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Examen microscopico de las bacterias
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Examen microscopico de las bacterias

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  • 1. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA FACULTAD DE INGENIERIA E.A.P AGROINDUSTRIAL EXAMEN MICROSCOPICO DE LAS BACTERIAS CURSO : MICROBIOLOGÍA GENERAL GRUPO : “B” DOCENTE :Blgo.Mblgo. Eterio Alva Muñoz CÓDIGO : 0201212035 INTEGRANTES : MUÑOZ ROJAS ANDREA GISELA CICLO: “IV” NUEVO CHIMBOTE - PERÚ 2013
  • 2. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA FACULTAD DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL EXAMEN MICROSCÓPICO DE LAS BACTERIAS I. INTRODUCCION El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc. Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas, proceso llamado fijación. Para bacterias, la fijación por el calor es lo más corriente, aunque también puede fijarse con sustancias químicas como formaldehido, ácidos y alcoholes. Después de la fijación, si se añade el colorante, no se producen ulteriores cambios estructurales en el protoplasma. La fijación se realiza habitualmente en células que han sido fijadas sobre un portaobjetos, tratando después éste con el agente fijador, y siguiendo inmediatamente el proceso de tinción. La fijación produce habitualmente el encogimiento de las células; la tinción, por el contrario, hace que las células aparezcan mayores que lo que son realmente, de manera que las medidas de las células que han sido fijadas o teñidas no pueden realizarse con mucha precisión. La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son moléculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas proteínas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipídicos de la célula, usándose a menudo para revelar la localización de las gotículas o depósitos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudán. Algunos colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula haya sido tratada con otra sustancia química, que no es un colorante por sí mismo. Esta sustancia se denomina mordiente; un mordiente habitual es el ácido tánico. El mordiente se
  • 3. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA FACULTAD DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora sí podrá atacar el colorante. Si se desea simplemente incrementar el contraste de las células para la microscopía, son suficientes los procedimientos simples de tinción. El azul de metileno es un buen colorante simple que actúa sobre todas las células bacterianas rápidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente útil para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tiñe. II. OBJETIVOS GENERAL Observar las formas y estructuras de las bacterias a través de muestras directas y de cultivo, utilizando coloraciones, simples, diferenciales y estructurales. ESPECIFICO Observar las formas fundamentales de las bacterias. Descubrir las técnicas de coloración simple y diferenciales. Identificar colonias bacterianas en forma macroscópica. Observar estructuras bacterianas por técnicas de coloración específicas. III. MATERIAL Y METODOS 3.1. MATERIAL 3.1.1. Cultivos Puros Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Klebsiella sp. Eschirichia coli 3.1.2. Muestras Sarro dental Mucosa labial Cerumen 3.1.3. Material de vidrio Laminas cubreobjetos Laminas portaobjetos
  • 4. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA FACULTAD DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL Tubos de ensayo Placas petri 3.1.4. Equipos Microscopioóptico de luz 3.1.5. Otros Coloraciones simples: azul de metileno, cristal violeta, safranina, verde de malaquita, ácido pícrico, fucsina acida. Coloraciones compuestas: set de coloración Gram, set de coloraciones Zhiel Neelsen. Coloraciones estructurales: coloración de Wirtz, coloración de Maneval. Aceite de cedro. Asa bacteriológica, mecheros con ron de quemar, fosforo, etc. 3.2. METODO: (PROCEDIMIENTO) 3.2.1. COLORACION SIMPLE Son técnicas en la que se emplea un solo colorante, por ejemplo, coloración en azul de metileno, con el violeta de genciana, la fucsina fenicada básicas, el ácido pícrico, etc. Y se utiliza para determinar formas bacterianas sin distinción de grupos. Hacer un de la muestra en lámina portaobjetos con ayuda del asa bacteriológica y agua destilada o solución salina fisiológica (SSF). Fijar el frotis por exposición al calor suave cerca del mechero o a temperatura ambiente. Teñir con cualquiera de los colorantes, proporcionado en los materiales, por un tiempo recomendado por especialistas (generalmente varía entre 0.5 a 5 minutos). Lavar con agua de caño a chorro suave (de preferencia agua destilada), para eliminar el exceso de colorante. Secar el preparado a calor suave o al medio ambiente (lograr que le secado sea uniforme en toda la lámina), para no tener interferencias en la observación.
