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Introdução a biologia celular - Leitura complementar
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  • 1. Parte I Introdução 1 Uma Visão Geral das Células e da Pesquisa Celular 2 A Química das Células 3 Fundamentos de Biologia Molecular
  • 2. Capítulo 1 Uma Visão Geral das Células e da Pesquisa Celular AA Origem e a Evolução das COMPREENSÃO DA BIOLOGIA MOLECULAR DAS CÉLULAS é uma área dinâ- Células 4 mica de pesquisa que é fundamental para todas as ciências biológicas. Isto é verdade não somente do ponto de vista da pesquisa básica, mas também emCélulas como Modelos relação a um número crescente de aplicações práticas na medicina, agricultura e Experimentais 15 biotecnologia. Especialmente com a conclusão da seqüência do genoma humano, oFerramentas da Biologia progresso na biologia celular e molecular está abrindo novos horizontes na prática da Celular 20 medicina. Exemplos notáveis incluem o desenvolvimento de novas drogas especifi- Cultura deEXPERIMENTO-CHAVE: camente direcionadas a interferir no crescimento de células cancerosas e no uso po- Células Animais 32 tencial de células-tronco para substituir os tecidos danificados e tratar pacientes que sofrem de doenças como diabetes, doença de Parkinson, doença de Alzheimer, lesõesMEDICINA MOLECULAR: Vírus e na coluna vertebral e doenças cardíacas. Câncer 35 Em virtude de a biologia celular e molecular ser uma área de pesquisa de rápido desenvolvimento, é relevante compreender sua base experimental, assim como o es- tado atual do nosso conhecimento. Por essa razão, este capítulo abordará a maneira como as células são estudadas e revisará algumas das suas propriedades básicas. A apreciação das semelhanças e diferenças entre as células é de vital importância para a compreensão da biologia celular. Portanto, a primeira parte deste capítulo discute tanto a uniformidade quanto a diversidade das células atuais em termos da evolução a partir de um ancestral comum. Por um lado, todas as células compartilham pro- priedades fundamentais únicas que têm sido conservadas durante a evolução. Por exemplo, todas as células utilizam o DNA como material genético, são circundadas por membranas plasmáticas e usam os mesmos mecanismos básicos para o metabo- lismo energético. Por outro lado, as células atuais desenvolveram uma grande varie- dade de modos de vida. Muitos organismos, como bactérias, amebas e leveduras, são constituídos de células isoladas que são capazes de se replicar independentemente. Organismos mais complexos são compostos de uma coleção de células que funcio- nam de uma maneira coordenada, com diferentes células especializadas para realizar uma função determinada. O corpo humano, por exemplo, é composto por mais de 200 tipos de células diferentes, cada uma especializada para funções distintas, como memória, visão, movimento e digestão. A diversidade exibida por esses vários dife- rentes tipos de células é surpreendente; considere, por exemplo, as diferenças entre as bactérias e as células do cérebro humano. As semelhanças fundamentais entre diferentes tipos de células fornecem um tópico único para a biologia celular, permitindo que os princípios básicos
  • 3. 4 / GEOFFREY M. COOPER • ROBERT E. HAUSMAN aprendidos a partir de experimentos com um tipo de célula sejam extrapolados e generalizados para outros tipos de células. Vários tipos de células e organismos são amplamente usados para estudar diferentes aspectos da biologia celular e molecular. A segunda parte do capítulo discute algumas das propriedades dessas células, que as fazem particularmente valiosas como modelos experimentais. Fi- nalmente, é importante reconhecer que os progressos em biologia celular depen- dem fortemente da disponibilidade de ferramentas experimentais que permitem que os cientistas façam novas observações ou conduzam novos tipos de experi- mentos. Este capítulo introdutório, portanto, é concluído com uma discussão de alguns métodos experimentais usados para estudar as células, bem como com uma revisão de alguns dos principais desenvolvimentos históricos que permiti- ram a compreensão atual da estrutura e função celular. A Origem e a Evolução das Células As células são dividas em dois tipos principais, definidos pela presença ou não de um núcleo. As células procarióticas (bactérias) não apresentam um envelope nuclear; as células eucarióticas têm um núcleo, no qual o material genético está separado do citoplasma. As células procarióticas geralmente são menores e mais simples do que as células eucarióticas; além da ausência de núcleo, seus genomas são menos complexos e elas não apresentam organelas citoplasmáticas ou um citoesqueleto (Tabela 1.1). Apesar dessas diferenças, os mesmos mecanismos moleculares básicos controlam a vida de ambas, procarióticas e eucarióticas, in- dicando que todas as células atuais descendem de um ancestral primordial co- mum. Como essa primeira célula se desenvolveu? Como evoluíram a complexi- dade e a diversidade exibidas pelas células atuais? A Primeira Célula Provavelmente, a vida apareceu há pelo menos 3,8 bilhões de anos, aproximadamen- te 750 milhões de anos após a Terra ter sido formada (Figura 1.1). Como a vida originou-se e como a primeira célula surgiu são assuntos de especulação, uma vez que esses eventos não podem ser reproduzidos em laboratório. Contudo, diversos tipos de experimentos fornecem evidências importantes da direção de algumas eta- pas do processo. Foi por volta de 1920 que, pela primeira vez, sugeriu-se que moléculas orgâni- cas simples, sob as condições que se imagina que existiam na atmosfera da Terra primitiva, poderiam formar-se e espontaneamente polimerizar-se em macromolécu- las. Supõe-se que, quando a vida se originou, a atmosfera da Terra tivesse pouco ou nenhum oxigênio livre e, em vez disso, consistisse principalmente em CO2 e N2 e quantidades menores de gases como H2, H2S e CO. Semelhante atmosfera fornece condições redutoras nas quais moléculas orgânicas, dada uma fonte de energia como TABELA 1.1 Células Procarióticas e Eucarióticas Característica Procariotos Eucariotos Núcleo Ausente Presente Diâmetro de uma célula típica ≅ 1 µm 10-100 µm Citoesqueleto Ausente Presente Organelas citoplasmáticas Ausente Presente Conteúdo de DNA (pares de bases) 1 × 106 a 5 × 106 1,5 × 107 a 5 × 109 Cromossomos Uma única molécula de Múltiplas moléculas de DNA circular DNA linear
