pKa (constante para cada ácido) y por ellogaritmo del cociente que resulta de dividir la concentración de la sal entre laconcentración del ácido. Por ejemplo, el valor de la constante de disociación Ka del ácido acético es de1.8 x10-5. El valor de su pKa es por lo tanto igual a 4.74. Si tenemos una soluciónreguladora que posea iguales cantidades de ácido acético y acetato de sodio enconcentración 0.1N, el pH de esa solución sería de: 0.1N pH = 4.74 + log ---------- = 4.74 0.1N Además de servir para la preparación de soluciones de pH conocido, lassoluciones reguladoras tienen dentro del organismo un papel de importancia capitalque es el de evitar que aumente o disminuya de manera importante la concentraciónde iones hidrógeno, ya que la vida humana es posible en límites muy estrechos depH, es decir, para la sangre arterial un pH de 7.40 y para sangre venosa y líquidosintersticiales 7.35.Este último es menor por tener mas CO2 y por lo tanto mas H2CO3 producidometabólicamente. Se sabe que los límites máximos de pH en los que por algunosminutos puede permanecer el organismo sin sufrir muchas alteraciones son de 7.0 a7.8. En los líquidos donde existen y actúan al mismo tiempo varios sistemasamortiguadores, como sucede en la sangre, el ácido o la base que entra esamortiguado por todos los sistemas presentes de manera proporcional a la eficacia decada uno de ellos. La regulación fisicoquímica tiene lugar en todos los medios que contienenreguladores, constituidos principalmente por ácidos o bases débiles y sus sales. Porejemplo el de fosfatos H2PO4-/HPO4= con un pKa2 de 7.2 (o de 6.8 a latemperatura corporal), es el principal amortiguador intracelular. El principal amortiguador extracelular en la sangre y líquidos intersticiales esel sistema bicarbonato H2CO3/HCO3- con un pKa de 6.1.Laboratorio de Bioquímica Médica 1 20
  21. 21. ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA I.P.N.En el interior del eritrocito, además del bicarbonato, el amortiguador de mayorimportancia es el de hemoglobina reducida / oxihemoglobinato (HHb/HbO2).Otros sistemas son los de proteínas y aminoácidos. Todos estos sistemas funcionan de manera inmediata cuando existen excesosde álcali ó ácido ya que un cambio del pH afecta la estructura y la actividad de lasproteínas, la distribución de otros iones entre las células y el líquido extracelular, laactividad de hormonas y fármacos, etc. APRECIACIÓN DEL PODER REGULADOR Y EFECTO DE LA CONCENTRACIÓNEXPERIMENTO 1 • Disponga 3 series de 4 tubos de ensayo cada una. • Numere los tubos de cada serie del 1 al 4. • Coloque en los tubos número 1 de cada serie 5 mL de agua destilada hervida. • En los tubos número 2 coloque 5 mL de solución de cloruro de potasio (KCl) 0.5M • En los tubos número 3 ponga una mezcla formada por 2 mL de solución de fosfato diácido de potasio (KH2PO4) 0.01M y 3 mL de solución de fosfato monoácido disódico (Na2HPO4) 0.01M. • En los tubos número 4 ponga 2 mL de solución de KH2PO4 0.1M y 3 mL de solución de Na2HPO4 0.1M. 1. A continuación compruebe en la serie 1 que el pH de las soluciones es aproximadamente neutro, para ello agregue cinco gotas de indicador rojo de fenol (rosa), a cada uno de los tubos de la serie y observe el color característico amarillo o rojo correspondiente a un pH de 6.8 a 8.2. 2. A los cuatro tubos de la serie 2 adicione cinco gotas de verde de bromocresol, indicador de zona ácida. A continuación agregue 10 gotas de HCl 0.01M al tubo número 1 y observe el cambio de color que se opera (de verde a amarillo). 3. Enseguida vea el número de gotas de la misma solución de HCl 0.01M que es necesario agregar al tubo 2 de la serie en cuestión para igualar la coloración (aunque no la intensidad) con el tubo número 1. 4. Ahora, cuente el número de gotas de solución de HCl 0.1M que es necesario agregar a los tubos 3 y 4 para igualar la coloración con el tubo número 1. (Cada una de estas gotas de HCl 0.1M equivale a 10 gotas de HCl 0.01M)Laboratorio de Bioquímica Médica 1 21
  22. 22. ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA I.P.N.1. Adicione a los cuatro tubos de la serie 3, cinco gotas de azul de timol, indicador de zona alcalina que vira de amarillo a azul fuerte correspondiendo a un pH 8.0 a 9.6).2. A continuación agregue 10 gotas de solución de NaOH 0.01M al tubo número 1 y observe también el cambio de coloración (de amarillo a azul).3. Determine el número de gotas de la misma solución de NaOH 0.01M que es necesario agregar al tubo número 2 de esta serie para que adquieran el mismo color del tubo número 1, (amarillo a azul).4. A continuación, cuente el número de gotas de solución de NaOH 0.1M que es necesario agregar a los tubos 3 y 4 para igualar la coloración con el tubo número 1. 1)¿Qué indica el cambio de color en cada una de las series? 2)¿Cómo explicaría usted la diferencia en las cantidades de ácido y base quedeben agregarse a los tubos 2, 3 y 4 de las series correspondientes para igualar lacoloración con el tubo 1? 3) Recuerde que cada gota de las soluciones 0.1M equivale a 10 gotas de lassoluciones 0.01M. CURVAS DE TITULACIÓNExisten sustancias de mucha importancia en bioquímica como son los aminoácidos ylas proteínas los cuales tienen grupos titulables y que actúan como anfolitosaceptando iones H+ o iones OH-. En este experimento se determinarán las curvas detitulación de glicina con HCl y con NaOH.EXPERIMENTO 2 • En un vaso de precipitados de 150 mL coloque 30 mL de solución de glicina 0.1N, agregue una barra magnética y colóquela sobre el agitador, tómeles el pH y titule, como se indica en la tabla, con NaOH 0.1N. • En otro vaso de precipitados de 150 mL coloque 30 mL de solución de glicina 0.1N, agregue una barra magnética y colóquela sobre el agitador, tómeles el pH y titule, como se indica en la tabla, con HCl 0.1N.Laboratorio de Bioquímica Médica 1 22
