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  • 1. Gel de retardamiento (mobility shift assay) Dr. en C. Erwin Chiquete Medicina Interna Biología Molecular en Medicina [email_address]
  • 2. Ensayo del cambio en la movilidad electroforética del ADN
  • 3. Sinonimia
    • Gel shift assay
    • Gel retardation assay
    • Band shift assay
    • Mobility electrophoresis
    • Gel-electrophoresis DNA-binding
    • assay
  • 4. Aspectos históricos Esta técnica fue desarrollada en 1981 por Fried y Crothers; y Garner y Revzin, de manera independiente. Ambos grupos publicaron sus trabajos en la misma revista: Nucleic Acids Research.
  • 5. Objetivos de la técnica
    • Identificación de proteínas que se
    • unen al ADN:
    • Factores de transcripción.
    • Proteínas que intervienen en la
    • reparación del ADN.
    • Proteínas que intervienen en el
    • empaquetamiento del ADN.
  • 6. Fundamentos El principio en el que se basa el procedimiento es que los complejos de ADN y proteínas tienen diferente mobilidad, con respecto al ADN que no está acomplejado con proteínas, durante la electroforesis en gel de poliacrilamida.
  • 7. Procedimiento
    • El ensayo se divide en varias partes:
    • Preparación de una sonda de ADN.
    • Una secuencia conocida de nucleótidos
    • obtenidos por la digestión con enzimas
    • de restricción de un fragmento clonado
    • en un plásmido (de 50-300 pb) o un
    • fragmento sintético (de 20-50 pb) es
    • marcado radiactivamente.
  • 8. Procedimiento 2. Preparación del gel. Un gel de poliacrilamida al 4-6% bajo en fuerzas iónicas es “precorrido” verticalmente durante 2 h a 150 V.
  • 9. Procedimiento 3. Realización de la reacción de unión (fijación). Un extracto de proteínas totales o nucleares de células generalmente cultivadas son incubadas con la sonda de ADN marcado. Este ADN tiene la secuencia a la que presumiblemente se unirá alguna proteína del extracto.
  • 10. Procedimiento 4. Electroforesis en gel y autorradiografía. Los complejos de ADN y proteínas son separados del ADN libre mediante electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante. Posteriormente se realiza una autorradiografía del gel y se analizan los resultados.
  • 11. Procedimiento A C B B
  • 12. Procedimiento (análisis estequiométrico)
  • 13. Resultados ( B) DNA-binding activity of purified PRB. Gel retardation experiments were carried out as pre-viously described (31). Recombinant PRB was preincubated with the control buffer (lane 1), 10 27 M progesterone (P, lane 2), or R5020 (R,lane 3) for 15 min at 25°C. Labeled double-stranded PRE oligonu-cleotides were then added and the reaction mixture was incubated foran additional 15 min. Samples were analyzed on a nondenaturing 5% polyacrylamide gel.
  • 14. Resultados
  • 15. Variaciones: Competencia C A B A C B
  • 16. Otras variaciones
    • Super-shifting (uso de anticuerpos
    • dirigidos contra proteínas conocidas).
    • Uso de marcas de fluoróforo en
    • sustitución a las radiactivas.
  • 17. Desventajas
    • No es posible caracterizar la secuencia
    • específica de la sonda que se une a la
    • proteína (ésta debe conocerse con antelación).
    • Puede haber más de una proteína que
    • se unen formando un complejo de unión
    • al ADN.
    • Lo que ocurre in vitro no necesariamente
    • es una menifestación de lo que sucede
    • in vivo.
  • 18. Inmunoprecipitación
  • 19. Antecedentes Esta técnica de análisis in vitro de la interacción de un Ag con su Ac específico fue desarrollada por Michael Heidelberger en 1937. En 1946 Oudin describió un sistema de difusión para reacciones antígeno-anticuerpo en tubos llenos de agarosa. Posteriormente Ouchterlony hace su clásica descripción de la “doble difusión” en placas de agar.
  • 20. Fundamento Se basa en el principio de reacción antígeno anticuerpo, que en un fluido o soporte semisólido forma un precipitado.
  • 21. Fundamento Se usa un anticuerpo que va dirigido contra un antígeno protéico en una mezcla de proteínas para aislar el péptido que posee dicho antígeno.
  • 22. Fundamento Las técnicas que se basan en la precipitación de complejos inmunes (inmunoprecipitación) son variadas. Pueden realizarse en un tubo de ensayo o en placas de agar (técnica conocida como inmunodifusión).
  • 23. Fundamento
  • 24. Fundamento La reacción de precipitación es dependiente del pH, temperatura y concentración iónica; pero sobretodo de las concentraciones relativas de Ag y Ac.
  • 25. Fundamento Zona de equivalencia Zona de exceso de anticuerpo Zona de exceso de antígeno INMUNOPRECIPITADO FORMADO CONCENTRACIÓN CRECIENTE DE ANTÍGENO
  • 26. Inmunodifusión doble REACCIÓN DE IDENTIDAD REACCIÓN DE NO IDENTIDAD REACCIÓN DE IDENTIDAD PARCIAL
  • 27. Inmunodifusión doble ( semicuantitativa ) Ac Ag X Ag X/8 Ag X/32 Ag X/16 Ag X/4 Ag X/2
  • 28. Inmunodifusión radial Ag/4 Ag/2 Ag Ag/8
  • 29. Aplicaciones
    • Aislar un Ag específico (a menudo una
    • proteína).
    • Cuantificar un determinado Ag.
    • Identificación de virtualmente cualquier
    • péptido de un extracto, generalmente en
    • estado soluble (v.g. enzimas, factores de
    • transcripción, receptores, etc.).
    *A menudo, después de purificar una proteína, ésta es posteriormente analizada mendiante un gel de poliacrilamida y SDS.
  • 30. Gracias

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