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  • Inizia quando il sangue viene a contatto con sostanze diverse da quelle presenti sulla superficie endoteliale delle pareti dei vasi.Emostasi primariarapida formazione di un tappo piastrinico a livello della lesioneavviene in pochi secondi fondamentale per arrestare la fuoriuscita di sangue dai vasi capillari e dalle venuleEmostasi secondaria attivazione del sistema della coagulazione  formazione della fibrina  rafforza il trombo emostatico primariorichiede alcuni minuti importante soprattutto per bloccare la fuoriuscita del sangue dai vasi di calibro maggiore
  • Il termine emostasi indica l'insieme dei meccanismi utilizzati dall'organismo per proteggersi dalla perdita di sangue in caso di lesioni vascolari. I meccanismi emostatici sono organizzati in tre fasi che si attivano pressochè contemporaneamente: fase vascolare fase piastrinica fase plasmatica o cascata coagulativa La fase vascolare e quella piastrinica possono essere anche considerate insieme a costituire la cosiddetta emostasi primaria. La cascata coagulativa realizza invece il processo dell ’ emostasi secondaria. Successivamente si attiva poi il processo fibrinolitico che porta all ’ eliminazione del coagulo ed alla rimozione di ogni possibile ostacolo al passaggio del sangue.
  • Lesione vasale  vasocostrizione reattiva (riduzione il flusso ematico) fenomeno transitorioriflesso nervoso;secrezione da parte delle cellule endoteliali di fattori  endotelina;favorisce il contatto del sangue con la matrice sottoendoteliale esposta dalla perdita di cellule endotelialila matrice contiene proteine (in particolare collagene, proteoglicani e fibronectina) capaci di fare aderire le piastrine ed attivare la cascata della coagulazioneLa fase vascolare non viene valutata in laboratorio
  • Ruolo delle piastrine nell ’ emostasi Adesione Rilascio contenuto dei granuli (ADP, trombina, catecolamine) Aggregazione Formazione del coagulo (fibrina) Retrazione del coagulo
  • La Trombina legata al suo recettore ora converte il fibrinogeno in fibrina, che viene polimerizzata e stabilizzata dal fattore XIIIa
  • Danno vascolare → sintesi di fattori da parte delle cellule endoteliali + fattori prodotti dalle piastrine + fattori di sintesi epatica → cascata coagulativa; Consiste in una serie di conversioni di proenzimi inattivi in enzimi attivi Culmina con la trasformazione di una proteina plasmatica solubile, il fibrinogeno, in un polimero insolubile, la fibrina
  • In assenza di vitamina K, i fattori II, VII, IX e X vengono ugualmente sintetizzati dal fegato, ma risultano funzionalmente inattivi
  • - petecchie: piccole emorragie capillari con diametro di circa 1-2 mm di colorito rosso violaceo, frequenti nelle zone dove maggiore è la pressione idrostatica o dove c ’ è pressione o frizione esterna - porpore: emorragie con diametro ≥ 3 mm costituite da un insieme di petecchie ecchimosi: versamenti emorragici sottocutanei di diametro tra 1 e 2 cm, inizialmente di colore rosso-blu, poi verde-blu e quindi giallo-oro ematomi: versamenti emorragici profondi che spesso dissecano le fasce muscolari; possono avere esiti clinicamente insignificanti (lividi) così come gravissimi, finanche mortali (versamento retroperitoneale da dissecazione di un aneurisma dell ’ aorta) versamenti ematici in cavità dell ’ organismo: emotorace, emopericardio, emoperitoneo, emartro sanguinamenti da determinati distretti dell ’ organismo: gengivorragia, epistassi, ematemesi, melena, ematuria, menorragia e metrorragia
  • Per i test coagulativi occorre sempre lavorare con il plasma
  • The INR is calculated by the formula shown on this slide. The ISI is the International Sensitivity Index. Each thromboplastin is assigned an ISI which reflects the sensitivity of the thromboplastin to Warfarin-mediated reduction of the Vitamin K dependent clotting factors. By convention, the ISI of the reference thromboplastin is 1.0. The higher the ISI, the less sensitive the thromboplastin is to Warfarin-mediated reduction of the Vitamin K dependent clotting factors. The next two slides provide an example of how the ISI (sensitivity) of the thromboplastin influences the PT ratio (PTR) and how the resulting variability is corrected by expressing the results as an INR.