  23. 23. ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA I.P.N. Agregar HCl 0.1N Glicina 0.1N Agregar NaOH 0.1N Glicina 30 ml 0.1N 30 ml ml Acumulativo pH ml Acumulativo PH 0 0 0 0 2 2 2 2 3 5 3 5 4 9 4 9 5 14 5 14 5 19 5 19 5 24 5 24 1 25 1 25 1 26 1 26 1 27 1 27 1 28 1 28 0.5 28.5 0.5 28.5 0.5 29 0.5 29 Grafique dando a los valores acumulativos de HCl signo negativo y a los deNaOH signo positivo, en el eje de las x y el pH en el eje de las y. 1)En su gráfica, identifique los valores de pK1 y pK2. 2)Calcule el punto isoeléctrico sabiendo que: pK1 + pK2 pI = ------------- 2 PREPARACIÓN DE SOLUCIONES REGULADORAS EXPERIMENTO 3 Empleando la fórmula de Henderson Hasselbalch, calcule los volúmenes necesarios para preparar soluciones amortiguadoras con los valores de pH que le indique su profesor, empleando fosfato diácido de potasio (KH2PO4) 0.1M y fosfato monoácido de sodio (Na2HPO4) 0.1M (pK2 = 7.2); posteriormente prepárelas y compruebe sus resultados midiendo el pH potenciométrico.Explique la coincidencia o no, entre sus resultados y el cálculo teórico.Laboratorio de Bioquímica Médica 1 23
  24. 24. ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA I.P.N. 5.PROTEÍNASP rincipales componentes del protoplasma y las membranas celulares, su nombre deriva del griego protos que significa “primero”, “primordial” o fundamental, contienen en su molécula C, H, O, N y en ocasiones P y S.El nitrógeno constituye aproximadamente el 16%; por hidrólisis dan como productofinal αα aminoácidos, los cuales varían en número, cantidad y posición en cadaproteína. La proteína está determinada por cuatro niveles estructurales • La estructura primaria depende del número y secuencia de aminoácidos unidos por enlace peptídico (-CO-NH-) covalente. • En la estructura secundaria la cadena polipeptídica puede enrollarse formando estructuras helicoidales u otro tipo de conformación, estabilizadas por puentes de hidrógeno • La estructura terciaria es una cadena polipeptídica ya enrollada que adopta la conformación más estable, o sea, sufre un súper enrollamiento. • La estructura cuaternaria puede estar constituida por más de una cadena polipeptídica y en la asociación de estas cadenas participan todos los tipos de enlaces químicos, fuertes o débiles, debido a lo cual adoptan una estructura tridimensional característica que les da actividad biológica. Existen muchos tipos de proteínas en el organismo, cada una con una funciónespecífica; algunas son estructurales, otras actúan como catalizadores uhormonas, generan presión oncótica para mantener el balancehidroelectrolítico, son mecanismos genéticos, de defensa, transportan gases,electrones, solutos a través de la membrana, etc. La actividad de una proteína depende de su conformación espacial, por loque agentes físicos y químicos que alteran los diferentes enlaces son capaces deanularla. Algunos de los agentes desnaturalizantes más comunes son ácidos obases, detergentes, metales pesados, solventes orgánicos, alcaloides, calor,radiaciones ultravioleta, rayos x, ondas ultrasónicas, sales inorgánicas,sustancias orgánicas como urea, guanidina, agentes reductores, agentesoxidantes, etc. Las proteínas desnaturalizadas pierden su actividad, modifican su solubilidady precipitan. Tal como existen en la naturaleza se denominan proteínas nativas. ALGUNAS PROPIEDADES QUÍMICAS DE LAS PROTEÍNAS Las propiedades fisicoquímicas y biológicas características de las proteínas sedeben a los aminoácidos que las constituyen y las reacciones coloridas que se utilizanpara su análisis en realidad detectan la presencia de un aminoácido específico. Ensayaremos a continuación algunas de ellas.Laboratorio de Bioquímica Médica 1 24
  25. 25. ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA I.P.N. REACCIÓN DE MILLÓN Es específica para el grupo fenólico y por lo tanto, la dan positiva todas lassustancias que poseen esta función, como el fenol, ácido salicílico, timol, tirosina ytodas aquellas proteínas que contengan tirosina.EXPERIMENTO 1 Prepare una serie de cuatro tubos de ensayo numerados, coloque en cada uno,2 mL de una de las soluciones siguientes: Tubo Proteína (al 2%) 1 Peptona 2 Caseína 3 Gelatina 4 Albúmina • Posteriormente añada 5 gotas del reactivo de Millón. • Caliente ligeramente hasta que la solución hierva. ¡Precaución!. • La presencia de tirosina se pone de manifiesto por la aparición de un precipitado blanco el cual por acción del calor se vuelve rojo.La presencia de sales, así como soluciones muy alcalinas, pueden interferir en estareacción. 