  • 4. A CÉLULA / 5 Figura 1.1 Escala de tempo da evolução A escala indica o tempo aproximado no Presente qual supõe-se que alguns dos principais 0 eventos na evolução das células tenham ocorrido. 1 Organismos multicelulares 2 Bilhões de anos atrás Primeiros eucariotos Metabolismo oxidativo 3 Fotossíntese Eletrodo Primeiras células CH4 4 NH3 H2O H2O H2 4,6 Formação da Terra CH4 H2 NH3 Descarga 5 elétrica Resfria- mentoa luz solar ou descargas elétricas, podem ser formadas espontaneamente. A formação Águaespontânea de moléculas orgânicas foi pela primeira vez demonstrada experimental-mente na década de 1950, quando Stanley Miller (então um estudante de gradua-ção) mostrou que a descarga de faíscas elétricas em uma mistura de H2, CH4 e NH3,na presença de água, levava à formação de uma grande variedade de moléculasorgânicas, inclusive de vários aminoácidos (Figura 1.2). Embora os experimen-tos de Miller não tenham repetido precisamente as condições da Terra primitiva, Caloreles demonstraram claramente a possibilidade da síntese espontânea de molécu-las orgânicas, fornecendo o material básico a partir do qual se originaram os Moléculasprimeiros organismos vivos. orgânicas A próxima etapa na evolução foi a formação de macromoléculas. Tem sidodemonstrado que, sob as prováveis condições pré-bióticas, os blocos monoméricos Alanina Ácido aspártico Ácido glutâmico GlicinaFigura 1.2 Formação espontânea de moléculas orgânicas UréiaO vapor de água circulou através de uma atmosfera composta de CH4, NH3 e H2, dentro daqual faíscas elétricas foram liberadas. A análise dos produtos da reação revelou a formação de Ácido láticouma variedade de moléculas orgânicas, incluindo os aminoácidos alanina, ácido aspártico, ácido Ácido acéticoglutâmico e glicina. Ácido fórmico
  • 5. 6 / GEOFFREY M. COOPER • ROBERT E. HAUSMAN formam, por polimerização espontânea, as macromoléculas. Por exemplo, o aqueci- mento de misturas secas de aminoácidos resulta na polimerização para formar poli- peptídeos. Contudo, a característica essencial da macromolécula a partir da qual a vida evoluiu deve ter sido a capacidade de auto-replicação. Somente uma macromo- lécula capaz de controlar a síntese de novas cópias de si própria poderia ser capaz de reprodução e posterior evolução. Dos dois tipos principais de macromoléculas informativas presentes atualmen- te (ácidos nucléicos e proteínas), somente os ácidos nucléicos são capazes de contro- lar sua auto-replicação. Os ácidos nucléicos podem servir de moldes para sua própria síntese como resultado do pareamento específico de bases entre nucleotídeos com- plementares (Figura 1.3). A etapa essencial no entendimento da evolução molecular foi alcançada no início da década de 1980, quando foi descoberto nos laboratórios de Sid Altman e Tom Cech que o RNA é capaz de catalisar várias reações químicas, incluindo a polimerização de nucleotídeos. Estudos mais avançados ampliaram as atividades catalíticas conhecidas do RNA, incluindo a descrição de moléculas de RNA que controlam a síntese de uma nova fita de RNA a partir de um RNA-molde. O RNA é, assim, tanto capaz de servir como molde quanto capaz de catalisar sua própria replicação. Conseqüentemente, em geral é aceito que o RNA tenha sido o sistema genético inicial, e supõe-se que a fase inicial da evolução química tenha sido baseada nas moléculas de RNA auto-replicativas – um período da evolução conheci- do como mundo de RNA. Então, interações ordenadas entre RNA e aminoácidos evoluíram para o código genético atual, e o DNA finalmente substituiu o RNA como material genético. Presume-se que a primeira célula tenha originado-se da inclusão de RNAs auto- replicativos em uma membrana composta de fosfolipídeos (Figura 1.4). Como dis- cutido em detalhes no próximo capítulo, os fosfolipídeos são os componentes bási- cos de todas as membranas biológicas atuais, incluindo as membranas plasmáticas de células procarióticas e eucarióticas. A característica-chave dos fosfolipídeos que for- mam as membranas é que eles são moléculas anfipáticas, significando que uma por- ção da molécula é solúvel em água e a outra porção é insolúvel. Os fosfolipídeos têm longas caudas de hidrocarbonetos insolúveis em água (hidrofóbica) ligadas a uma cabeça com grupos fosfato solúvel em água (hidrofílica). Quando colocados na água, os fosfolipídeos agregam-se espontaneamente em uma bicamada, com suas cabeças com grupos fosfato na porção exterior em contato com a água e suas caudas de hidrocarbonetos no interior em contato umas com as outras. Tais bicamadas de fos- folipídeos formam uma barreira estável entre dois compartimentos aquosos – porFigura 1.3 Auto-replicação do RNA exemplo, separando o interior de uma célula do meio externo.O pareamento complementar entre nucleo-tídeos (adenina [A] com uracil [U] e guani- A inclusão do RNA auto-replicativo e de moléculas associadas em uma mem-na [G] com citosina [C]) permite que uma brana de fosfolipídeos poderia tê-los mantido, assim, como uma unidade, capaz defita de RNA sirva como molde para a sínte- auto-replicação e posterior evolução. A síntese de proteína controlada por RNA jáse de uma nova fita com a seqüência com-plementar. C C C G C G C G C G G G G G C G C G C G C C A A U A U A U A U U A G G C G C G C G C C A A A U A U A U U U U U U A U A U A U A U U U A U A U A U A A G G G C G C G C G C C A A U A U A U A U A U C C C G C G C C G G G
  • 6. A CÉLULA / 7 RNA Figura 1.4 Inclusão do RNA auto- replicativo em uma membrana de Membrana de fosfolipídeo fosfolipídeos Supõe-se que a primeira célula tenha sido criada pela inclusão de RNA auto-replicati- vo e moléculas associadas em uma membra- Água Molécula de na composta de fosfolipídeos. Cada molécu- fosfolipídeo la de fosfolipídeo tem duas longas caudas hidrofóbicas ligadas a uma cabeça hidrofíli- Cabeça com ca. As caudas hidrofóbicas estão inseridas na grupo hidrofílico bicamada lipídica; as cabeças hidrofílicas es- Cauda tão expostas à água em ambos os lados da hidrofóbica membrana. Águapoderia ter sido desenvolvida neste tempo, no qual a primeira célula poderia serconstituída de um RNA auto-replicativo e das proteínas por ele codificadas.A Evolução do MetabolismoEm razão de as células terem originado-se em um mar de moléculas orgânicas, elaseram capazes de obter alimento e energia diretamente do ambiente. Todavia, essasituação é autolimitante, e por isso as células precisaram desenvolver seus própriosmecanismos para geração de energia e síntese de moléculas necessárias para sua repli-cação. A geração e a utilização controlada da energia metabólica são essenciais paratodas as atividades celulares, e as principais vias do metabolismo energético (discuti-do em detalhes no Capítulo 2) são bastante conservadas nas células atuais. Todas ascélulas usam adenosina 5´-trifosfato (ATP) como fonte de energia metabólica paracontrolar a síntese dos constituintes celulares e realizar outras atividades que exigemenergia, como o movimento (por exemplo, contração muscular). Presume-se que omecanismo usado pelas células para geração de ATP evoluiu em três etapas, corres-pondentes à evolução da glicólise, fotossíntese e metabolismo oxidativo (Figura 1.5).O desenvolvimento dessas vias metabólicas mudou a atmosfera da Terra, dessa formaalterando o futuro curso da evolução. Presume-se que na atmosfera anaeróbica da Terra primitiva as primeiras reaçõesde geração de energia envolviam a quebra de moléculas orgânicas na ausência de Glicólise C6H12O6 2 C3H6O3 Geração de 2 ATP Glicose Ácido lático Figura 1.5 Geração do metabolismo Fotossíntese energético A glicólise é a hidrólise anaeróbica da 6 CO2 + 6 H2O C6H12O6 + 6 O2 glicose para ácido lático. A fotossíntese Glicose utiliza a energia da luz solar para fazer a síntese de glicose a partir de CO2 e H2O, Metabolismo oxidativo com a liberação de O2 como subproduto. O O2 liberado pela fotossíntese é usado no C6H12O6 + 6 O2 6 CO2 + 6 H2O Geração de 36-38 ATP metabolismo oxidativo, no qual a glicose é Glicose quebrada em CO2 e H2O, liberando muito mais energia que a obtida pela glicólise.