  • This slide is similar to the last one, but the results of the ISI values of the five thromboplastins and the corresponding INR values are added. It is clear that the marked variability of the PTR is normalized by expressing the results as an INR.

Transcript

  • 1. La coagulazione ed i test di valutazione dellafunzione coagulativa
  • 2. Il processo emostatico• Risposta dell’organismo ad una offesa → interruzione di continuità dell’endotelio.• Uno dei più efficaci meccanismi di autoregolazione che il nostro organismo possieda• Evita perdite di sangue pur mantenendo nello stesso tempo la necessaria fluidità del sangue intravascolare → l’estensione del coagulo viene limitata alla sede della lesione• Porta alla lisi successiva del coagulo
  • 3. Ipercoagulabilità Ipocoagulabilità Normale Trombosi Emorragie
  • 4. Fattori coinvolti nell’emostasi VasiProteine della Piastrinecoagulazione Fibrinolisi / inibitori
  • 5. Fattori coinvolti nell’emostasi• Vasi (cellule endoteliali e subendotelio) → vasocostrizione dei vasi danneggiati• Piastrine → formazione del tappo piastrinico• Complemento• Fattori della coagulazione → formazione del tappo di fibrina• Fattori della fibrinolisi → risoluzione del coagulo• sistema macrofagico-monocitario, PMN → rimozione dei residui del coagulo• Inibitori della coagulazione
  • 6. • 3 Fasi • fase vascolare Emostasi primaria • fase piastrinica • fase plasmatica Emostasi secondaria• Si attivano pressoché contemporaneamente• Sono seguite dalla fase di lisi del coagulo → fibrinolisi
  • 7. • Processo emostatico: Inizia quando il sangue viene a contatto con sostanze diverse da quelle presenti sulla superficie endoteliale delle pareti dei vasi.• descrizione Emostasi primaria• rapida formazione di un tappo piastrinico a livello della lesione• avviene in pochi secondi• fondamentale per arrestare la fuoriuscita di sangue dai vasi capillari e dalle venule• Emostasi secondaria• attivazione del sistema della coagulazione  formazione della fibrina  rafforza il trombo emostatico primario• richiede alcuni minuti 7
  • 8. La cascata coagulativa
  • 9. enzima (il fattore attivato) → agisce su unsubstrato (il fattore successivo nella formanon attiva) in presenza di un cofattore cheaccelera la reazione;Queste tre componenti fondamentali sono assemblate sul complesso fosfolipidico (FP3) espresso sulla superficie dellepiastrine e tenute assieme dagli ioni calcioLa cascata coagulativa è costituita da un serie di reazioni enzimatiche. Per essere efficiente è necessario che enzima e substrato vengano a contatto ad una concentrazione ottimale.