1)Anote sus resultados en la tabla que se encuentra al final del capítulo. 2)Explique en qué consiste el reactivo de Millón y cuál es el mecanismo que seha propuesto para esta reacción. REACCIÓN DEL BIURET Todas las moléculas que contengan dos o más uniones peptídicas, por lotanto todas las proteínas y péptidos no menores de 3 unidades, dan positiva lareacción del biuret. El nombre se debe al compuesto biurea (NH2-CO-NH-CO-NH2) elcual da positiva la prueba. Cuando una proteína o un polipéptido se hacen reaccionar con sulfato de cobre(CuSO4) en solución alcalina se produce un color característico púrpura o violeta. El color se debe a un complejo que resulta al unirse el cobre con los átomos denitrógeno de los enlaces peptídicos. Esta reacción nos sirve para diferenciar lasproteínas y péptidos de los aminoácidos y su utilidad principal es la de seguir elproceso de hidrólisis proteica, la reacción será negativa cuando la hidrólisis seacompleta.EXPERIMENTO 2 Prepare una serie de 4 tubos de ensayo numerados, coloque en cada uno 1 mLde las siguientes soluciones:Laboratorio de Bioquímica Médica 1 25
  26. 26. ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA I.P.N. Tubo Proteína (al 2%) 1 Peptona 2 Caseína 3 Gelatina 4 Albúmina • Añada 2 mL de solución de NaOH al 10% ¡Precaución! • y 3 a 5 gotas de solución de sulfato de cobre CuSO4 al 1%.Agite los tubos y observe la reacción que se produce en cada caso. La aparición deuna coloración violeta o rosa en no más de 20 minutos debe considerarse comoprueba positiva. 1)Anote sus resultados en la tabla que se encuentra al final del capítulo. 2)¿Se puede considerar la reacción del biuret como característica para todas lasproteínas? ¿Por qué? 3)Escriba la reacción. REACCIÓN XANTOPROTÉICA Esta reacción se debe a la formación de nitroderivados aromáticos por reacción del ácido nítrico sobre grupos bencénicos que poseen algunos aminoácidos como la fenilalanina, la tirosina y el triptófano. Por lo tanto, la dan positiva todas aquellas proteínas que tengan aminoácidos aromáticos en su molécula. EXPERIMENTO 3 Prepare una serie de 4 tubos de ensayo numerados, coloque en cada uno 2 mL de una de las siguientes soluciones: Tubo Proteína (al 2%) 1 Peptona 2 Caseína 3 Gelatina 4 Albúmina • Añada 1 mL de ácido nítrico (HNO3) concentrado °con cuidado!, • caliente ligeramente y observe una coloración amarilla característica. • Deje enfriar esta solución y añada cuidadosamente gotas de hidróxido de amonio (NH4OH) concentrado, haciéndolas resbalar cuidadosamente por las paredes del tubo, para estratificar. • En la interfase se observará un anillo naranja.Laboratorio de Bioquímica Médica 1 26
  27. 27. ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA I.P.N. 1)Anote sus resultados en la tabla que se encuentra al final del capítulo. 2)¿Se puede considerar esta reacción general para todas las proteínas? 3)Explique por qué se tiñe de amarillo la piel al contacto con el HNO3. REACCIÓN DE AMINOÁCIDOS AZUFRADOS Las proteínas que contengan los aminoácidos cisteína y cistina cuando setratan con álcalis concentrados, desprenden ácido sulfhídrico H2S, el cual se puedereconocer por su olor fuertemente desagradable y característico, o bien, por laformación de un precipitado negro de sulfuro de plomo (PbS).EXPERIMENTO 4 Prepare una serie de cuatro tubos de ensayo numerados, coloque en cada uno 2 mL de una de las siguientes soluciones: Tubo Proteína (al 2%) 1 Peptona 2 Caseína 3 Gelatina 4 Albúmina • Agregue 2 mL de hidróxido de sodio (NaOH) al 10%. ¡Precaución! • Caliente ligeramente. • Añada a todos los tubos 0.5 mL de solución de acetato de plomo (Pb(CH3COO)2). • Coloque los tubos en baño maría a ebullición por 5 min.El oscurecimiento de la solución o la formación de un precipitado negro indica lapresencia de aminoácidos azufrados. 1)Anote sus resultados en la tabla al final del capítulo. 2)Escriba la reacción química que se ha efectuado. 3)¿Qué sustancias pueden interferir en esta reacción? REACCIÓN DE NINHIDRINA Es una de las reacciones más sensibles para identificar aminoácidos en general,ya que detecta una parte de aminoácido en 1 500 000 partes de agua. Aminoácidosy muchas aminas primarias dan un color violeta característico. La prolina dacoloración amarilla. Por su sensibilidad esta reacción se emplea para valoracióncuantitativa de aminoácidos por colorimetría. La valoración de aminoácidos enorina, por ejemplo, tiene importancia en medicina ya que en algunas enfermedadescomo hepatopatías, infecciones agudas o diabetes mellitus en las que sepresenta hiperaminoacidemia, estas se ven acompañadas por aminoaciduriaLaboratorio de Bioquímica Médica 1 27