  • 7. 8 / GEOFFREY M. COOPER • ROBERT E. HAUSMAN oxigênio. Essas reações eram provavelmente reações semelhantes à glicólise atual – a quebra anaeróbica da glicose para ácido lático com o ganho energético líquido de duas moléculas de ATP. Além do uso do ATP como fonte de energia química intra- celular, todas as células atuais realizam glicólise, o que é compatível com a noção de que essas reações surgiram muito cedo na evolução. A glicólise forneceu o mecanismo pelo qual a energia de moléculas orgânicas pré-formadas (por exemplo, glicose) poderia ser convertida em ATP, o qual podia então ser usado como fonte de energia para direcionar outras reações metabólicas. Presume-se que a seguinte etapa evolutiva importante tenha sido o desenvolvimento da fotossíntese, que permitiu às células captar energia da luz solar e forneceu a inde- pendência da utilização de moléculas orgânicas pré-formadas. A primeira bactéria fotossintética, que surgiu há mais de 3 bilhões de anos, provavelmente utilizava H2S para converter CO2 em moléculas orgânicas – uma via de fotossíntese ainda utilizada por algumas bactérias. O uso de H2O como doador de elétrons e hidro- gênio para a conversão do CO2 em componentes orgânicos evoluiu mais tarde e teve a importante conseqüência de mudar a atmosfera da Terra. O uso de H2O nas reações de fotossíntese origina, como produto secundário, o O2 livre; presu- me-se que esse mecanismo tenha sido o responsável por tornar o O2 abundante na atmosfera da Terra.Membrana A liberação do O2, como conseqüência da fotossíntese, mudou o ambiente noplasmática qual as células estavam em desenvolvimento, e presume-se que tenha levado ao de-Parede senvolvimento do metabolismo oxidativo. Alternativamente, o metabolismo oxida-celular tivo pode ter evoluído antes da fotossíntese, com o aumento do O2 atmosférico, fornecendo, então, uma forte vantagem evolutiva para os organismos capazes de usar O2 nas reações produtoras de energia. Em ambos os casos, o O2 é uma molécula altamente reativa, e o metabolismo oxidativo, usando esta reatividade, forneceu um mecanismo para geração de energia a partir de moléculas orgânicas que é muito mais eficiente que a glicólise anaeróbica. Por exemplo, a hidrólise completa da glicose em CO2 e H2O rende energia equivalente a 36-38 moléculas de ATP, em contraste com as 2 moléculas de ATP formadas pela glicólise anaeróbica. Com poucas exceções, as células atuais usam reações oxidativas como principal fonte de energia. Procariotos Atuais Os procariotos atuais, que incluem todos os diversos tipos de bactérias, são divididos em dois grupos – as arqueobactérias e as eubactérias – que divergiram precocemente na evolução. Algumas arqueobactérias vivem em ambientes extremos, que atualmen- te são raros, mas que poderiam ter sido predominantes na Terra primitiva. Por exem- plo, os termoacidófilos vivem em fontes térmicas sulfurosas com temperaturas tão altas quanto 80oC e pH tão baixo quanto 2. As eubactérias incluem as formas co- muns das bactérias atuais – um grande grupo de organismos que vive em uma ampla variedade de ambientes, incluindo solo, água e outros organismos (por exemplo, patógenos humanos). Muitas células bacterianas são esféricas, em forma de bastonete ou espirais, com diâmetros de 1 a 10 µm. O conteúdo de DNA varia entre 0,6 milhão e 5 milhões de pares de bases, uma quantidade suficiente para codificar aproximada-Nucleóide mente 5.000 proteínas diferentes. As cianobactérias são os maiores e mais comple- xos procariotos, bactérias que desenvolveram a fotossíntese. 0,5 µ m A estrutura de uma célula procariótica típica é ilustrada pela Escherichia coli Figura 1.6 Micrografia eletrônica de (E. coli), uma bactéria comum, habitante do trato intestinal dos humanos (Figura E. coli 1.6). A célula é um bastonete, com aproximadamente 1 µm de diâmetro e 2 µm de A célula é circundada pela parede celular, comprimento. Como a maioria dos outros procariotos, a E. coli é circundada por dentro da qual está a membrana plasmática. uma parede celular rígida composta de polissacarídeos e peptídeos. Dentro da O DNA está localizado no nucleóide. parede celular está a membrana plasmática, que é uma bicamada de fosfolipíde- (Menge and Wurtz/Biozentrum, University of Basel/Science Photo Library/Photo Rese- os e proteínas associadas. Enquanto a parede celular é porosa e facilmente pene- archers, Inc.) trada por uma variedade de moléculas, a membrana plasmática fornece a separa-
  • 8. A CÉLULA / 9ção funcional entre o interior da célula e o ambiente externo. O DNA da E. coli éuma molécula circular única no nucleóide, o qual, em contraste com o núcleo doseucariotos, não é circundado por uma membrana que o separa do citoplasma. Ocitoplasma contém aproximadamente 30.000 ribossomos (o local da síntese protéi-ca), que contribuem para sua aparência granular.Células EucarióticasComo as células procarióticas, todas as células eucarióticas são circundadas pela mem-brana plasmática e contêm ribossomos. Entretanto, as células eucarióticas são muitomais complexas e apresentam um núcleo, organelas citoplasmáticas e um citoesque-leto (Figura 1.7). A maior e mais proeminente organela das células eucarióticas é onúcleo, com um diâmetro de aproximadamente 5 µm. O núcleo contém a informa-ção genética da célula, que nos eucariotos é organizada como uma molécula de DNAlinear, em vez de circular. O núcleo é o local da replicação do DNA e da síntese doRNA; a tradução do RNA em proteínas ocorre em ribossomos no citoplasma. Além do núcleo, as células eucarióticas apresentam no citoplasma uma varieda-de de organelas circundadas por membranas. Essas organelas formam compartimen-tos nos quais se localizam as diferentes atividades metabólicas. Em geral, as célulaseucarióticas são muito maiores que as células procarióticas, freqüentemente tendoum volume celular de, no mínimo, mil vezes maior. A compartimentalização causa-da pelas organelas citoplasmáticas é que permite o funcionamento eficiente das célu-las eucarióticas. Duas dessas organelas, as mitocôndrias e os cloroplastos, exercempapel fundamental no metabolismo energético. As mitocôndrias, que são encontra-das em quase todas as células eucarióticas, são os locais do metabolismo oxidativo esão responsáveis pela geração da maior parte do ATP derivado da quebra de molécu-las orgânicas. Os cloroplastos são os locais da fotossíntese e são encontrados somentenas células de plantas e algas verdes. Os lisossomos e os peroxissomos também for-necem compartimentos metabólicos especializados para a digestão de macromolécu-las e várias reações oxidativas, respectivamente. Além disso, a maioria das célulasvegetais contém grandes vacúolos que executam uma variedade de funções, incluin-do a digestão de macromoléculas e a estocagem de produtos de excreção e nutrientes. Devido ao tamanho e à complexidade das células eucarióticas, o transporte deproteínas para seus destinos corretos é uma tarefa extremamente complexa. Duasorganelas citoplasmáticas, o retículo endoplasmático e o complexo de Golgi, sãodedicadas especificamente para a organização e o transporte de proteínas destinadasà secreção, à incorporação à membrana plasmática e à incorporação aos lisossomos.O retículo endoplasmático é uma extensa rede de membranas intracelulares, esten-dendo-se a partir da membrana nuclear por todo o citoplasma. Ele funciona nãosomente no processamento e transporte de proteínas, mas também na síntese delipídeos. As proteínas são transportadas em pequenas vesículas a partir do retículoendoplasmático para o complexo de Golgi, onde são processadas e organizadas parao transporte ao destino final. Além do papel no transporte de proteínas, o complexode Golgi serve como local da síntese de lipídeos e (em células vegetais) como local desíntese de alguns polissacarídeos que formam a parede celular. As células eucarióticas têm outro nível de organização interna: o citoesqueleto,uma rede de filamentos protéicos que se estende por todo o citoplasma. O citoesque-leto fornece a estrutura da célula, determinando o formato celular e gerando a orga-nização do citoplasma. Além disso, o citoesqueleto é responsável pelos movimentosda célula inteira (por exemplo, a contração das células musculares), pelo transporteintracelular e pelo posicionamento das organelas e outras estruturas, incluindo omovimento dos cromossomos durante a divisão celular. Os eucariotos surgiram há pelo menos 2,7 bilhões de anos, seguindo em 1 a 1,5bilhão de anos a evolução dos procariotos. Estudos das seqüências de DNA indicamque as arqueobactérias e eubactérias são tão diferentes entre si quanto são dos euca-riotos atuais. Portanto, um evento muito precoce na evolução parece ter sido a diver-
  • 9. 10 / GEOFFREY M. COOPER • ROBERT E. HAUSMAN Célula animal Peroxissomo Centríolo Mitocôndria Retículo endoplasmático rugoso Retículo Núcleo endoplasmático liso Nucléolo Lisossomo Citoesqueleto Membrana plasmática Complexo de Golgi RibossomosFigura 1.7 Estruturas das célulasanimais e vegetaisTanto as células animais como as vegetais gência dos três grupos de descendentes a partir de um ancestral comum, originandosão circundadas pela membrana plasmática as atuais arqueobactérias, as eubactérias e os eucariotos. De forma interessante, mui-e contêm um núcleo, um citoesqueleto e tos genes de arqueobactérias são mais parecidos com os de eucariotos que com os demuitas organelas citoplasmáticas. As células eubactérias, indicando que as arqueobactérias e os eucariotos compartilham umavegetais são também circundadas pela pare- linha evolutiva em comum e são mais proximamente relacionados um ao outro dode celular e contêm cloroplastos e vacúolosgrandes. que qualquer um dos dois às eubactérias (Figura 1.8). Uma etapa crítica na evolução das células eucarióticas foi a aquisição das organelas subcelulares circundadas por membranas, permitindo o desenvolvimento das caracterís- ticas complexas dessas células. Supõe-se que as organelas tenham sido adquiridas como o resultado de uma associação de células procarióticas com eucariotos ancestrais. A hipótese de que células eucarióticas evoluíram a partir de uma associação de sim- biose com procariotos – endossimbiose – é bem sustentada pelos estudos de mitocôndri- as e cloroplastos, os quais supõe-se terem evoluído a partir de bactérias que viviam em células maiores. Ambos, mitocôndrias e cloroplastos, são similares às bactérias em tama- nho, e como bactérias, reproduzem-se por divisão binária. E o mais importante, ambos, mitocôndrias e cloroplastos, contêm seu próprio DNA, o qual codifica alguns dos seus componentes. Os DNAs de mitocôndrias e cloroplastos são replicados cada vez que a organela se divide, e os genes que eles codificam são transcritos dentro da organela e traduzidos no ribossomo da organela. A mitocôndria e o cloroplasto contêm seus pró- prios sistemas genéticos, que são diferentes do usado no genoma nuclear da célula. Além disso, o ribossomo e o RNA ribossomal dessas organelas são mais proximamente relacio- nados com os de bactérias do que com os codificados pelo genoma nuclear dos eucariotos.