  • 10. Fattori plasmatici della coagulazione:Factor MW Plasma Concentration Required for Hemostasis (µg/ml) (% of normal concentration)Fibrinogen 330,000 3000 30Prothrombin 72,000 100 40Factor V 300,000 10 10-15Factor VII 50,000 0.5 5-10Factor VIII 300,000 0.1 10-40Factor IX 56,000 5 10-40Factor X 56,000 10 10-15Factor XI 160,000 5 20-30Factor XIII 320,000 30 1-5Factor XII 76,000 30 0Prekallikrein 82,000 40 0HMWK 108,000 100 0 15
  • 11. I fattori vit K dipendenti• II, VII, IX, X Sintetizzati nel fegatoVit K necessaria per l’attivitàdella carbossilasi epaticaΥ-carbossiglutamatoindispensabile per legare il Ca++e ancorarsi ai fosfolipidipiastrinici carichi negativamente
  • 12. Anticoagulanti endogeni Trombomodulina Glicoproteina esposta sulla superficie delle cellule• Antitrombina III endoteliali• proteina prodotta dal fegato Lega la trombina alla proteina C• inibisce l’attività di IXa, Xa, XIa, XIIa e della trombina Proteina C Serina proteasi contenente Gla• attivata dall’eparina Degrada i fattori Va e VIIIa• Eparina• Polisaccaride solforilato prodotto dai Stabilizzata dalla proteina S mastociti Proteina S Cofattore che stabilizza la proteina C attivata• attiva l’antitrombina III mediante modifiche conformazionali• Usato in terapia ➔ inibitore della Inibitore del fattore tissutale coagulazione rapido e potente Inibisce l’attivazione dei fattori IX e X da parte del fattore VIIa
  • 13. Sostanze ad azione anticoagulanteAl di fuori del circolo il sangue può essere mantenuto liquidorimuovendo tutto il fibrinogeno oppure aggiungendo sostanzeanticoagulanti Si distinguono due gruppi di sostanze ad azione anticoagulante: 1) sostanze chelanti il calcio ➔ sottraggono il calcio alla cascata coagulativa: - citrato ossalato EDTA (acido etilendiaminico tetracetico) 2) inibitori della trombina: eparina: esalta l’attività antitrombinica dell’antitrombina III (AT III)
  • 14. Fase fibrinoliticaIl sistema fibrinolitico è fisiologicamente preposto alla dissoluzione dei trombi e dei coaguli di fibrinaTale compito è svolto dalla plasmina, un potente plasmina enzima (proteasi) che viene generata da un precursore ematico inattivo, il plasminogeno, attivato dal t-PA (attivatore tessutale delplasminogeno), prodotto dalle cellule endoteliali
  • 15. Test di laboratorio• Attualmente è molto più facile caratterizzare laboratoristicamente i difetti che causano emorragia piuttosto che quelle situazioni, potenzialmente curabili, che predispongono alla trombosi
  • 16. Anamnesi + Esame fi sico Esami diagnostici di base Esame obiettivo di laboratorio Esami diagnostici di Esami durgenza approfondimento Decisione clinicaEsami di monitoraggio Follow-up terrapia farmacologica
  • 17. Significato della raccolta della storia clinicaIl più importante test di screening è la raccolta dellastoria familiare e personale accurata.E’ noto infatti che i reagenti necessari ai test discreening non sono così sensibili a tutti i difettidell’emostasi.Per questo motivo possiamo trovare delle situazioninelle quali, pur essendo i test nella norma, esiste unachiara storia emorragica, per lo più in seguito atraumi e/o estrazioni dentarie 22
  • 18. Significato della raccolta della storia clinicaUn’altra situazione nella quale una adeguata raccoltadella storia clinica può impedire erronee valutazionibasate sui test di screening è l’errata esecuzione delprelievo sul quale si effettuano poi i test dilaboratorio.Può infatti accadere che durante l’esecuzione, laraccolta e la conservazione del prelievo, l’emostasivenga attivata e questo produrrà degli artefatti neltest di screening, capaci a volte di mascherare unlieve difetto emostatico, o di dare una impressione diipercoagulabilità inesistente. 23
  • 19. La raccolta dellastoria clinica vaeseguita seguendolo schemaorientativoriportato nellatabella