  • 5. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA FACULTAD DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL Observa a menor o mayor aumento, teniendo en cuenta que la lámina este bien seca, sobre todo cuando se utiliza lente de inmersión. En este último caso usar aceite de cedro. Resultados: Las bacterias se observan de color azul si se colorea con azul de metileno. Si se colorea con fucsina fenicada el procedimiento es el mismo solo varia el colorante, las bacterias se observan de color rojo. 3.2.2. COLORACIONES DIFERENCIALES Son las coloraciones que se emplean más de un colorante y se utilizan para colorear las paredes celulares de las bacterias. Ej. Coloración Gram., Coloración Ziehl Neelsen.
  • 6. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA FACULTAD DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL COLORACION GRAM Fue creada por Christian Gram, estudiante danés, entre 1884 y 1886. Se utiliza para diferenciar a las bacterias de acuerdo a la composición química de su pared celular en dos grupos: Gram positivas y Gram negativas. Procedimiento. 1. Realizar la extensión de la muestra. 2. Secar la muestra a temperatura ambiente o al calor. 3. Cubrir la muestra con la solución fenicada de violeta de genciana o la de Hucker, por un tiempo de 30 a 60 segundos, aproximadamente. 4. Lavar con agua a chorro. 5. Cubrir con Lugol y dejarlo actuar de 2 a 3 minutos. 6. Lavar con agua de caño a horro suave. 7. Decolorar con alcohol acetona hasta que ya no se desprenda más colorante de la lámina. 8. Lavar con agua a chorro suave. 9. Contrastar con safranina de 10 a 30 segundos. 10. Lavar, secar y observar a inmersión. Resultados: - Bacterias color violeta: Gram positivos. Bacterias color rosado: Gram negativos. Los gérmenes Gram positivos son aquellos en los cuales se ha formado el complejo Cristal – Violeta – Yodo (CVI). Y, no son decolorados por el alcohol acetona, manteniendo por lo tanto la coloración violeta. Los gérmenes Gram positivos son aquellos en los cuales no se forma complejo Cristal – Violeta – Yodo (CVI). Y, son decolorados por el alcohol acetona, y al quedar sin coloración están aptos para ser teñidos por la safranina. En términos generales, en microbiología clínica, son Gram positivos todos los cocos a excepción de la neiserias, y son Gram negativos todos los bacilos a excepción de los esporulados, los micobacterias y los corinebacterias.
  • 7. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA FACULTAD DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL La técnica original de Gram ha sufrido diversas modificaciones, pero su fundamento sigue siendo el mismo. Una de las modificaciones consiste en el empleo de la safranina como colorante de fondo en lugar del Zhiel. COLORACION ZIEHL NEELSEN Se utiliza para colorear a las micobacterias o llamadas también bacilos ácidos alcohol resistentes (b.a.a.r) ya que estos al poseer ácidos micolicos (ceras) como componentes de su pared celular, hacen que sea difícil la coloración con el Gram, haciéndose necesario el uso del mechero y mediante la emisión de vapores se permita el ingreso del colorante de Ziehl (fucsina fenicada básica). La coloración Ziehl Neelsen se puede realizar de dos maneras en caliente (técnica más usual) o en frio (tinción de Kinyoun), que es más simple y rápida que el método caliente. Facilita Además el examen de gran número de muestras (por ejemplo, en las encuestas epidemiológicas). Sin embargo, se utiliza una cantidad considerable de fucsina fenicada, para el trabajo habitual, en un laboratorio general, es más adecuado el método caliente. El bacilo causante de la tuberculosis en el ser humano puede ser de dos tipos: bacterias típicas (Mycobacterium tuberculosis) o bacterias atípicas. Estos bacilos son resistentes a los ácidos; es decir, una vez que se han teñido de rojo con la fucsina fenicada no se pueden decolorar por medio del alcohol acido. La fucsina fenicada básica tiñe de rojo todos los microorganismos que se encuentran en el esputo. Al alcohol acido realiza la decoloración de todos los microorganismo y elementos celulares, exceptuando los bacilos alcohol resistentes (bacilos de la tuberculosis). El azul de metileno tiñe de azul todos los microorganismos y decolorados por el alcohol acido, pero los bacilos acido alcohol resistente se conservan teñidos de rojo. Al realizar esta coloración se hace necesario aplicar medidas de bioseguridad como es el uso de los barbijos durante todo el proceso de coloración. Se puede remplazar el uso del asa bacteriológica por un abate lenguas.