  • 10. A CÉLULA / 11 Célula vegetal Citoesqueleto Mitocôndria Peroxissomo Vacúolo Ribossomo Cloroplastos Retículo endoplasmático liso Retículo endoplasmático rugoso Nucléolo NúcleoParede celular Complexo de Golgi Membrana plasmática Outras Fungos Cianobactérias eubactérias Plantas Animais (leveduras) Protistas Arqueobactérias Cloroplastos Mitocôndrias Figura 1.8 Evolução das células As células atuais evoluíram de um ancestral procarioto co- mum por três linhas de descendência, dando origem às ar- queobactérias, às eubactérias e aos eucariotos. As mitocôn- drias e os cloroplastos originaram-se da associação por en- dossimbiose de bactérias aeróbicas e cianobactérias com o ancestral dos eucariotos, respectivamente.
  • 11. 12 / GEOFFREY M. COOPER • ROBERT E. HAUSMAN A origem dessas organelas por endossimbiose é amplamente aceita, e supõe-se que a mitocôndria tenha evoluído de bactérias aeróbicas e o cloroplasto, de bactérias fotossintéticas, como as cianobactérias. A aquisição de bactérias aeróbicas poderia ter fornecido a uma célula anaeróbica a capacidade de realizar reações de metabolismo oxidativo. A aquisição de bactérias fotossintéticas poderia ter fornecido a indepen- dência nutricional proporcionada pela habilidade de efetuar a fotossíntese. Dessa maneira, essas associações por endossimbiose foram altamente vantajosas e foram positivamente selecionadas pela evolução. Ao longo do tempo, a maioria dos genes originalmente presentes nas bactérias foi, aparentemente, incorporada no genoma nuclear da célula, e somente poucos componentes da mitocôndria e do cloroplasto ainda são codificados pelos genomas das organelas. O Desenvolvimento dos Organismos Multicelulares Muitos eucariotos são organismos unicelulares que, como as bactérias, consistem em somente uma única célula capaz de auto-replicação. Os eucariotos mais simples são as leveduras. As leveduras são mais complexas que as bactérias, porém menores e mais sim- ples que as células de animais e plantas. Por exemplo, a comumente estudada levedura Saccharomyces cerevisiae tem aproximadamente 6 µm de diâmetro e seu DNA contém 12 milhões de pares de bases (Figura 1.9). Entretanto, outros eucariotos unicelulares são células muito mais complexas, algumas contendo tanto DNA quanto as células humanas (Tabela 1.2). Eles incluem organismos especializados para realizar uma grande variedade TABELA 1.2 Conteúdo de DNA de ações, incluindo a fotossíntese, o movimento e a captura e ingestão, como alimento, de das Células outros organismos. Por exemplo, a Amoeba proteus é uma célula grande e complexa. Seu volume é de mais de 100.000 vezes o de uma E. coli e seu comprimento excede 1 mm, Organismo Conteúdo haplóide quando a célula está totalmente estendida (Figura 1.10). As amebas são organismos com de DNA alta mobilidade que usam extensões citoplasmáticas, chamadas de pseudópodos, para (milhões de pares de bases) mover e para englobar outros organismos, incluindo bactérias e leveduras, como alimen- tos. Outros organismos eucariotos unicelulares (como algas verdes) contêm cloroplastos e Bactérias são capazes de realizar fotossíntese. Mycoplasma 0,6 Os organismos multicelulares evoluíram a partir de eucariotos unicelulares há, E. coli 4,6 pelo menos, 1,7 bilhão de anos. Alguns eucariotos unicelulares formam agregados Eucariotos unicelulares multicelulares que parecem representar uma transição evolutiva entre células indivi- Saccharomyces cerevisiae 12 duais e organismos multicelulares. Por exemplo, as células de muitas algas (como a (Levedura) alga verde Volvox) associam-se umas com as outras para formarem colônias multice- Dictyostelium discoideum 70 Euglena 3.000 Plantas Arabidopsis thaliana 125 Zea mays (milho) 5.000 Animais Caenorhabditis elegans 97 (nematóide) Drosophila melanogaster 180 (mosca-da-fruta) Galinha 1.200 “Zebrafish”* 1.700 Camundongo 3.000 Humano 3.000 5 µm* N. de R.T. Zebrafish é um peixe usado comomodelo experimental e recebe o nome comum Figura 1.9 Micrografia eletrônica de varredura do Saccharomyces cerevisiaeno Brasil de “paulistinha”. Ver página 19. Cor artificial foi adicionada à micrografia. (Andrew Syed/Science Photo Library/Photo Researchers, Inc.)