  • 20. Considerazioni sulla raccolta della storia clinicaE’ importante stabilire:•L’eventuale insorgenza di sintomi emorragici e la loroincidenza familiare: la presenza di sintomi dalla nascita odalla prima infanzia e la loro familiarità, orientano versoalterazioni della coagulazione, mentre i difetti della fasevasopiastrinica ( con esclusione della malattia di vonWillebrand) sono in genere acquisiti e sporadici.•La molteplicità delle sedi delle emorragie: è difficile chein presenza di alterazioni dell’emostasi la sede diemorragia sia unica 25
  • 21. Anamnesi + Esame fi sico Esami diagnostici di base Esame obiettivo di laboratorio Esami diagnostici di Esami durgenza approfondimento Decisione clinicaEsami di monitoraggio Follow-up terrapia farmacologica
  • 22. Alterazione dell’emostasi primaria: porpora 28
  • 23. Alterazione dell’emostasi primaria: ecchimosi 29
  • 24. Alterazione dell’emostasi secondaria: emorragie 30
  • 25. Alterazione dell’emostasi secondaria: emorragie 31
  • 26. Alterazione dell’emostasi secondaria acquisite 32
  • 27. Alterazione dell’emostasi secondaria acquisite 33
  • 28. Processo diagnostico del paziente con patologie di pertinenza ematologica Esame obiettivo1.Cute: pallore, cianosi, ittero, petecchie, ecchimosi, noduli, teleangectasie, lesioni da grattamento2.Occhi: pallore o ittero delle congiuntive, emorragie retiniche, essudati retinici, ectasia dei vasi retinici3.Cavo orale: stomatiti, ulcerazioni necrotiche, porpora, bolle emorragiche4.Stazioni linfonodali: adenomegalie e loro caratteristiche5.Torace: versamenti pleurici, focolai infettivi, dolore alla pressione dello sterno o delle costole 34
  • 29. Test di uso comune per valutare la coagulazione • Valutazione fase piastrinica Valutazione fase fibrinica • Emocromo  conta  PT piastrinica  aPTT  dosaggio fibrinogeno • tempo di stillicidio  dosaggio At-III  dosggio D-dimero • Tempo necessario per la  dosaggio fattori: formazione del tappo piastrinico in seguito a – Ratio attività:antigene puntura standardizzata • aggregazione piastrinica • Ristocetina  Antibiotico che induce l’aggregazione piastrinica in presenza di vWf
  • 30. Test di screening dell’emostasiTest di primo filtro: sono test che permettono conbuona probabilità di evidenziare la maggiore e piùimportante parte dei difetti emostaticiTest di secondo filtro: vanno ad indagare deidifetti più rari, ma non per questo meno importanti 36
  • 31. Caratteristiche dei test di primo filtro•Sono test di screening e per questo devono essere :•Semplici, perché devono essere alla portata di ognilaboratorio non specializzato•Sensibili, così da rilevare non solo le più grossolaneanormalità dell’emostasi, ma anche difetti minori, cheperaltro aumentano notevolmente il rischio emorragicoin seguito ad un intervento chirurgico•Limitati di numero, in quanto il loro scopo è quello dimettere in evidenza il più velocemente possibilealterazioni delle fasi della coagulazione 37
  • 32. Test di screening dell’emostasiTest di primo filtro: tempo di emorragia e contapiastrinica (esplorano la fase vasopiastrinica), il tempo diprotrombina, il tempo di tromboplastina parziale attivato(esplorano la fase della coagulazione)Test di secondo filtro: dosaggio del fattore XIII, dell’α2 antiplasmina, del tPA e del PAI, del fattorepiastrinico 3, del tempo di trombina, il tempo diReptilase e del wWF 38
  • 33. Bleeding TimeIncisione 1 mm x 5 mmPressione costante Range 40 mm 2 - 10 minuti 39
  • 34. Test di primo filtro: fase vasopiastrinica• Tempo di emorragia: E’ il tempo necessario all’arresto del sanguinamento da un piccolo taglio, di dimensioni standardizzate, provocato sulla superficie cutanea (varia da 1 a 9 minuti)Cosa valuta? L’interazione delle piastrine con la parete vascolare, e la successiva formazione del tappo emostatico primarioQuando è prolungato? In tutti i casi di piastrinopenia e piastrinopatie, in caso di carenza di alcuni fattori plasmatici (quali il fibrinogeno e il vWF), essenziali per la normale funzione piastrinica ed in soggetti con alterazione della parete vascolare (sindrome di Ehelers-Danlos, telengectasia emorragicaCome si esegue? Esistono diversi metodi. Tutti sono modifiche di due tecniche: quella di Duke, che prevede l’incisione del lobo di un orecchio, e quella di Ivy, in cui si esegue un’incisione della cute dell’avambraccio, mantenendo costante la pressione ematica (40 mm Hg) mediante un manicotto 40