  28. 28. ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA I.P.N.paralela. Algunas enfermedades metabólicas congénitas dan lugar a la eliminaciónanormal de algunos aminoácidos en la orina (p. ej. fenilcetonuria).EXPERIMENTO 5Se utilizarán cuadros de papel filtro Whatman no. 1 de 2 x 2 cm, sobre los cuales secolocarán gotas de las siguientes soluciones: cuadro Sustanci a: 1 Glicina 2 Peptona 3 Gelatina 4 Caseína 5 Albúmin a • ¡Precaución! Use guantes o pinzas para manipular el papel. • Anote debajo de cada muestra el nombre del compuesto y • añádale una gota de solución de ninhidrina en butanol al 0.1%. • Coloque el papel en el horno a 110 °C durante 5 minutos. • Describa el aspecto de la reacción 1)Anote sus resultados en la tabla al final del capítulo. 2)Escriba la reacción química que se ha efectuado. 3)¿Qué sustancias dan positiva la reacción de la ninhidrina, además de lasproteínas, péptidos y aminoácidos? Tabla de resultados de algunas propiedades químicas de las proteínas: SUSTANCIA REACCIÓN AMINOÁCID MILL BIURE XANTOPROTÉIC NINHIDRIN OS ON T A AZUFRADOS A GLICINA PEPTONA GELATINA CASEÍNA ALBÚMINA ALGUNAS DE LAS PROPIEDADES FÍSICO – QUÍMICAS DE LAS PROTEÍNAS Muchas de las propiedades químicas de las proteínas son comunes a variasespecies por que contienen el mismo tipo de aminoácidos, por lo que paracaracterizar una proteína es necesario estudiar sus propiedades fisicoquímicas lasLaboratorio de Bioquímica Médica 1 28
  29. 29. ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA I.P.N.cuales dependen del peso molecular, de su carga eléctrica neta y de laconformación que adopte la molécula. DESNATURALIZACIÓN DE PROTEÍNAS Cuando la estructura altamente ordenada de una proteína se somete a la acciónde agentes fisicoquímicos desnaturalizantes, queda reducida al llamado polímeroestadístico o cadena de aminoácidos y además pierde toda actividad biológica. A continuación se consideran algunos de los agentes desnaturalizantes másimportantes como son los metales pesados, los ácidos fuertes y el alcohol. PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS POR METALES PESADOS Las proteínas cuando se encuentran en solución a pH superiores a su puntoisoeléctrico son capaces de reaccionar con diferentes metales pesados formando loscorrespondientes proteinatos insolubles. Tomaremos como ejemplo dos proteínas,la peptona y la gelatina y observaremos su reacción, en forma simultánea frente a losmetales pesados : Hierro (Fe), Plata (Ag), Mercurio (Hg), y Plomo (Pb).EXPERIMENTO 6 • Prepare una serie de 4 tubos de ensayo conteniendo 1 mL de peptona al 2% y rotúlelos como P1 – P4 (por peptona). • Prepare otra serie de 4 tubos, ésta vez con gelatina al 2%. Rotúlelos como G1 – G4 (por gelatina) • y agregue lo que se indica en la tabla.Anote sus observaciones en la misma, evaluando por medio de cruces (de x a xxxsegún la turbiedad del precipitado). Serie Seri Observaciones: P eG Metal Pesado: Precipitado: Con exceso: Tubos: Agregar 2 gotas de Serie Serie Serie Serie solución al 2% de: P G P G 1 1 FeCl3 2 2 AgNO3 3 3 HgCl2 4 4 Pb(CH3COO) 2 1)¿Tiene alguna influencia el pH en el efecto de los metales pesados sobre lasproteínas? 2)¿Tienen todos los metales pesados el mismo efecto precipitante sobre lasproteínas?Laboratorio de Bioquímica Médica 1 29
  30. 30. ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA I.P.N. PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS POR EFECTO DE ÁCIDOS FUERTES Los ácidos fuertes son capaces de desnaturalizar a las proteínas formandoproductos de desnaturalización insolubles conocidos como metaloproteínas.EXPERIMENTO 7a Coloque en 4 tubos de ensayo numerados, 3 mL de las siguientes soluciones:peptona, gelatina, caseína y albúmina al 2% y añada un volumen igual de ácidotricloroacético (CCl3COOH) al 5%. 1)Anote sus resultados al final del capítulo. 2)¿Cómo puede explicar el efecto desnaturalizante del ácido tricloroacético y engeneral de cualquier ácido?EXPERIMENTO 7b Prepare dos tubos de ensayo y márquelos como orina normal y orina depaciente nefrótico, coloque en ellos 3 mL de la orina correspondiente. Agregueenseguida, resbalando cuidadosamente por la pared del tubo, para estratificar, 2 mLde la mezcla HNO3 – metanol. 1)Observe lo que ocurre en la interfase y describa 2)¿Qué explicación le da al fenómeno? PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS POR EFECTO DEL ALCOHOLEXPERIMENTO 8 Coloque en tubos de ensayo numerados, 2 mL de las siguientes soluciones:peptona, caseína, gelatina y albúmina al 2%, estratificando cuidadosamente,agregue 3 mL de alcohol de 96° (CH3CH2OH) y observe que ocurre en la interfase. 1)¿Observa turbidez en todos los tubos? 2)Anote sus resultados en la tabla: Agente Ácido tricloroacético Alcohol de 96° Sustancia (CCl3COOH) al 5% (CH3CH2OH) Peptona Gelatina Caseína Albúmina DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELÉCTRICO Las proteínas al igual que los aminoácidos son moléculas anfotéricas. Es decir,pueden reaccionar con ácidos o con álcalis. En medio ácido las proteínas se combinancon los iones hidrógeno y quedan con carga positiva. En medio alcalino liberanprotones y quedan con carga negativa. El pH en el cual una proteína no posee cargaLaboratorio de Bioquímica Médica 1 30