  • 8. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA FACULTAD DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL Procedimiento 1. Realizar la extensión del frotis con el asa bactereologica o con un abate lenguas. 2. Secar a temperatura ambiente o al calor. 3. Cubrir con el colorante de Ziehl de 3 a 5 minutos. 4. Colocar el mechero de alcohol por debajo de las láminas preparadas y observar la emisión de vapores 3 o 5 veces. 5. Decolorar con alcohol acido. 6. Lavar con agua a chorro 7. Agregara azul de metileno (colorante de contraste) durante 30 segundos. 8. Lavar, secar y observar a inmersión. Resultados: - Las micobacterias se ven de color rojo sobre un fondo azul. 3.2.3. COLORACIONES ESTRUCTURALES Son aquellos en los que se utilizan 1 o más colorantes y se realizan para observar las estructuras bacterianas, como son: flagelos, capsulas, esporas y corpúsculos metacromaticos. Coloración de flagelos 1. Se deposita una gota de suspensión bacteriana en una lámina portaobjetos. 2. Se agrega colorante de Leiffson y se deja durante 5 minutos hasta que el alcohol se evapore. 3. Lavar con agua, secar y observar a inmersión. Resultados: - El flagelo se observa de un color rojo a negruzco. Coloración de capsula (Método de Maneval) 1. 2. 3. 4. Realizar la extensión de la muestra en la lámina portaobjetos. Secar. Agregar una gota de rojo de Congo. Agregar un colorante de Maneval durante 1 minuto.
  • 9. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA FACULTAD DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL 5. Lavar con agua destilada y evitar que la suspensión se despegue. 6. Secar y observar a inmersión. Resultado: - El cuerpo bacteriano de color rojo, capsula y fondo azul. Coloración de esporas (Método de Wirtz) 1. 2. 3. 4. 5. 6. Hacer la extensión de la muestra y fijarla al calor. Añadir verde de malaquita. Calentar hasta desprender vapores por 3 o 4 veces. Lavar. Agregar safranina como colorante de contraste. Lavar, secar y observar a inmersión. Resultado: - Espora de color verde y cuerpo bacteriano de color rojo. Coloración de corpúsculos metacromaticos (Método de Loeffler) 1. 2. 3. 4. Realizar la extensión de la muestra y fijarla al calor. Cubrir con colorante de Loeffler durante 3 minutos. Lavar con agua destilada. Secar y observar a inmersión. Resultados: - El corpúsculo metacromatico se ve de un color azul oscuro y el cuerpo bacteriano de un color claro.
