Seminario biologia molecular UPB 2013-02

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  • Seminario biologia molecular UPB 2013-02

    1. 1. Molecular Biology Seminary Maria Alejandra López Lopera Érika Marcela Martínez Pardo Medicine students 3° semester U.P.B
    2. 2. A Novel PTEN/Mutant p53/ c-Myc/Bcl-XL Axis Mediates Context-Dependent Oncogenic Effects of PTEN with Implications for Cancer Prognosis and Therapy Xiaoping Huang, Ying Zhang, Yaqiong Tang, Napoleon Butler, Jungeun Kim, Fadila Guessous, David Schiff, James Mandell and Roger Abounader.
    3. 3. INTRODUCTIONINTRODUCTIONINTRODUCTIONINTRODUCTION
    4. 4. INTRODUCTIONINTRODUCTION Gene mutationGene mutation Altered protein expressionAltered protein expression Disturbances in the cell division Disturbances in the cell division Reduction of apoptosis Reduction of apoptosis CANCERCANCER
    5. 5. INTRODUCTIONINTRODUCTION GENES RESPONSIBLE FOR CANCER GENES RESPONSIBLE FOR CANCER
    6. 6. INTRODUCTIONINTRODUCTION Oncogenic effects on glioblastoma cells Oncogenic effects on glioblastoma cells p53 MUTATIONp53 MUTATION PTEN (Phosphatase and tensin homolog) PTEN (Phosphatase and tensin homolog)
    7. 7. INTRODUCTIONINTRODUCTION p53p53 Tumor suppresorTumor suppresor Stop the cell cycle in the G1/S checkpoint Stop the cell cycle in the G1/S checkpoint ApoptosisApoptosis
    8. 8. INTRODUCTIONINTRODUCTION
    9. 9. INTRODUCTIONINTRODUCTION
    10. 10. INTRODUCTIONINTRODUCTION
    11. 11. MATERIALES YMATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS MATERIALES YMATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS
    12. 12. MATERIALES YMATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS CélulasCélulas Células glioblastomas Células glioblastomas U373 SNB19 U87 LNZ308 293T GBM6 Muestras de tumoresMuestras de tumores Pacientes con glioblastomasPacientes con glioblastomas Infectadas con p53
    13. 13. MATERIALES YMATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS Silenciamiento de gen con lentivirus shRNA Silenciamiento de gen con lentivirus shRNA LentivirusLentivirus Virus con periodos de incubación muy altos. Permiten el paso de ARN a ADN integrándolo al genoma huésped y replicándolo junto con él. shRNAshRNA Horquilla corta de RNA Inhibición estable o transitoria del gen diana
    14. 14. MATERIALES YMATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS Plásmido Células 293T FuGene6 Selección con puromicina Traducción
    15. 15. MATERIALES YMATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS Adenovirus e infecciónAdenovirus e infección AdenovirusAdenovirus Virus que tienen ADN como material genético. Se utilizan como vehículos para administrar genes en el tratamiento del cáncer Adenovirus mut-p53 (R273H)Adenovirus mut-p53 (R273H) MOI:10 Verificación de la expresión de PTEN y mut-p53 Verificación de la expresión de PTEN y mut-p53 Análisis con inmunoblot
    16. 16. MATERIALES YMATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS Análisis inmunoblotAnálisis inmunoblot Primer paso Separación de proteínas mediante electroforesis en gel Segundo paso Transferencia de proteínas a una membrana adsorbente. Tercer paso Detección de la unión antígeno anticuerpo con fluorescencia.
    17. 17. MATERIALES YMATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS Ensayo de proliferación celularEnsayo de proliferación celular Con MTSCon MTS Complejo de sal de tetrazolio, ensayo colorimétrico, medición actividad enzimática Cálculo de célulasCálculo de células Con CellTiter96 AQ, kit de proliferación celular Hemocitómetro
    18. 18. MATERIALES YMATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS Ensayo de apoptosisEnsayo de apoptosis Medición citoplasmática de histona asociada a fragmentos del ADN Kit Elisa Degradación de internucleosomas Detección de histonas por anticuerpos acoplados a enzimas Liberación al medio de nucleosomas por células en apoptosis.