  31. 31. ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA I.P.N.eléctrica neta se denomina punto isoeléctrico, a este pH la proteína presenta sumínima solubilidad y generalmente precipita, teniendo además una viscosidadmáxima, propiedades que tomaremos en cuenta para el siguiente experimento.EXPERIMENTO 9 Prepare una serie de 9 tubos de ensayo siguiendo las instrucciones de la tabla: • Añada primero la caseína, posteriormente el agua y al final el ácido acético. • Agite todos los tubos y observe el grado de turbidez o la precipitación que se produce en cada tubo • inmediatamente y después de 15’ y 30’. 1)Anote sus observaciones en la tabla valorando con cruces. 2)Calcule el pH teórico de cada tubo, aplicando la ecuación de Henderson -Hasselbalch y anótelo en la tabla. Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Caseína al 5% en acetato de sodio 0.1N m 1 1 1 1 1 1 1 1 1 l Agua destilada m 8. 7. 8. 8. 8. 7. 5. 1. 7.4 l 4 8 8 5 0 0 0 0 Ácido acético 1N m - - - - - - - - 1.6 l Ácido acético 0.1N m - - 0. 0. 1. 2. 4. 8. - l 2 5 0 0 0 0 Ácido acético 0.01N m 0. 1. - - - - - - - l 6 2 pH teórico Observación a los 15 minutos Observación a los 30 minutosLaboratorio de Bioquímica Médica 1 31
  32. 32. ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA I.P.N. 6. CINÉTICA QUÍMICA Y CATÁLISISD e acuerdo con la Ley de Acción de Masas, la velocidad de una reacción química depende de la concentración de las sustancias que intervienen en la reacción. Esta Ley establece que: “La magnitud de una reacción esproporcional a la masa activa de las sustancias reaccionantes presentes enese momento”. El término masa activa significa la concentración molecular o sea, la cantidadpresente por unidad de volumen. Si reaccionan: V1 A + B C + D V2 La velocidad V1 con que reaccionan A y B para producir C y D depende de laconcentración de cada reactivo y de la afinidad que tengan para reaccionar entre sí,pero como esto se puede considerar constante, podemos decir que: V1 = k1[A][B] La velocidad V2 con que reaccionan C y D para producir A y B depende a su vez,de la concentración de C y D y de la afinidad. Por lo tanto podemos decir tambiénque: V2 = k2[C][D] Cuando se alcanza el equilibrio químico, las dos velocidades son iguales. Esdecir: V 1 = V2 Sustituyendo estos valores por sus equivalentes, tenemos: k1[A][B] = k2[C][D] k1 [C][D] ---- = --------- k2 [A][B] Como el cociente de dos constantes es siempre igual a una constante podemosdecir que: [C][D] keq = --------- [A][B] Que es la expresión matemática de la Ley de Acción de Masas y keq se conocecomo Constante de Equilibrio.Laboratorio de Bioquímica Médica 1 32
  33. 33. ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA I.P.N. COMPROBACIÓN DE LA LEY DE ACCIÓN DE MASASEXPERIMENTO 1 En un vaso de precipitados de 600 mL de capacidad, añada 100 mL de aguadestilada, 1 mL de solución de sulfocianuro de amonio (NH4SCN) 0.2M y 1 mL desolución de cloruro férrico (FeCl3) 0.2M en HCl 0.1N mezclando hasta lograr lahomogeneidad. Observará la aparición de una coloración roja, debida a la formación desulfocianuro férrico (Fe(SCN)3). En cuatro vasos gerber, coloque en cada uno 25 mL de la mezcla reaccionanteanterior, después de haber agitado hasta completa homogeneidad, enseguidaagregue a cada vaso los reactivos descritos en la tabla siguiente: Reactivo FeCl3 0.2M en HCl 0.1N ml NH4SCN 0.2M ml NH4Cl ml Vaso 1 0.5 0.5 -- 2 1.0 1.0 -- 3 -- -- 5.0 4 Testigo -- 1)Escriba la reacción química que se ha efectuado. 2)Observe la intensidad de la coloración en cada vaso y de acuerdo a la Ley deAcción de Masas y al principio de Le Chatelier trate de explicar sus resultados. VELOCIDAD DE UNA REACCIÓN QUÍMICA El orden de la reacción, tiene mas importancia que el tipo, cuando se estudia lacinética, ya que nos indica la relación entre la velocidad y la concentración de losreactivos, por lo que se clasifican en:Reacciones de orden cero. Su velocidad no es afectada por la concentración. • Está determinada por algún otro factor limitante como absorción de luz, velocidad de difusión, etc.Reacciones de primer orden. Su velocidad de reacción es directamente proporcional • a la concentración de una de las sustancias reaccionantesReacciones de segundo orden. Su velocidad de reacción es proporcional • a la concentración de dos sustancias reaccionantes.Reacciones de tercer orden. Su velocidad de reacción es proporcional • a la concentración de tres sustancias reaccionantes.La mayor parte de las reacciones enzimáticas se caracterizan por seguir el modelocorrespondiente a las reacciones de primer orden. Matemáticamente la reacciónpuede representarse así: dcLaboratorio de Bioquímica Médica 1 33
  34. 34. ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA I.P.N. ----- = Ke dtdt = tiempo dc = concentración del material Ke = constante específica develocidad de reacción Si representamos por a la concentración inicial de material y por x la cantidadque ha reaccionado en el tiempo t, la expresión a-x significa concentración delmaterial en el tiempo t. La ecuación anterior puede expresarse en función de a, x y ty al integrarla nos queda: 2.303 a Ke =------------ x log -------- t (a – x) Cuando se ha completado la descomposición de la mitad del material, laecuación se simplifica y queda: 2.303 (log 2) Ke =------------------------- t1/2 Donde t1/2 es el período de vida media, es decir, el tiempo necesario para quese descomponga la mitad de una cantidad dada de material reaccionante. VELOCIDAD DE DESCOMPOSICIÓN DEL H2O2EXPERIMENTO 2 • Coloque en un matraz erlenmeyer de 250 mL de capacidad, 5 mL de una solución problema de peróxido de hidrógeno (H2O2)y 2 mL de ácido sulfúrico (H2SO4) (1:6). • Caliente la mezcla hasta casi ebullición ¡PRECAUCIÓN! • y así en caliente, titule con una solución de permanganato de potasio (KMnO4) 0.01M.El punto final de la titulación lo observará cuando persista un ligero color rosa, porexceso de la solución de permanganato. El H2SO4 y el calentamiento tienen porobjeto impedir la formación de MnO2. Haga esta determinación por duplicado y haga el promedio de las dosdeterminaciones. • A continuación prepare una mezcla de 50 mL de sangre desfibrinada al 0.06% y 50 mL de la solución problema de peróxido de hidrógeno. • A los 5, 10, 20, 30 y 40 minutos tome alícuotas de 10 mL y transfiéralos a un matraz erlenmeyer de 250 mL de capacidad, • añada 2 mL de solución de H2SO4 (1:6) caliente hasta casi ebullición • y titule con una solución de permanganato de potasio (KMnO4) 0.01M en la forma ya explicada. 1)Escriba las reacciones químicas que se han efectuado. 2)Resuma sus resultados en la siguiente tabla:Laboratorio de Bioquímica Médica 1 34
  35. 35. ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA I.P.N. Tiempo/s KMnO4 0.01M/mL (a – x) moles/L log a/(a-x) Ke 0 300 600 1200 1800 2400 Para calcular la Ke a cada tiempo debe utilizar la ecuación: 2.303 a Ke = ------------ x log -------- t (a – x) 1)Determine el orden de reacción gráficamente.INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA SOBRE LA VELOCIDAD DE UNA REACCIÓN QUÍMICA Desde hace muchos años se sabía en forma empírica que la velocidad de muchas reacciones aumenta al aumentar la temperatura. Arrhenius encontró una relación que expresa matemáticamente la forma como la temperatura afecta la velocidad de una reacción, la cual está dada por la siguiente ecuación: d(ln K) E ----------- = ---------- dt RT2 La cual indica que el cambio en el logaritmo natural de la constante de velocidad de una reacción es inversamente proporcional al cuadrado de la temperatura absoluta multiplicada por la constante de los gases. E es la energía de activación. Actualmente se considera que para que las moléculas puedan reaccionar deben ser primero activadas, es decir, requieren una cantidad de energía E. Integrando entre límites la ecuación de Arrhenius: K2 E (t2 - t1) log ------- = ------------- K1 2.3 (R t1 t2) K2 E (t2 - t1) log ----- = --------------------- K1 2.3 (1.99) (t1 t2) K2 0.219E (t2 - t1)Laboratorio de Bioquímica Médica 1 35
  36. 36. ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA I.P.N. log ------- = ---------------------- K1 (t1 t2) Si consideramos que E = 1200 calorías al aumentar la temperatura de 22°C a 32°C, tendríamos: K2 0.219 x 1200 x (305 - 295) log ------ = --------------------------------------- = 0.29 K1 (295 x 305) K2 antilog log ------- = antilog 0.29 K1 K2 ------- = 2 K1 Esto quiere decir que por cada 10°C de aumento la velocidad de la reacción se duplica. En la mayor parte de las reacciones se observa este aumento bajo ciertas temperaturas límites. EXPERIMENTO 3 • Coloque en un matraz erlenmeyer de 250 mL de capacidad 0.25 g de yoduro de potasio (KI) y añada 25 mL de solución de H2SO4 1:6. • Agite hasta disolución completa y agregue agua destilada hasta completar 50 mL. Esta solución se denominará Solución de ácido yodhídrico HI y se utilizará en este experimento y en el siguiente. Prepare una serie de 5 vasos de precipitados de 100 mL y agregue los reactivos según la tabla que se muestra a continuación: vaso 1 2 3 4 5 solución HI ml 5 5 5 5 5 Na2S2O3 0.02N ml 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 Almidón gotas 5 5 5 5 5 Preincubar 5 minutos a: 5 °C 25 40 60 90 °C °C °C °C H2O2 al 0.2% ml 2 2 2 2 2 Deberá medir con la mayor precisión posible el tiempo desde el momento de añadir el H2O2 al 0.2% hasta el momento en que aparece súbitamente un color azul intenso. 1)Escriba las reacciones químicas que se han efectuado. 2)Resuma sus resultados en la siguiente tabla: Temperatura °C Tiempo de aparición del color azul en segundos:Laboratorio de Bioquímica Médica 1 36
  37. 37. ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA I.P.N. 3)Trace la gráfica de 1/tiempo de reacción en las ordenadas contra latemperatura en las abscisas. EFECTO DE LA [H+] SOBRE LA VELOCIDAD DE UNA REACCIÓN QUÍMICA Se sabe que muchas reacciones químicas son afectadas por el pH del medio, lasmoléculas deben ser activadas para que puedan reaccionar, el pH ácido favorece laionización y el estado iónico se puede considerar como un estado activado.EXPERIMENTO 4 Prepare una serie de 5 vasos de precipitados de 100 mL de capacidad ynumérelos del 1 al 5 y agregue los reactivos según se indica en la tabla siguiente: Vaso 1 2 3 4 5 Solución HI ml 5 5 5 5 5 Na2S2O3 0.02N ml 1. 1. 1. 1. 1.5 5 5 5 5 Almidón gotas 5 5 5 5 5 H2O destilada ml 5 HCl 0.01N ml 5 HCl 0.1N ml 5 HCl 1N ml 5 HCl 2N ml 5 H2O2 al 0.2% ml 2 2 2 2 2 1)Resuma sus resultados en la siguiente tabla: Tiempo de reacción + [H ] en segundos: 1 x 10-7 1 x 10-2 1 x 10-1 1 2 2)Según sus resultados trace una gráfica con el 1/tiempo en segundos en lasordenadas y la concentración de H+ en las abscisas. VELOCIDAD DE REACCIÓN Y CATALIZADORESLaboratorio de Bioquímica Médica 1 37