  • 12. A CÉLULA / 13lulares (Figura 1.11), que se supõe terem sido os precursores evolutivos das plantasatuais. O aumento da especialização celular direcionou a transição de agregados co-loniais para verdadeiros organismos multicelulares. A contínua especialização celulare a divisão de tarefas entre as células do organismo levaram à complexidade e diver-sidade observadas entre os diferentes tipos de células que compõem as plantas e osanimais atuais, incluindo os seres humanos. As plantas são compostas por uma menor variedade de tipos celulares que osanimais, mas cada tipo diferente de célula vegetal é especializado para realizar umafunção específica necessária para o organismo como um todo (Figura 1.12). As célu-las das plantas são organizadas em três principais sistemas de tecidos: tecido de sus- 0,2 mmtentação, tecido dérmico e tecido vascular. O tecido de sustentação contém as célulasdo parênquima, que realizam a maioria das reações metabólicas das plantas, incluin- Figura 1.10 Micrografia ótica dedo a fotossíntese. O tecido de sustentação também contém dois tipos de células Amoeba proteus (M.I. Walker/Photo Researchers, Inc.)especializadas (célula do colênquima e célula do esclerênquima), que são caracteriza-das pelas grossas paredes celulares e fornecem o suporte estrutural para a planta. Otecido dérmico cobre a superfície da planta e é composto de células epidérmicas,formando uma camada de proteção e permitindo a absorção de nutrientes. Final-mente, diversos tipos de células alongadas formam o sistema vascular (o xilema e ofloema), que é responsável pelo transporte de água e nutrientes por toda a planta. As células encontradas nos animais são consideravelmente mais diversificadasque as das plantas. O corpo humano, por exemplo, é composto por mais de 200tipos diferentes de células que geralmente são consideradas os componentes de cincotipos principais de tecidos: tecido epitelial, tecido conectivo, sangue, tecido nervoso (A) (B) Figura 1.11 Colônia de alga verde Células individuais de Volvox formam colô- nias, nas quais centenas ou milhares de cé- lulas estão incorporadas em uma matriz ge- latinosa. (Cabisco/Visuals Unlimited.) (C) (D) Figura 1.12 Micrografias óticas de células representativas de plantas (A) Células do parênquima, que são respon- sáveis pela fotossíntese e por outras reações metabólicas. (B) Células do colênquima, que são responsáveis pela sustentação e apresentam paredes celulares espessas. (C) Células da epiderme na superfície de uma folha. Poros pequenos (estômatos) são flan- queados por células especializadas chamadas de células-vigia. (D) Elementos dos vasos e traqueídeos são células alongadas que são organizadas uma de ponta para a outra para formar os vasos do xilema. (A, Jack M. Bastsack/Visuals Unlimited; B, A. J. Karpo- ff/Visuals Unlimited; C, Alfred Owczarzak/ Biological Photo Service; D, Biophoto Associ- 50 mm ates/Science Source/Photo Researchers Inc.)
  • 13. 14 / GEOFFREY M. COOPER • ROBERT E. HAUSMAN e músculo (Figura 1.13). As células epiteliais formam camadas que cobrem a super- fície do corpo e recobrem os órgãos internos. Há muitos tipos diferentes de células epiteliais, cada um especializado para uma função específica, incluindo proteção (a pele), absorção (por exemplo, as células da mucosa do intestino delgado) e secreção (por exemplo, as células da glândula salivar). O tecido conectivo inclui ossos, cartila- gens e tecido adiposo, cada um formado por diferentes tipos de células (respectiva- mente, osteoblastos, condrócitos e adipócitos). O tecido conectivo frouxo, que intercala (A)i Boca (A)ii Ducto biliar (A)iii Intestino (B)Figura 1.13 Micrografias óticas decélulas animais representativas(A) Células do epitélio da boca (uma grossacamada multicelular), do ducto biliar e dointestino. (B) Fibroblastos são células do te-cido conectivo, caracterizados por sua for-ma alongada. (C) Eritrócitos, granulócitos,linfócitos e monócitos no sangue humano.([A]i e [A]ii, G. W. Willis/Biological PhotoService; [A]iii, Biophoto Associates/PhotoResearchers, Inc.; B, Don W. Fawcett/Visu-als Unlimited; C. G. W. Willis/BiologicalPhoto Service.) (C) Eritrócito Linfócito Monócito Granulócito
  • 14. A CÉLULA / 15as camadas epiteliais e preenche os espaços entre órgãos e tecidos do corpo, é forma-do por outro tipo de célula, o fibroblasto. O sangue contém vários tipos diferentesde células, que funcionam no transporte do oxigênio (células vermelhas ou eritróci-tos), nas reações inflamatórias (granulócitos, monócitos e macrófagos) e na respostaimunológica (linfócitos). O tecido nervoso é composto pelas células nervosas, ou neu-rônios, que são altamente especializadas para transmitir sinais através do corpo. Váriostipos de células sensoriais, como as células dos olhos e dos ouvidos, são mais especializa-dos para receberem sinais externos do ambiente. Finalmente, vários diferentes tipos decélulas musculares são responsáveis pela produção da força e do movimento. Claramente, a evolução dos animais envolveu o desenvolvimento de uma con-siderável diversidade e especialização no nível celular. A compreensão dos mecanis-mos de controle do crescimento e de diferenciação em tal grupo complexo de célulasespecializadas, originadas a partir de um único ovo fertilizado, é um dos principaisdesafios que se apresentam à biologia celular e molecular contemporânea.Células como Modelos ExperimentaisA evolução das células atuais a partir de um ancestral comum tem importantes im-plicações para a biologia celular e molecular como uma ciência experimental. Já queas propriedades fundamentais de todas as células foram conservadas durante a evolu-ção, os princípios básicos aprendidos com experimentos feitos com um tipo de célulasão geralmente aplicáveis para outras células. Por outro lado, em razão da diversidadedas células atuais, muitos tipos de experimentos podem ser mais facilmente realiza-dos em um tipo de célula do que em outro. Vários tipos diferentes de células eorganismos são comumente usados como modelos experimentais para estudar diver-sos aspectos da biologia celular e molecular. As características de algumas dessas célu-las que as tornam de particular utilidade como modelos experimentais são discutidasnas seções seguintes.E. coliEm virtude da sua simplicidade relativa, células procarióticas (bactérias) são modelosideais para o estudo de diversos aspectos fundamentais da bioquímica e da biologiamolecular. A espécie de bactéria mais amplamente estudada é a E. coli, que tem sido,há muito tempo, o organismo favorito para pesquisa dos mecanismos básicos dagenética molecular. A maioria dos nossos conceitos atuais de biologia molecular –incluindo nossa compreensão da replicação do DNA, do código genético, da expres-são gênica e da síntese protéica – deriva dos estudos com essa modesta bactéria. A E. coli tem sido especialmente útil para os biólogos moleculares, tanto porsua relativa simplicidade, como pela facilidade com que pode ser reproduzida e estu-dada em laboratório. O genoma da E. coli, por exemplo, consiste em aproximada-mente 4,6 milhões de pares de bases e contém cerca de 4.000 genes. O genomahumano é quase mil vezes maior (aproximadamente 3 bilhões de pares de bases) epensa-se que contenha 30-40.000 genes (ver Tabela 1.2). O pequeno tamanho dogenoma da E. coli (que foi completamente seqüenciado em 1997) fornece óbviavantagem para a análise genética. Experimentos de genética molecular são facilitados pela rápida multiplicaçãoda E. coli em condições laboratoriais bem definidas. Em condições ótimas de cultu-ra, a cada 20 minutos a E. coli divide-se. Além disso, uma população clonal de E. coli,na qual todas as células derivam da multiplicação de uma única célula, pode serfacilmente isolada como uma colônia crescendo em meio semi-sólido contendo ágar(Figura 1.14). Uma vez que colônias de bactérias contendo 108 células podem sercultivadas em apenas uma noite, a seleção de variantes genéticas de uma cepa de E.coli – por exemplo, mutantes que são resistentes a um antibiótico como a penicilina – é Figura 1.14 Colônias de bactériasfácil e rápida. A facilidade com que esses mutantes podem ser selecionados e analisa- Fotografia de colônias de E. coli crescendodos foi essencial para o sucesso dos experimentos que definiram os princípios básicos na superfície de um meio contendo ágar.da genética molecular, discutidos no Capítulo 3. (A. M. Siegelman/Visuals Unlimited.)
