3. Fases do ciclo celular – Pontos de controle A maquinaria de replicação é ativada após a passagem pelo ponto de restrição Ponto de restrição Disparo da mitose Transição Metáfase – anáfase
13. Os níveis de ciclina mitótica variam ciclicamente no decorrer do ciclo celular, atingindo seu pico em metáfase e decaindo abruptamente ao final de mitose
14. Demonstração experimental de que a síntese e degradação de ciclina B são necessárias para a atividade cíclica de MPF
15. Conclusão : A ciclina B dispara a mitose e sua degradação é necessária para o término da mitose, em outras palavras, a célula necessita de ciclina para entrar em mitose e precisa degradá-la para sair de mitose.
16. Como a ciclina é reconhecida para degradação? Como ela é marcada para degradação? Poliubiquitinação das ciclinas mitóticas Domínio de reconhecimento: caixa de degradação das ciclinas
17. A degradação de ciclina é dependente de APC (ciclossomo), sendo que a ativação de APC é dependente de Cdk-ciclina.
19. Regulação da atividade quinase de MPF por: Cdc13 (ciclina B) Wee1 (tirosina quinase-inibitória) CAK (quinase ativadora de Cdc2) Cdc25 (fosfatase ativadora) , remove fosfato inibitório Y15
20. Efeito de mutações em cdc25 e wee1 Cdc 25 = fosfatase ativadora de CDK Wee1 = Tirosina quinase inibitória
21. A mitose pode ser estudada em núcleos adicionados a extratos de ovócitos in vitro Nesse extrato, mRNA, proteínas, peptídeos ou outras substâncias podem ser adicionados para observação dos seus efeitos sobre a progressão mitótica Observem os resultados experimentais mostrados a seguir e respondam às perguntas:
23. 1- O que ocorre quando a ciclina B é substituída por uma forma mutante não-degradável?
24. 2- O que ocorre quando se adiciona ao extrato excesso do peptídeo caixa de destruição da ciclina B? 3- Por que o excesso do peptídeo causa efeito diferente do causado pela ciclina B mutante?
25. 2- A ciclina B precisa ser degradada para que a célula deixe a mitose (caso contrário a célula fica detida em anáfase). Conclusões 1- O disparo da anáfase não requer a degradação da ciclina mitótica (sabemos que a ativação da maquinaria mitótica até este ponto é dependente da ciclina B) 3- O peptídeo que contém o domínio de destruição detém o núcleo em metáfase, portanto, conclui-se que outra proteína além da ciclina B precisa ser degradada para que ocorra a anáfase (segregação dos cromossomos).
26. A ativação de APC leva a degradação coesinas e o conseqüente disparo da anáfase 1- O bloqueio farmacológico de APC retém a célula em metáfase 2- A presença de ciclina B não degradável retém a célula em anáfase
27. Controle da entrada em anáfase e saída da mitose por APC SECURINA Separase inativa Separase ativa Coesinas Coesinas clivadas e dissociadas Securina ubiqüitilada e degradada
28. O que a Cdk-ciclina M faz para disparar a mitose? Por que a sua degradação é requerida para a saída? Ex: Atividade coordenada de MPF e fosfatases sobre o envelope nuclear
31. Atividade de Cdk-ciclinas de mamífero D1, D2, D3 M-Cdk inativada Hct1-APC ativada CKI acumula-se Baixa produção de ciclina = Supressão de toda atividade Cdk
32. As principais ciclinas e Cdks em vertebrados: Complexo Ciclina Cdk G1-Cdk ciclina D ( D1, D2 e D3 em mamíferos ) Cdk4/Cdk6 G1/S-Cdk ciclina E Cdk2 S-Cdk ciclina A Cdk2 M-Cdk ciclina B Cdk1 Como a célula escapa da estável FASE G1 para iniciar a FASE S??? Sinais extracelulares estimulam a proliferação celular Acúmulo de ciclinas de G1
33. Os mecanismos que controlam a entrada em FASE S em células animais – A proteína RETINOBLASTOMA (Rb) atua como um freio em células de mamíferos
34. Demonstração de que a ciclina D é necessária para desencadear a fase S em células de mamífero Síntese de DNA visualizada por incorporação de BrdU
35. Demonstração de que as ciclinas de G1 e G1/S (Cln1, Cln2 e Cln3) regulam entrada em S em levedura +Cln3 -Cln3 +Cln3 -Cln3 Queda de Cln3 > +/-Cln3
36. Como o sistema de controle do ciclo celular desencadeia o processo de replicação e ao mesmo tempo previne sua ocorrência mais de uma vez por ciclo?