    19. 19. MATERIALES YMATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS Ensayo de invasión celularEnsayo de invasión celular células puestas en cámara superior con recubierta de membrana de colágeno IV. 10 porciento de FBS fue colocado en cámara baja Incubación toda la noche. Células que migraron a la parte inferior fijadas teñidas y contadas bajo un microscopio.
    20. 20. MATERIALES YMATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS Colágeno tipo IV Componente de la membrana basal Afectada en carcinomas invasivos Primer paso de la invasión tumoral Primer paso de la invasión tumoral Pérdida de la membrana basal • Descenso de la síntesis • Ensamblaje disminuido de la componente. • Aumentos de la destrucción por proteasas producidas por el tumor. Marcador sello de la invasión
    21. 21. Clones de la células fijados y teñidos MATERIALES YMATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS Ensayo de formación de coloniasEnsayo de formación de colonias Sembrado de células en 10% FBS Tres semanasTres semanas Sln 0.5% violeta cristal y 25% de metanol
    22. 22. MATERIALES YMATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS Análisis inmunoblotAnálisis inmunoblot Lisis celular Determinación de la concentración de proteínas por el reactivo de ensayo Coomassie Plus Análisis inmunoblot Manchas seleccionadas sometidas a densitometría
    23. 23. MATERIALES YMATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS Precipitación inmunológicaPrecipitación inmunológica Células lisadas fueron encubadas con anticuerpo primario seguido de incubación con Proteína A agarosa. Sometidas a altas temperaturas con tampón de sodio duodecil sulfato Transferencia a nitrocelulosa Incubación con anticuerpo secundario HRP Señales detectadas con quimioluminiscencia
    24. 24. MATERIALES YMATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS InmunodepresiónInmunodepresión (Para remover molécula de una muestra) Inmunodepresión de proteínas con anticuerpos anti-p53/anti-NFYA Inmunoprecipitación de sobrenadantes con anticuerpo anti- NFYA/anti-p53. Análisis de inmunoblot con anticuerpo anti-CBP.
    25. 25. MATERIALES YMATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS Detección de complejo de proteínas con análisis Native PAGE Detección de complejo de proteínas con análisis Native PAGE Células U373 infectadas con adenovirus PTEN codificado (ad-PTEN). 2-3 días 2-3 días Células lisadas preparadas en una muestra tampón sin SDS Puestas en PAGE en tampón Tris-glicina sin SDS. Transferencia de proteínas del PAGE a membranas nitrocelulosa con anticuerpo primario. Análisis Western blot
    26. 26. MATERIALES YMATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS IP cromatinaIP cromatina Lisis del complejo DNA/proteína y puesto en vórtex para liberación de DNA Corte de ADN a 37°C con mezcla de enzimas provistas por un kit Centrifugación de lisados Complejo proteína-DNA recogido con granos de proteína A o G agarosa y entrecruzado por calentamiento a 65°C. Una nocheUna noche Purificación de DNA con kit QIAQuick Análisis de reacción en cadena de polimerasa con primers específicos para la región promotora de c-Myc
    27. 27. MATERIALES YMATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS Inmunohistoquimica e inmunofluorescenciaInmunohistoquimica e inmunofluorescencia (Determina los niveles de PTEN en tejidos humanos) Localización de mut-p53, CBP o NFYA determinado por inmunofluorescencia. Incubación de células con anticuerpos relevantes. Incubación con isotiocianato de fluoresceína o anticuerpos secundarios conjugados.