  • 15. 16 / GEOFFREY M. COOPER • ROBERT E. HAUSMAN A mistura de nutrientes na qual a E. coli divide-se mais rapidamente inclui glicose, sais e vários compostos orgânicos, como aminoácidos, vitaminas e precurso- res de ácidos nucléicos. Entretanto, a E. coli também pode crescer em um meio muito mais simples, contendo somente sais, uma fonte de nitrogênio (como a amô- nia) e uma fonte de carbono e energia (como a glicose). Nesse meio, a bactéria cresce um pouco mais lentamente (com o tempo de divisão de aproximadamente 40 minu- tos), pois ela deve sintetizar todos os seus aminoácidos, nucleotídeos e outros com- postos orgânicos. A habilidade da E. coli de realizar estas reações de biossíntese em um meio definido simples tornou-a extremamente útil para a elucidação das vias bioquímicas envolvidas nestes processos. Assim, o rápido crescimento e as exigências nutritivas simples da E. coli têm facilitado muito os experimentos fundamentais em biologia molecular e bioquímica. Leveduras Embora as bactérias sejam um inestimável modelo para o estudo de muitas proprie- dades conservadas das células, elas, obviamente, não podem ser utilizadas para estu- dar aspectos da estrutura celular e funções que sejam exclusivas dos eucariotos. As leveduras, os eucariotos mais simples, apresentam diversas vantagens experimentais semelhantes às da E. coli. Conseqüentemente, as leveduras têm sido um modelo essencial para estudos de muitos aspectos fundamentais da biologia celular de eucariotos. O genoma da levedura mais freqüentemente estudada, Saccharomyces cere- visiae, consiste em 12 milhões de pares de bases de DNA e contém aproximada- mente 6.000 genes. Apesar do genoma da levedura ser cerca de três vezes maior do que o da E. coli, ele é muito mais manejável do que o genoma dos eucariotos mais complexos, como o dos humanos. Mesmo com sua simplicidade, a célula da levedura apresenta as características típicas das células eucarióticas (Figura 1.15): ela contém o núcleo isolado pela membrana nuclear, seu DNA genômico é organizado em 16 cromossomos lineares e seu citoplasma contém um citoes- queleto e organelas subcelulares. As leveduras podem ser facilmente cultivadas em laboratório e podem ser estu- dadas por muitas das técnicas de genética molecular que são utilizadas com a E. coli. Apesar das leveduras não se replicarem tão rapidamente quanto as bactérias, elas dividem-se freqüentemente, a cada 2 horas, e podem ser facilmente cultivadas em colônias a partir de células isoladas. Conseqüentemente, as leveduras podem ser uti- lizadas para uma variedade de manipulações genéticas semelhantes àquelas que po- dem ser feitas com bactérias. Essas características têm feito da célula de levedura a célula eucarionte mais abordável pelo ponto de vista da biologia molecular. Leveduras mutantes têm sido importantes para o entendimento de muitos processos fundamentais em eucariotos, incluindo a replicação do DNA, a transcrição, o processamento do RNA, a organiza- ção protéica e a regulação da divisão celular, que serão discutidos nos capítulos se- guintes. A unidade da biologia celular e molecular tem ficado mais clara pelo fato de que os princípios gerais da estrutura e função celular, que têm sido revelados pelos estudos das leveduras, aplicam-se a todas as células eucarióticas. Dictyostelium discoideum O Dictyostelium discoideum é um fungo aquático que, como as leveduras, é um eucarionte unicelular relativamente simples. O genoma do Dictyostelium é aproxi- madamente dez vezes maior que o da E. coli – mais complexo que o genoma das leveduras, porém consideravelmente mais simples que o genoma dos eucariotos su- periores. Além disso, o Dictyostelium pode ser facilmente cultivado em laboratório e 2µm é suscetível a uma variedade de manipulações genéticas.Figura 1.15 Micrografia eletrônica de Sob condições de alimentação farta, o Dictyostelium vive como uma amebaSaccharomyces cerevisiae unicelular, alimentando-se de bactérias e leveduras. Ele é uma célula com grande(David Scharf/Peter Arnold, Inc.) mobilidade, e essa propriedade tem feito do Dictyostelium um importante modelo
  • 16. A CÉLULA / 17para estudos dos mecanismos moleculares responsáveis pelo movimento das célulasanimais (Figura 1.16). Por exemplo, a introdução no Dictyostelium de mutações es-pecíficas tem revelado o papel de vários genes envolvidos na mobilidade celular. Uma característica interessante adicional do Dictyostelium é a habilidade decélulas isoladas agregarem-se em estruturas multicelulares. Se um suplemento ade-quado de alimento não é fornecido, as células associam-se para formar uma estruturavermiforme chamada de lesma, cada uma contendo até 100.000 células que funcio-nam como um indivíduo. Por esse motivo o Dictyostelium parece estar no limiteentre organismos unicelulares e multicelulares, e fornece um importante modelopara estudos de sinalização celular e interação célula-célula.Caenorhabditis elegansOs eucariotos unicelulares Saccharomyces e Dictyostelium são importantes modelospara estudos de células eucarióticas, mas a compreensão do desenvolvimento de or-ganismos multicelulares requer a análise experimental de plantas e animais, organis-mos que são muito mais complexos. O nematóide Caenorhabditis elegans (Figura1.17) possui várias características importantes que o transformam em um dos mode-los mais usados para estudos de desenvolvimento e diferenciação celular dos animais. Embora o genoma do C. elegans (aproximadamente 100 milhões de pares debases) seja maior que o dos eucariotos unicelulares, ele é mais simples e mais mani-pulável que o genoma da maioria dos animais. A seqüência completa já foi determi-nada, revelando que o genoma do C. elegans contém aproximadamente 19.000 genes– quase três vezes o número de genes das leveduras, e a metade do número de genesdos humanos. Biologicamente, o C. elegans é um organismo multicelular relativa-mente simples: os vermes adultos são compostos de somente 959 células somáticas e1.000 a 2.000 células germinativas. Além disso, o C. elegans pode ser facilmentecultivado e submetido a manipulações genéticas em laboratório. A simplicidade do C. elegans tem permitido que o curso do seu desenvolvimen-to seja observado em detalhes por observação microscópica. Essas análises definiram 10 µma origem embrionária e a linhagem de todas as células de um verme adulto. Estudos Figura 1.16 Dictyostelium discoideumgenéticos também têm identificado várias das mutações responsáveis por anormali- Estas fotografias mostram o movimento dedades do desenvolvimento, permitindo o isolamento e a caracterização de genes es- duas amebas durante o tempo de 40 segun-senciais que controlam o desenvolvimento e a diferenciação do nematóide. De gran- dos. (Cortesia de David Knecht, University of Connecticut.)de importância, genes similares também têm sido encontrados em animais comple-xos (incluindo humanos), fazendo do C. elegans um importante modelo para estudosdo desenvolvimento animal.Drosophila melanogasterComo o C. elegans, a mosca-da-fruta Drosophila melanogaster (Figura 1.18) tem sido umorganismo-modelo essencial em biologia do desenvolvimento. O genoma da Drosophilaé de tamanho similar ao do C. elegans, embora o genoma da Drosophila contenha apenas Ovário Intestino Faringe Ovos Vulva Reto Ânus Figura 1.17 Caenorhabditis elegans (De J. E. Sulston e H. R. Horvitz, 1977. 1 mm Dev. Biol. 56:110.)