  • 10. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA FACULTAD DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL IV. RESULTADOS Bacilo Pulmonar Staphylococcus Aureus Para la visualización de esta bacteria se utilizó la tinción de Ziehl Neelsen, ya que las paredes de esta bacteria contiene ácidos grasos (ácidos micólicos) es decir son b.a.a.r. Habiendo realizado frotis teñidos con Gram, los estafilococos aparecen (el color muestra su pared Gram positiva) como cocos Gram positivos. Son cocos Gram-positivos con forma de racimos cuando crecen en medio agar y aparecen solos, en pares, en cadenas cortas, en pequeños grupos cuando se aíslan de muestras clínicas. Bacilo Miliar Escherichia Coli Para la visualización de esta bacteria, al ser también una bacteria bacilo pulmonar se utilizó la tinción de Ziehl Neelsen, ya que la paredes de esta bacteria contiene ácidos grasos (ácidos micolicos) es decir son b.a.a.r. Para visualizar la E. Coli se utilizó la tinción Gram, al ser Gram la capa de péptido glicano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se formó previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdiéndose la coloración azul-violácea
  • 11. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA FACULTAD DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL V. CUESTIONARIO 1. Fundamento de la coloración de Gram y de Zhiel Neelsen. FUNDAMENTO DE LA TINCIÓN DE GRAM La afinidad gram positiva o negativa depende de la composición química de la pared celular en la parte de su estructura física Después de las primeros 4 pasos, al observar al microscopio todo se ve violeta. Luego del decolorante algunas conservan su color mientras que otras se decoloran. Las violetas son Gram positivas, las que pierden su color son Gram negativas, pues los decolorantes orgánicos utilizados abren poros de la membrana externa de las bacterias Gram negativas (principalmente de lipoproteínas y lipopolisacáridos), permiten la salida del colorante principal; al agregar el contracolor éstos quedan rojos. La técnica de Gram se fundamenta en la diferencia existente entre los microorganismos que poseen pared celular y los que no. Las bacterias que poseen pared celular y una gruesa capa de peptidoglicano (Gram +), y las que no poseen pared celular, pero sí una segunda membrana y una capa delgada de peptidoglicano (Gram -) logran teñirse de violeta, pero sólo las Gram negativas reaccionan por la acción de un decolorante, debido a su estructura menos rígida. Al terminar el procedimiento, se pueden identificar y diferenciar los que son Gram + (violeta) de los Gram – (rosa) dependiendo de la coloración que tengan los microorganismos.
  • 12. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA FACULTAD DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL FUNDAMENTO DE LA COLORACIÓN DE ZIEHL-NEELSEN Se basa en que ciertos microorganismos no son desteñidos con alcohol ácido si han sido previamente teñidos con fucsina fenicada. A estos microorganismos se denominan ácido-alcohol resistente. Una vez realizada la decoloración con esta mezcla se utiliza un colorante de contraste (azul de metileno) para poder observar las células sensibles a la decoloración con alcohol ácido. Son microorganismos ácido-alcohols resistentes las Micobacterias, debido a la composición de su pared celular (tiene ácidos micólicos). Esta tinción tiene interés desde el punto de vista del diagnóstico clínico puesto que algunos microorganismos patógenos son ácido-alcohol resistentes, tales como Mycobacterium tuberculosis (tuberculosis) o M. Leprae (lepra). La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidificación de los ácidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias. Por otro lado, el calentamiento aumenta la energía cinética de las moléculas del colorante lo cual también facilita su entrada a las bacterias. Las bacterias que resisten la decoloración son de color rojo y la que no se ven de color azul. Esta técnica esta especialmente diseñada para bacterias acido alcohol resistente como: Mycobacterium tuberculosis Micobacterias atípicas. Mycobacterium Leprae. Mycobacterium Boris. Nocardia asteroides. Nocardia brasiliensis. Corynebacterium amicolatum. 2. ¿Se pueden reemplazar los colorantes e contrastes en las diversas coloraciones?  No, ya que los exámenes están adaptados para poder observar cada microorganismo como por ejemplo, en el examen microscópico directo de las muestras clínicas no se utiliza ningún tipo decolorante, las muestras se extiende directamente sobre la superficie de un porta objetos para su observación. El material que es