  38. 38. ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA I.P.N. La velocidad de una reacción química es afectada por la presencia de“sustancias extrañas”, catalizadores, que son capaces de acelerar la reacción aldisminuir la cantidad de energía de activación necesaria. Actualmente se consideraque el catalizador se combina con el sustrato formando un complejo intermediarioinestable y altamente reactivo. Supongamos la reacción: A + B  AB Esta reacción en condiciones normales se efectúa muy lentamente pero si seañade un catalizador C apropiado, tenemos: A + B + C  (AC) + B AB + C Estas reacciones son rápidas y el catalizador puede ser usado una y otra vez.Estas sustancias pueden ser de naturaleza inorgánica o bien sustancias orgánicascomplejas producidas por las células que son denominadas enzimas. EFECTO DE UN CATALIZADOR INORGÁNICO SOBRE LA VELOCIDAD DE HIDRÓLISIS DE LA SACAROSA La sacarosa es un disacárido no reductor, pero al hidrolizarse, cada moléculalibera una molécula de glucosa y una de fructosa, ambas reductoras. Basándose enesto es posible visualizar y cuantificar la hidrólisis de la sacarosa midiendo laconcentración de azúcares reductores con algún reactivo apropiado.EXPERIMENTO 5 Utilice dos tubos de ensayo y coloque en cada uno 2 mL de solución desacarosa al 0.05M. • Un tubo quedará como testigo • y al otro se agregarán 3 gotas de ácido sulfúrico (H2SO4) (1:6). • Se ponen ambos tubos en baño maría a ebullición durante 15 minutos, complete el volumen si es necesario.Emplearemos el reactivo de Fehling para lo cual • el tubo que contiene el H2SO4 se neutraliza con 1 ml hidróxido de sodio (NaOH) al 10% • y posteriormente se añaden 2 mL de la solución “A” y 2 mL de la solución “B” del reactivo de Fehling mezclándolos perfectamente • y se colocan en baño maría a ebullición por 5 minutos • al cabo de los cuales se sacan del baño y se dejan enfriar • y se observa si existe un precipitado rojo de óxido cuproso (Cu2O) en ambos tubos. 1)¿Se puede considerar al H2SO4 como un catalizador? ¿Por qué? EFECTO DE UN CATALIZADOR BIOLOGICO (ENZIMA) SOBRE LA VELOCIDAD DE HIDRÓLISIS DE LA SACAROSA Una de las principales diferencias entre los catalizadores inorgánicos y lasenzimas es que los primeros solo son capaces de acelerar un proceso conLaboratorio de Bioquímica Médica 1 38
  39. 39. ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA I.P.N.temperaturas altas, mientras que las enzimas son capaces de hacerlo a temperaturasconsiderablemente más bajas. Para esta práctica emplearemos sacarasa, también conocida como invertasao fructofuranosidasa la cual es una de las enzimas mejor conocidas y estudiadas.Actúa hidrolizando los azúcares que contienen fructosa. Así hidroliza la estaquiosa(tetrasacárido), la rafinosa (trisacárido), y alcanza su máxima velocidad con lasacarosa (disacárido). Se puede medir la hidrólisis observando el cambio en larotación óptica o valorando el poder reductor de los productos obtenidos.EXPERIMENTO 6 Utilice dos tubos de ensayo y coloque en cada uno 2 mL de solución desacarosa 0.05M y 1 mL de solución reguladora de acetato de sodio 0.05M a pH de4.7 • Un tubo quedará como testigo • y al otro se le agregan 0.2 mL de la solución de invertasa (solución enzimática). • Después de mezclar bien el contenido de ambos tubos se colocan en baño maría a 40°C durante 15 minutos; • cuando se ha completado el tiempo se les agregan a ambos tubos 2 mL de la solución A y 2 mL de la solución B del reactivo de Fehling, mezclándolos perfectamente. • Se colocan en baño maría a ebullición por 5 minutos al cabo de los cuales se sacan del baño y se dejan enfriar. • Observe si existe un precipitado rojo de óxido cuproso Cu2O en ambos tubos.Compare este experimento con el anterior y explique que sucede.Laboratorio de Bioquímica Médica 1 39
  40. 40. ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA I.P.N. 7. ENZIMAS FACTORES QUE MODIFICAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICAL a vida depende de diversos catalizadores orgánicos denominados enzimas: (del griego en = en, zymo = fermento). La mayor parte de las reacciones biológicas serían cinéticamente insignificantes si no fuera por ellas. De naturalezaproteica, son muy sensibles a cualquier cambio en temperatura, pH, fuerza iónica,adición de sales, presencia de agentes oxidantes o reductores, presencia demetales pesados, etc. Al desnaturalizarse se inactivan. NATURALEZA QUÍMICA DE LAS ENZIMAS Son proteínas simples o complejas. Su parte proteínica se denominaapoenzima. Si su parte no proteinica se separa fácilmente se le denominacoenzima. Las coenzimas están relacionadas con las vitaminas y no catalizan por símismas, ya que se transforman durante la reacción en que intervienen y requieren deotra enzima para regenerarse. Por otra parte, cuando se encuentra firmemente unidapor enlace covalente, no es posible separarla por diálisis y se le denomina grupoprostético. Varios factores afectan la velocidad de una reacción catalizada por enzimas.Algunos de ellos son: temperatura, pH, concentración de sustrato,concentración de enzima e inhibidores.Temperatura Al incrementar la temperatura, se incrementa la energía cinética, lo que ocasiona unamayor probabilidad de colisiones efectivas. La