  • 17. 18 / GEOFFREY M. COOPER • ROBERT E. HAUSMAN cerca de 14.000 genes. Além disso, a Drosophila pode ser facilmente mantida e reprodu- zida em laboratório, e o seu curto ciclo reprodutivo (aproximadamente 2 semanas) a transformou em um organismo extremamente útil para experimentos genéticos. Muitos conceitos fundamentais da genética – como a relação entre genes e cromossomos – foram derivados de estudos com Drosophila no início do século XX (ver Capítulo 3). Extensas análises genéticas da Drosophila têm revelado muitos genes que con- trolam o desenvolvimento e a diferenciação, e os atuais métodos de biologia molecu- lar têm permitido que as funções desses genes sejam analisadas em detalhes. Conse- qüentemente, os estudos em Drosophila têm levado a surpreendentes avanços na compreensão dos mecanismos moleculares que controlam o desenvolvimento ani- mal, particularmente com respeito à formação do plano do corpo de organismos multicelulares complexos. Como com o C. elegans, existem genes e mecanismos si- milares em vertebrados, validando o uso da Drosophila como um importante modeloFigura 1.18 Drosophila melanogaster experimental na biologia do desenvolvimento contemporânea.(Darwin Dale/Photo Researchers, Inc.) Arabidopsis thaliana O estudo da biologia molecular e do desenvolvimento em plantas é uma área ativa e em expansão de considerável importância econômica, bem como de interesse inte- lectual. Uma vez que os genomas de plantas apresentam uma complexidade compa- rável com a dos genomas dos animais (ver Tabela 1.2), um modelo ideal para estudos com plantas deveria ser um organismo relativamente simples com algumas das carac- terísticas vantajosas do C. elegans e da Drosophila. A pequena planta com flor Arabi- dopsis thaliana (Figura 1.19) atende a esse critério, sendo amplamente usada como um modelo para o estudo da biologia molecular das plantas. A Arabidopsis é notável pelo seu genoma de somente cerca de 120 milhões de pares de bases, que contém aproximadamente 15.000 genes diferentes – uma com- plexidade semelhante à do C. elegans e da Drosophila. Além disso, a Arabidopsis é relativamente fácil de ser cultivada em laboratório, e métodos para manipulações genéticas moleculares dessa planta já foram desenvolvidos. Esses estudos têm permi- tido a identificação dos genes envolvidos em vários aspectos do desenvolvimento em plantas, como o desenvolvimento das flores. A análise desses genes aponta para mui- tas similaridades, mas também diferenças notáveis, entre os mecanismos que contro- lam o desenvolvimento das plantas e dos animais. Vertebrados Os animais mais complexos são os vertebrados, incluindo o homem e outros mamíferos. O genoma humano tem aproximadamente 3 bilhões de pares de bases – cerca de 30 vezes maior que o genoma do C. elegans, da Drosophila e da Arabidopsis – e contém 30-40.000 genes. Além disso, o corpo humano é composto de mais de 200 diferentes tipos de células especializadas. Essa complexidade torna difícil estudar os vertebrados pela perspectiva da biologia celular e molecular, mas muito do interesse das ciências biológicas origina-se do desejo da compreensão do organismo humano. Além disso, o entendimento de muitas questões de importância prática imediata (por exemplo, na medicina) deve ser baseado diretamente em estudos sobre tipos celulares humanos (ou proximamente relacionados). Um importante meio de estudar células humanas e de outros mamíferos é cultivar células isoladas, de forma que possam ser manipuladas em condições laboratoriais contro- ladas. O uso de cultura celular tem permitido o estudo de muitos aspectos da biologia celular de mamíferos, incluindo experimentos que têm elucidado os mecanismos da re- plicação do DNA, da expressão gênica, da síntese e do processamento protéico e da divisão celular. Além disso, a habilidade de cultivar células em meios quimicamente defi- nidos tem permitido o estudo dos mecanismos de sinalização que controlam o cresci- mento e a diferenciação normal dentro do organismo inteiro. As propriedades especializadas de algumas células altamente diferenciadas têmFigura 1.19 Arabidopsis thaliana feito delas modelos importantes para estudos de aspectos específicos da biologia ce-(Jeremy Burgess/Photo Researchers, Inc.) lular. Células musculares, por exemplo, são altamente especializadas para suportar
  • 18. A CÉLULA / 19contração, produzindo força e movimento. Em virtude dessa especialização, as célu-las musculares são um modelo essencial para o estudo de movimento celular no nívelmolecular. Outro exemplo é fornecido pelas células nervosas (neurônios), que sãoespecializadas para conduzir sinais eletroquímicos a grandes distâncias. Em huma-nos, os axônios das células nervosas podem ter mais de um metro de comprimento,e alguns invertebrados, como a lula, têm neurônios gigantes com axônios com maisde 1 mm de diâmetro em largura. Em razão de suas estruturas e funções altamenteespecializadas, esses neurônios gigantes têm sido um modelo importante para estu-dos sobre o transporte de íons através da membrana plasmática e sobre o papel docitoesqueleto no transporte das organelas citoplasmáticas. O sapo Xenopus laevis é um modelo importante para estudos do desenvolvi-mento inicial dos vertebrados. Os ovos do Xenopus são células extraordinariamentegrandes, com o diâmetro de aproximadamente 1 mm (Figura 1.20). Já que os ovos sedesenvolvem fora do corpo materno, todos os estágios do desenvolvimento a partir doovo até o girino podem ser facilmente estudados no laboratório. Além disso, os ovos deXenopus podem ser obtidos em grande número, facilitando as análises bio-químicas. Por causa dessas vantagens técnicas, o Xenopus tem sido ampla-mente utilizado em estudos da biologia do desenvolvimento e tem propor-cionado descobertas importantes dos mecanismos moleculares que contro-lam o desenvolvimento, a diferenciação e a divisão celular em embriões. O “zebrafish” (paulistinha) (Figura 1.21) possui numerosas vanta-gens para estudos genéticos do desenvolvimento de vertebrados. Essepequeno peixe é facilmente mantido em laboratório e reproduz-se rapi-damente. Além disso, o embrião desenvolve-se fora da mãe e é transpa-rente, fazendo com que os estágios iniciais do desenvolvimento possamser observados facilmente. Métodos poderosos têm sido desenvolvidospara facilitar o isolamento de mutações que afetem o desenvolvimentodo “zebrafish”, e vários milhares dessas mutações têm sido identificados.Por ser um vertebrado de fácil estudo, o “zebrafish” é um promissor pon-to de conexão para a análise das diferenças entre os humanos e os siste-mas invertebrados mais simples, como o C. elegans e a Drosophila. Dentre os mamíferos, o camundongo é o mais adequado para análises 1 mmgenéticas, que serão facilitadas pela conclusão recente da seqüência genômi- Figura 1.20 Ovos do sapo Xenopusca deste organismo. Apesar das dificuldades técnicas em estudar a genética do camundon- laevisgo (comparada, por exemplo, com a genética da levedura ou Drosophila) serem grandes, (Cortesia de Michael Danilchik e Kimberlymuitas mutações que afetam o desenvolvimento do camundongo têm sido identifi- Ray.)(A) Figura 1.21 “Zebrafish” (A) Um embrião com 24 horas. (B) Um peixe adulto. (A, cortesia de Charles Kim- mel, University of Oregon; B, cortesia de S. Kondo.) (B)
  • 19. 20 / GEOFFREY M. COOPER • ROBERT E. HAUSMAN cadas. Mais importante, avanços recentes na biologia molecular têm permitido a produção de camundongos transgênicos, nos quais genes mutantes específicos são introduzidos nas linhagens germinativas do camundongo, fazendo com que seus efeitos no desenvolvimento ou em outros aspectos da função celular possam ser estu- dados no contexto do animal completo. A adequação do camundongo como modelo para o estudo do desenvolvimento humano é indicada não apenas pelas similarida- des dos genomas humanos e de camundongo, mas também pelo fato de que mutações em genes homólogos resultam em defeitos semelhantes no desenvolvimento de ambas as espécies (Figura 1.22); um defeito de pigmentação fornece excelente exemplo. Ferramentas da Biologia Celular Como em todas as ciências experimentais, a pesquisa em biologia celular depende de técnicas laboratoriais que possam ser usadas para estudar a estrutura e a função celular. Avanços muito importantes na compreensão das células têm sucedido diretamente o desenvolvimento de novas técnicas, que permitiram novos meios de investigação. O exa- me das metodologias experimentais disponíveis para a biologia celular é essencial para a compreensão tanto da situação atual como do direcionamento futuro dessa área de avan- ço rápido da ciência. Algumas das importantes técnicas de uso comum da biologia celular são descritas nas seções seguintes. Outros métodos experimentais, incluindo os métodos bioquímicos e de biologia molecular, serão discutidos em capítulos posteriores. Microscopia Ótica Já que a maioria das células é muito pequena para ser vista a olho nu, o estudo das células depende fortemente do uso de microscópios. Na realidade, a descoberta das células resul- tou do desenvolvimento do microscópio: Robert Hooke inventou o termo “célula” após suas observações de um pedaço de cortiça com um microscópio ótico simples, em 1665 (Figura 1.23). Usando um microscópio que aumentava os objetos cerca de 300 vezes seu tamanho real, Antony van Leeuwenhoek, por volta de 1670, foi capaz de observar uma grande variedade de tipos celulares diferentes, incluindo espermatozóides, glóbulos ver- melhos e bactérias. A proposta da teoria celular por Matthias Schleiden e Theodor Schwann, em 1838, pode ser vista como o nascimento da biologia celular contemporânea. Estudos microscópicos de tecidos de plantas por Schleiden e de tecidos animais por SchwannFigura 1.22 O camundongo comomodelo para o desenvolvimento dohomemUma criança e um camundongo apresen-tam defeitos de pigmentação semelhantescomo resultado de mutações no gene neces-sário para a migração normal dos melanóci-tos (as células responsáveis pela pigmenta-ção da pele) durante o desenvolvimento doembrião. (Cortesia de R. A. Fleischman, Ma-rkey Cancer Center, University of Kentucky.)