  • 13. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA FACULTAD DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL demasiado espeso para permitir la diferenciación de sus elementos puede diluirse con igual volumen de solución salina fisiológica estéril.  En cambio en el examen microscópico de las muestras clínicas levemente modificadas se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tiñen con la misma tonalidad (Tinta china, Azul Metileno de Loeffler, Azul de lacto fenol).  Otra técnica de tinción que permite identificar las cápsulas bacterianas es el método de Hiss. En el cual se utilizan los mismos reactivos que en el método de Anthony, pero que se diferencia de este último porque en el primero es necesario fijar la muestra.  Las técnicas de tinción, en general, matan los microorganismos y no permiten apreciar la morfología de la célula viva. No permite observar la movilidad de los microorganismos vivos, dato que en ocasiones tiene interés analítico. Es imposible observar determinados fenómenos microscópicos, tales como división celular (células animales, levaduras, etc.) o formación de esporas. 3. ¿Qué sucede en la coloración de esporas y en la de Zhiel Neelsen se obvia el calentamiento por tres veces consecutivas? La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidificación de los ácidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias. Por otro lado, el calentamiento aumenta la energía cinética de las moléculas del colorante lo cual también facilita su entrada a las bacterias. Las bacterias que resisten la decoloración son de color rojo y las que no, se ven de color azul ya que se utiliza azul de metileno como tinción de contraste. Si se obviara el calentamiento en esta coloración y en la de esporas este proceso no podría realizarse y no se observaría la presencia de bacterias que es lo que se busca con dichas coloraciones 4. ¿Qué sucedería si la lámina portaobjetos al término de la coloración hay presencia de gotas de agua? Al concluir el proceso de coloración, la lámina se debe colocar de canto para que se escurra, ya que debe tenerse en cuenta que el agua y en especial el agua destilada, es un agente decolorante, por lo que si se deja sobre el
  • 14. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA FACULTAD DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL portaobjetos después de teñirlo demasiado tiempo quita parte del colorante y esto nos perjudica al momento de ver los resultados. VI. CONCLUSION Las bacterias son muy complejas y cada una de sus especies se diferencia de las otras tanto en los compuestos que emplea para conseguir su energía como en sus estructuras, las cuales tienen rasgos distintos que le dan ventajas frente a condiciones específicas, algunas mucho más adaptadas que otras. Ya que cada una de ellas presenta características específicas los seres humanos nos hemos visto en la necesidad de implementar distintos métodos para reconocerlas según su comportamiento estructural frente a diversos colorantes como los utilizados en cada uno de los procesos realizados en las prácticas de los laboratorios anteriores en las cuales se utilizaron distintos colorantes (safranina, verde malaquita, tinta china) para identificar la clasificación de la bacteria, en los resultados obtenidos en los diferentes procesos observamos que hay muchos tipos de estructuras en la bacterias como lo son las esporas y las capsulas, aprendiendo mediante estos resultados que rasgos toman las distintas bacterias ante un agente colorante y frente a cada proceso ya que debido a su estructura o composición química son capases de asimilar o repeler los distintos colorantes que se utilizan en este tipo de estudio dándonos así datos importantes los cuales permiten reconocer y actuar con mayor eficacia frente a estos microorganismos. También aprendimos a reconocer los distintos tipos grupos de bacterias como las grandes negativas, gran positivas, alcohol resistente entre otras. Por ende también aprendimos a reconocer si era un coco o bacilo que fueron las formas más observadas atreves del microscopio. En estas prácticas de laboratorio conocimos los distintos agares en los cuales podemos hacer una siembra de bacterias el proceso que hay que llevar acabo si queremos aislar bacterias formadoras de esporas y su respectivo método para identificarlas. La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración, se debe a quela membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgánicos,como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de péptido glicano queposee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristalvioleta/yodo que se formó previamente, y por lo tanto este complejo se escapa,perdiéndose la coloración azulviolácea. Pero por el contrario, las Grampositivas, al poseer una pared
  • 15. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA FACULTAD DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL celular más resistente y con mayor proporciónde péptido glicanos, no son susceptibles a la acción del solvente orgánico, sinoque este actúa deshidratando los poros cerrándolos, lo que impide que puedaescaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloración azul-violácea. VII. BIBLIOGRAFÍA http://espanol.answers.yahoo.com/question/index?qid=2010032508 5215AA2AQDW http://es.answers.yahoo.com/question/index?qid=20080204090441A AAyrxd http://www.joseacortes.com/practicas/frotisbact.htm http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm http://es.answers.yahoo.com/question/index?qid=20110420085349A ABYEk0 http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Ziehl-Neelsen http://es.wikipedia.org/wiki/Staphylococcus_aureus#Obtenci.C3.B3n_de_las_ muestras http://es.scribd.com/doc/5368278/Fundamentos-de-la-tincion-de-Gram

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