  • 35. Condizioni che possono alterare il tempo di sanguinamento•Il tipo, la lunghezza la profondità dell’incisione•L’assunzione di farmaci tra cui l’acido acetilsalicilico (èstata descritta una sindrome di disfunzione piastrinicacaratterizzata da un tempo esageratamente allungato dopoassunzione di acido acetilsalicilico ed un tempo di emorragiabasale normale) ed altri antinfiammatori 41
  • 36. Test di primo filtro: fase vasopiastrinica2.Conta delle piastrine. Il conteggio delle piastrineNon è strettamente indispensabile per una prima valutazione dell’emostasi purchè venga eseguito il tempo di emorragia.Generalmente esiste una correlazione inversa fra il numero di piastrine al di sotto di 100.000/υl e il tempo di emorragiaIl conteggio delle piastrine diventa obbligatorio quando il tempo di emorragia è prolungato per stabilire se si tratta di piastrinopenia o di piastrinopatia.E’ importante ricordare che si possono avere piastrinopenie spurie (o pseudopiastrinopenie) causate dall’EDTA, l’anticoagulante in cui vengono generalmente raccolti i campioni di sangue per la conta piastrinica. Ciò probabilmente è dovuto ad immunoglobuline che agglutinano le piastrine quando il Ca è chelato. 42
  • 37. indagini di laboratorio per lavalutazione della funzionalità piastrinica e relativi valori di riferimento- tempo di sanguinamento: ≤ 10 minuti (neisoggetti normali tra 3-6 minuti)- conteggio delle piastrine: 150.000 –400.000 per μL- test di adesività piastrinica: > 70%- test di aggregazione piastrinica:confronto dei tracciati di trasmittanza conquelli ottenuti su piastrine normali 43
  • 38. tempo di sanguinamentoIl tempo di sanguinamento (o di emorragia) viene determinatoeffettuando una piccola incisione superficiale sulla rete capillaredella faccia volare dell’avambraccio, in una zona pulita, esente damalattie della pelle e lontano dalle vene superficiali, mantenendouna pressione venosa costante di 40 mmHg con unosfigmomanometro e cronometrando la durata della fuoriuscita delsangue dalla feritaIl test viene eseguito in maniera accuratamente standardizzataprovocando una incisione di profondità e lunghezza costante conuna lama calibrata o con un bisturi automatico: i pazienti con untempo di sanguinamento superiore ai 10 minuti presentano unrischio emorragico aumentato 44
  • 39. conteggio delle piastrine150.000 - 400.000 / μL: valori normali> 100.000 / μL: i pazienti sono asintomatici e iltempo di sanguinamento rimane nella norma50.000 - 100.000 / μL: il tempo disanguinamento è lievemente allungato, ma senzaalcuna sintomatologia emorragica< 50.000 / μL: si osservano porpore cutanee dopotraumi minimi e sanguinamenti a livello mucoso inseguito a piccoli interventi chirurgici< 20.000 / μL: notevole rischio di sanguinamentispontanei intracranici e in altri sede interne 45
  • 40. Le piastrinevalori nel sangue: 150 - 450 x 10 /L.circa 2/3 circolano, mentre 1/3 risiede nella milza o sedi extravascolari; 46
  • 41. Megacariocita• ciascun megacariocita durante la sua vita genera circa 4,000 piastrine• le piastrine vivono mediamente da 9-12 giorni• ogni giorno sono prodotte 30.000-40.000 piastrine per mmc;• in caso di necessita’, la produzione di piastrine puo’ aumentare 8 volte; 47
  • 42. test di adesività piatrinicaIl test di adesività piastrinica misura lacapacità delle piastrine di aderire ad unasuperficie estraneaViene effettuato facendo passare, in condizionicontrollate, il sangue attraverso un tubicino di plasticacontenente microsfere di vetro e determinando il numerodi piastrine trattenute rispetto a quelle presenti nelsangue dello stesso paziente non trattatoIl risultato viene espresso in percentuale dipiastrine trattenute; i valori normali sono tra70 e 98% 48