    28. 28. MATERIALES YMATERIALES Y MÉTODOSMÉTODOS Secuencia de exones p53Secuencia de exones p53 Análisis de las mutaciones de p53 mediante secuencia de DNA Extracción de ADN Amplificación de los exones de p53 por reacción en cadena de polimerasa. Identificación y comparación de las secuencias resultantes con las secuencias en wt-p53
    29. 29. RESULTADORESULTADO SS RESULTADORESULTADO SS
    30. 30. Crecimiento Invasión Crecimiento Invasión R273HU373 SNB19 ApoptosisApoptosis MEDIACION DE PTEN PORMEDIACION DE PTEN POR mutP53mutP53 MEDIACION DE PTEN PORMEDIACION DE PTEN POR mutP53mutP53 mut-P53 y adPTEN:mut-P53 y adPTEN:mut-P53 y adPTEN:mut-P53 y adPTEN: Sh-mutP53 y adPTENSh-mutP53 y adPTENSh-mutP53 y adPTENSh-mutP53 y adPTENSh-RNASh-RNA INVERSO
    31. 31. Mut-P53 regulaMut-P53 regula los efectoslos efectos oncogénicos deoncogénicos de PTENPTEN Mut-P53 regulaMut-P53 regula los efectoslos efectos oncogénicos deoncogénicos de PTENPTEN CONCLUSIÓNCONCLUSIÓNCONCLUSIÓNCONCLUSIÓN
    32. 32. SNB19 U373 Ad-PTENAd-PTEN INFLUENCIA DE PTEN EN C-Myc y Bcl-XLINFLUENCIA DE PTEN EN C-Myc y Bcl-XLINFLUENCIA DE PTEN EN C-Myc y Bcl-XLINFLUENCIA DE PTEN EN C-Myc y Bcl-XL INVERSOINVERSO
    33. 33. ad-PTEN Mut-P53Mut-P53 ad-PTEN Sh-mutP53Sh-mutP53 ad-PTEN Mut-P53Mut-P53 ad-PTEN Sh-mutP53Sh-mutP53 INFLUENCIA DE mut-P53 ENINFLUENCIA DE mut-P53 EN EFECTOS ONCOGÉNICOS DEL PTENEFECTOS ONCOGÉNICOS DEL PTEN INFLUENCIA DE mut-P53 ENINFLUENCIA DE mut-P53 EN EFECTOS ONCOGÉNICOS DEL PTENEFECTOS ONCOGÉNICOS DEL PTEN
    34. 34. INFLUENCIA DE C-Myc SOBRE EFECTOSINFLUENCIA DE C-Myc SOBRE EFECTOS ONCOGÉNICOS DE PTENONCOGÉNICOS DE PTEN INFLUENCIA DE C-Myc SOBRE EFECTOSINFLUENCIA DE C-Myc SOBRE EFECTOS ONCOGÉNICOS DE PTENONCOGÉNICOS DE PTEN Ad-PTEN Ad-cMycAd-cMycAd-cMycAd-cMyc Sh-cMycSh-cMycSh-cMycSh-cMyc Crecimiento Invasión Crecimiento Invasión ApoptosisApoptosis Ad-PTEN INVERSOINVERSO
    35. 35. RESULTADOSRESULTADOS
    36. 36. CONCLUSIÓNCONCLUSIÓNCONCLUSIÓNCONCLUSIÓN C-Myc mediaC-Myc media parcialmente losparcialmente los efectosefectos oncogénicos deoncogénicos de PTENPTEN C-Myc mediaC-Myc media parcialmente losparcialmente los efectosefectos oncogénicos deoncogénicos de PTENPTEN
    37. 37. INFLUENCIA DE Bcl-XL EN EL EFECTOINFLUENCIA DE Bcl-XL EN EL EFECTO ONCOGÉNICO DE PTENONCOGÉNICO DE PTEN INFLUENCIA DE Bcl-XL EN EL EFECTOINFLUENCIA DE Bcl-XL EN EL EFECTO ONCOGÉNICO DE PTENONCOGÉNICO DE PTEN PTEN Ad-Bcl XLAd-Bcl XLAd-Bcl XLAd-Bcl XL Sh-Bcl XLSh-Bcl XLSh-Bcl XLSh-Bcl XL INVERSOINVERSO ApoptosisApoptosis
    38. 38. Bcl-XL influyeBcl-XL influye parcialmente enparcialmente en los efectoslos efectos oncogénicos deoncogénicos de PTENPTEN Bcl-XL influyeBcl-XL influye parcialmente enparcialmente en los efectoslos efectos oncogénicos deoncogénicos de PTENPTEN
    39. 39. C: Muestras de control E: Muestras experimentales FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN
    40. 40. SI HAYSI HAY COMPLEJOCOMPLEJO mut-mut- P53/CBP/NFYAP53/CBP/NFYA SI HAYSI HAY COMPLEJOCOMPLEJO mut-mut- P53/CBP/NFYAP53/CBP/NFYA