velocidad de las reacciones químicasaumenta. Sin embargo, las enzimas se inactivan y desnaturalizan a temperaturas elevadas.La mayor parte de las enzimas tienen una temperatura óptima, en la cual catalizan con unavelocidad máxima.PH La actividad de la mayoría de las enzimas depende del pH debido a la participación deiones [H+] o iones [OH+] en las reacciones, además que se afecta la carga de los gruposfuncionales. La mayoría de las enzimas tienen un pH óptimo en el cual su actividad esmáxima.Concentración de la enzima La velocidad de una reacción aumenta en proporción directa a la concentración de laenzima que la cataliza. La interacción enzima – substrato cumple la Ley de Acción de Masas.Se emplea con frecuencia la velocidad de una reacción como medida de concentración de laenzima manteniendo fija la concentración de substrato.Concentración de sustrato Si se trabaja con una concentración fija de enzima la velocidad inicial de reacciónaumenta al incrementar la concentración del sustrato. Con el tiempo se alcanza un máximocuando la enzima se satura y la adición de más sustrato ya no influye sobre la velocidad.InhibidoresLaboratorio de Bioquímica Médica 1 40
  41. 41. ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA I.P.N. EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA La temperatura óptima para la gran mayoría de enzimas de animaleshomeotermos, está alrededor de 37°C. Por cada 10 grados centígrados deincremento en la temperatura se duplica la velocidad, esto se conoce como la relaciónde van´t Hoff, o coeficiente de temperatura QT10. Pero esto ocurre únicamente si nose rebasa la temperatura de desnaturalización, ya que cerca de los 60 °C la mayorparte de las enzimas se inactivan y se ocasiona una disminución marcada en laactividad catalítica, hecho que se aprovecha en la técnica de pasteurización.EXPERIMENTO 1 Se prepara una serie de siete tubos como sigue: Tubo Reactivos 1 2 3 4 5 6 7 Sustrato almidón 8 mg/mL m --- 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 L Solución reguladora de fosfatos m --- 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 0.02M, pH = 7 L Agua destilada m 5 3 3 3 3 3 3 L Preincubar 5 minutos a 25°C 5°C 25° 40° 50° 60° 92° C C C C C Enzima (sol. de amilasa) m --- 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 LConserve la solución de amilasa en baño de hielo. • Todos los tubos se agitan muy bien y se colocan en sus respectivos baños dejándolos durante 15 minutos al final de los cuales se les agrega, 1 mL del reactivo de ácido 3,5 dinitrosalicílico (este reactivo desarrolla un color rojo caoba en presencia de azúcares reductores). • Se agitan bien y se colocan en baño maría a ebullición por 10 minutos después de lo cual se enfrían y se leen en el espectrofotómetro a 540 nm, empleando el tubo no. 1 como blanco.Con los datos obtenidos grafique la densidad óptica en las ordenadas y la temperaturaen las abscisas. EFECTO DE LA TEMPERATURA EN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Tubo Temperatura Absorbancia 1 25 °C Blanco 2 5 °C 3 25 °C 4 40 °C 5 50 °C 6 60 °C 7 90 °C EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICALaboratorio de Bioquímica Médica 1 41
  42. 42. ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA I.P.N. El pH es uno de los factores que más afectan la actividad de las enzimas, pordesnaturalización, o bien afectando su carga eléctrica.El pH óptimo es aquel en el cual ciertos grupos funcionales poseen la carga apropiadapara asegurar la formación del complejo ES. Para la mayoría de las enzimas la actividad óptima se encuentra entre los valores de pH de 6 a 8. Sin embargo, para la pepsina del jugo gástrico es máxima a un pH de 1.5 que es muy ácido, o para la fosfatasaalcalina que se encuentra en huesos y otros órganos y cuyo pH optimo es de 9.5.EXPERIMENTO 2Prepare una serie de 6 tubos de ensayo, siguiendo las instrucciones de la siguientetabla: Reactivos Tubo 1 2 3 4 5 6 Sustrato (sol de almidón 8 mg/mL) mL 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Sol. reguladora al pH indicado 7 5 6 7 8 9 mL 4.5 4 4 4 4 4 Enzima (sol de amilasa) mL --- 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Mezcle e incube a 40°C por 15 minutos • Terminado este lapso todos los tubos se agitan y se les agrega 1 mL de reactivo de ácido dinitrosalicílico. Caliéntelos en un baño de agua hirviendo por 10 minutos. Este reactivo desarrolla un color rojo caoba en presencia de azúcares reductores. • Determine la concentración del azúcar reductor liberado, leyendo la densidad óptica en el espectrofotómetro a 540 nm (Puede ser necesario diluir la mezcla reaccionante 1 a 6 veces con agua antes de leer). 1)Basándose en sus resultados diga ¿Cuál es el pH óptimo de la amilasa? 2)¿Qué azúcar se libera en la hidrólisis de este polisacárido? 3)Resuma sus resultados en la siguiente tabla y trace con ellos la gráficacorrespondiente (D.O. contra pH) pH y ACTIVIDAD ENZIMÁTICA TUBO pH D.O. 1 7 2 5 3 6 4 7 5 8 6 9 EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE LA ENZIMA Y DEL SUSTRATO SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCIÓNLaboratorio de Bioquímica Médica 1 42

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