  • 43. Platelet AggregationPlateletRich Aggregating AggregatePlasma(PRP) + Reagent Clumping Baseline Light Increased Light Transmission Transmission 49
  • 44. Pattern bifasico Platelet Rich Platelet Poor Plasma Plasma100 90 Secondary Response 80 70 (Release) 60 50 40 30 Primary Response 20 10 0 Lag Injection Point 50
  • 45. Test di primo filtro: Fase coagulativa•Tutti i test di coagulazione dipendono in modofondamentale dalla quantità di campione di plasmaottenuto•Si richiede una puntura venosa•Il citrato è l’anticoagulante utilizzato routinariamente•Il plasma citrato essenzialmente privo di piastrineviene preparato per centrifugazione standard 51
  • 46. PT e aPTTaPTT  fosfolipidi, PT Ca++ ,silice. tromboplastina (PLNormale: 31-55 sec + TF), Ca++. Normale: 10-16 sec 52
  • 47. Tempo di protrombina (PT)• Identifica i deficit acquisiti o congeniti dei fattori VII, X, V, protrombina (II)• e fibrinogeno (I).• Monitoraggio della terapia anticoagulante orale con dicumarolici (INR)  • inibiscono l’attivita’ dei fattori VII, IX, X e della protrombina• PT corto  privo di significato patologico• PT lungo  • epatopatia. • deficit vitamina K • CID • sindrome nefrosica • Farmaci  dicumarolici 53
  • 48. tempo di protrombina (PT) o tempo di QuickQuesto test valuta l’efficacia della via estrinseca ecomune della coagulazione (fattori I, II, V, VII e X)Si esegue aggiungendo al plasma-citrato del pazientetromboplastina tessutale e ioni calcio, e cronometrando il calciotempo necessario alla formazione del coaguloI valori sono normalmente espressi in secondi (v.n. tra 11 e13 secondi) o come rapporto (ratio) tra il tempo del plasmain esame e quello di un campione di plasma normale dicontrollo 54
  • 49. INR = PT Standardisation ISI Patient’s PT in SecondsINR = Mean Normal PT in Seconds INR = International Normalized Ratio ISI = International Sensitivity Index 55
  • 50. How Different ThromboplastinsInfluence the PT Ratio and INRThromboplastin Patient’s Mean reagent PT Normal INR (Seconds) (Seconds) A 16 12 1.3 3.2 2.6 B 18 12 1.5 2.4 2.6 C 21 13 1.6 2.0 2.6 D 24 11 2.2 1.2 2.6 E 38 14.5 2.6 1.0 2.6 56
  • 51. Tempo di tromboplastina parziale attivato (aPTT)• Identifica i deficit acquisiti o congeniti dei fattori IX, VIII, e XI• Monitoraggio della terapia con eparina• Test di screening per LAC• Identifica con minor sensibilita’ del PT deficit dei fattori X, V, protrombina (II)• e fibrinogeno (I)• aPTT corto privo di significato patologico•• aPTT lungo deficit di fattori • presenza di inibitori (anti-fattore VIII, LAC) • terapia con eparina 57
  • 52. aPTT si allunga per livelli di fattore• VIII < 50%• XI < 50%• IX < 30%• XII < 30%• Fibrinogeno < 100 mg/dL• Livelli di eparina 0.15-0.2 U/mL 58
  • 53. aPTT si allunga per livelli di fattore Cause di errorePolicitemiaPrelievo difficileProvetta non riempita correttamenteContaminazione eparinaLatenza fra prelievo ed esecuzione test > 2 ore 59
  • 54. Terapia con eparina: esalta l’attività anticoagulante dell’AT III, inibisce II,X e delle proteasi in genereMalattie epatiche: quadro complesso spesso si osserva un aumento del fattoreVIII (è sintetizzato dal sistema reticoloendoteliale epatico) e del vWF 60
  • 55. tempo di tromboplastina parziale attivata (aPTT)Questo test valuta l’efficacia della via intrinseca e comune dellacoagulazione (fattori I, II, V, VIII, IX, X, XI, XII)Si esegue aggiungendo al plasma-citrato del paziente agentiattivanti (caolino), una emulsione di fosfolipidi (sostitutipiastrinici) e ioni calcio, e cronometrando il tempo necessario alla calcioformazione del coaguloI valori sono normalmente espressi in secondi (v.n. tra 28 e 40secondi) o come rapporto (ratio) tra il tempo del plasma insecondiesame e quello di un campione di plasma normale di controllo 61