    41. 41. INFLUENCIA DE PTEN EN ELINFLUENCIA DE PTEN EN EL COMPLEJO mut-P53/CBP/NFYACOMPLEJO mut-P53/CBP/NFYA INFLUENCIA DE PTEN EN ELINFLUENCIA DE PTEN EN EL COMPLEJO mut-P53/CBP/NFYACOMPLEJO mut-P53/CBP/NFYA Ad-PTENAd-PTENAd-PTENAd-PTEN Mut-P53/CBP/NFYA
    42. 42. RELACIÓN ENTRE LA SUPERVIVIENCIA DERELACIÓN ENTRE LA SUPERVIVIENCIA DE PACIENTES CON GLIOBLASTOMA PORPACIENTES CON GLIOBLASTOMA POR mut-P53 Y LA PRESENCIA DE PTENmut-P53 Y LA PRESENCIA DE PTEN RELACIÓN ENTRE LA SUPERVIVIENCIA DERELACIÓN ENTRE LA SUPERVIVIENCIA DE PACIENTES CON GLIOBLASTOMA PORPACIENTES CON GLIOBLASTOMA POR mut-P53 Y LA PRESENCIA DE PTENmut-P53 Y LA PRESENCIA DE PTEN PTENPTEN SUPERVIVENCIASUPERVIVENCIA GLIOBLASTOMA CON mut-P53
    43. 43. REACTIVACIÓN DE P53PRIMA1PRIMA1PRIMA1PRIMA1 P21P21: GEN Mdm2:Mdm2: PROTEINA TERAPIA FUTURA CONTRA CÁNCERTERAPIA FUTURA CONTRA CÁNCERTERAPIA FUTURA CONTRA CÁNCERTERAPIA FUTURA CONTRA CÁNCER FASE G1 REGULADO POR P53 ESTRES GEN REGULADO POR P53
    44. 44. INFLUENCIA DEL PTEN ENINFLUENCIA DEL PTEN EN ACCIÓN DE PRIMA1ACCIÓN DE PRIMA1 INFLUENCIA DEL PTEN ENINFLUENCIA DEL PTEN EN ACCIÓN DE PRIMA1ACCIÓN DE PRIMA1 PTEN + PRIMA1PTEN + PRIMA1PTEN + PRIMA1PTEN + PRIMA1 SÍ TIENEN VALOR TERAPÉUTICO
    45. 45. DISCUSSIONDISCUSSIONDISCUSSIONDISCUSSION
    46. 46. PERSONAPERSONA IDEAIDEA SISI NONO Jiang Z. Zheng X. Rich KM. Inhibition of Bcl-XL induces apoptosis of glioblastoma cells Meyer N. Penn LZ. Dang CV. Nilsson JA. Cleveland JL. c-Myc is a key regulator of cellular outcomes in normal cells, and its dysregulation is associated with cancer progression Brosh R Rotter V A previous study found that gain- of-function mut-p53 increased the expression of c-Myc in cancer cells Ghosh AK. Grigorieva I. Steele R. Hoover RG. Ray RB. Although PTEN was reported to inhibit expression of c-Myc in tumor cells
    47. 47. CONCLUSIONESCONCLUSIONESCONCLUSIONESCONCLUSIONES
    48. 48.  Cells have components that monitor its cycle and prevent the spread of possible damage and mutations to daughter cells, however these components may be affected and this makes that its function is reversed, causing possible serious diseases.  Electrophoresis techniques are very important in this type of study because they allow us to safely show results
    49. 49. PTENPTENPTENPTEN SUPRESOR DE TUMOR SUPRESOR DE TUMOR PTEN MUTADOPTEN MUTADOPTEN MUTADOPTEN MUTADO P53/c-Myc/Bcl-XL ONCOGÉNICOONCOGÉNICOONCOGÉNICOONCOGÉNICO Mut-P53/CBP/NFY Proliferación celular Supervivencia Invasión Clonogenicidad. Proliferación celular Supervivencia Invasión Clonogenicidad. PRIMA 1PRIMA 1 En:
    50. 50. Efectos contrarios de PTENEfectos contrarios de PTEN Efectos oncogénicosEfectos oncogénicos Transcripción del complejo mut-p53/CBP/NFY Transcripción del complejo mut-p53/CBP/NFY OncogenesOncogenes c-Mycc-Myc Bcl-XLBcl-XL Supervivencia celular Supervivencia celular División celular División celular InvasiónInvasión ClonogenicidadClonogenicidad CáncerCáncer Efectos antitumoralesEfectos antitumorales c-Mycc-Myc Bcl-xBcl-x Mut-p53/CBP/NFYMut-p53/CBP/NFY CáncerCáncer (+) (-)

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