  • 20. A CÉLULA / 21levaram às mesmas conclusões: todos os organismos são compostos por células. Poucotempo após, foi reconhecido que as células não são formadas de novo, mas originam-sesomente por divisão de células preexistentes. Conseqüentemente, em razão das observa-ções feitas com o microscópio ótico, a célula foi reconhecida como a unidade fundamen-tal de todos os organismos vivos. O microscópio ótico permanece como um instrumento básico dos biólogos celula-res, com aperfeiçoamentos técnicos permitindo a crescente visualização de detalhes daestrutura celular. Os microscópios óticos atuais são capazes de ampliar objetos até milvezes. Já que a maioria das células tem entre 1 e 100 µm de diâmetro, elas podem serobservadas por microscopia ótica, como também o podem algumas das organelas subce-lulares maiores, como núcleo, cloroplastos e mitocôndrias. Entretanto, o microscópioótico não é suficientemente poderoso para revelar detalhes finos da estrutura celular, jáque a resolução – a habilidade de um microscópio de distinguir objetos separados pordistâncias pequenas – é mais importante do que a ampliação. Imagens podem ser amplia-das tanto quanto desejado (por exemplo, por projeção em uma tela grande), mas a ampli- Figura 1.23 A estrutura celular da cortiçaação não aumenta o nível dos detalhes que podem ser observados. Uma reprodução do desenho de Robert O limite da resolução do microscópio ótico é de aproximadamente 0,2 µm; Hooke de uma fina lâmina de cortiça obser-dois objetos separados por uma distância menor que essa aparecem como uma única vada em um microscópio ótico. As “células”imagem, em vez de serem distinguidos um do outro. Esse limite teórico da microsco- que Hooke observou eram na verdade so-pia ótica é determinado por dois fatores – o comprimento de onda (λ) da luz visível mente as paredes celulares remanescentes das células que já tinham morrido.e a convergência ótica das lentes microscópicas (abertura numérica, NA) – de acordocom a seguinte equação: 0,61λ Resolução = NAO comprimento de onda da luz visível é de 0,4 a 0,7 µm, de modo que o valor de λé fixado em aproximadamente 0,5 µm para o microscópio ótico. A abertura numéri-ca pode ser considerada como o tamanho do cone de luz que entra nas lentes domicroscópio após passar através da amostra (Figura 1.24). Isto é dado pela equação: NA= η sen αonde η é o índice de refração do meio através do qual a luz passa entre a amostra e alente. O valor de η para o ar é de 1,0, mas pode ser aumentado para um máximo de Lentes da objetiva α Amostra Lentes do condensador Figura 1.24 Abertura numérica A luz é focalizada na amostra pelas lentes do condensador e então coletada pelas lentes Luz da objetiva do microscópio. A abertura nu- mérica é determinada pelo ângulo do cone de luz que entra nas lentes da objetiva (α) e pelo índice de refração do meio (geralmente ar ou óleo) entre as lentes e a amostra.
  • 21. 22 / GEOFFREY M. COOPER • ROBERT E. HAUSMAN aproximadamente 1,4 pelo uso de uma lente para óleo de imersão, quando a amostra é vista através de uma gota de óleo. O ângulo α corresponde à metade do compri- mento do cone de luz recebido pela lente. O valor máximo de α é 90o, sendo seno α = 1, de modo que o maior valor possível para a abertura numérica é 1,4. Portanto, o limite teórico para a resolução do microscópio ótico pode ser calcu- lado como segue: Resolução = 0,61 x 0,5 = 0,22 µm 1,4 Microscópios capazes de atingir esse nível de resolução já podiam ser feitos no fim do século XIX; portanto, aprimoramentos nesse aspecto da microscopia ótica não devem ser esperados. Vários tipos diferentes de microscopia ótica são rotineiramente usados para o estudo de vários aspectos da estrutura celular. O mais simples é a microscopia de campo claro, no qual a luz passa diretamente através da célula e a capacidade de distinguir diferentes partes da célula depende do contraste resultante da ab- sorção da luz visível pelos componentes celulares. Em muitos casos, células são coradas com corantes que reagem com proteínas e ácidos nucléicos com o obje- tivo de aumentar o contraste entre as diferentes partes da célula. Antes da colo- ração, as amostras em geral são tratadas com fixadores (como álcool, ácido acéti- co ou formaldeído) para estabilizar e preservar suas estruturas. A análise de teci- dos fixados e corados pela microscopia de campo claro é o método-padrão para a análise de amostras de tecidos em laboratórios de histologia (Figura 1.25). En- tretanto, esses procedimentos de coloração matam as células e, portanto, não são adequados para muitos experimentos, nos quais a observação de células vivas é desejável. Sem coloração, a passagem direta da luz não fornece contraste suficiente para distinguir muitas partes da célula, limitando a utilização da microscopia de campo claro. Entretanto, variações do microscópio ótico podem ser usadas para aumentar o contraste entre as ondas de luz que passam através de regiões da célula de densidades diferentes. Dois dos métodos mais comuns para visualiza- ção de células vivas são a microscopia de contraste de fase e a microscopia de contraste de interferência diferencial (Figura 1.26). Ambos os tipos de micros- copia usam sistemas óticos que convertem variações de densidade ou espessuraFigura 1.25 Micrografia de campoclaro de tecido coradoSecção de um tumor benigno de rim. (G.W. Willis/Biological Photo Service.)
  • 22. A CÉLULA / 23Figura 1.26 Observação microscópica de células vivas (A)Micrografias de células humanas obtidas com microscopia de (A) campo claro, (B) contraste de fase e (C)contraste de interferência diferencial. (Cortesia de Mort Abramowitz, Olympus, America, Inc.)entre partes diferentes da célula em diferenças no contraste que podem ser vistasna imagem final. Na microscopia de campo claro, estruturas transparentes (comoo núcleo) têm pouco contraste porque absorvem pouca luz. Entretanto, a luztem a velocidade reduzida pela passagem nessas estruturas de tal forma que suafase é alterada, comparada à luz que passa através do citoplasma que circunda onúcleo. A microscopia de contraste de fase e a de contraste de interferência dife- (B)rencial convertem essas diferenças na fase para diferenças no contraste, dessemodo produzindo melhores imagens de células vivas não-coradas. O poder do microscópio ótico foi consideravelmente expandido pelo usode câmaras digitais e computadores para análise e processamento das imagens.Os sistemas eletrônicos de análise e processamento de imagens podem melhorarsubstancialmente o contraste das imagens obtidas com o microscópio ótico, per-mitindo a visualização de pequenos objetos que de outro modo não seriam de-tectados. Por exemplo, a microscopia de contraste de interferência diferencialintensificada por vídeo permite a visualização do movimento das organelas atra-vés dos microtúbulos, que são filamentos protéicos do citoesqueleto com um (C)diâmetro de apenas 0,025 µm (Figura 1.27). Entretanto, esta amplificação nãoultrapassa o limite teórico da resolução do microscópio ótico, de aproximada-mente 0,2 µm. Então, embora o realce pelo vídeo permita a visualização dosmicrotúbulos, eles aparecem como imagens borradas de pelo menos 0,2 µm dediâmetro e um microtúbulo individual não pode ser distinguido de um feixe deestruturas adjacentes. A microscopia ótica tem sido usada no nível de análise molecular por méto-dos de marcação de moléculas específicas, e assim elas podem ser visualizadas nointerior das células. Genes ou RNA transcritos específicos podem ser detectadospor hibridização com sondas de ácidos nucléicos com seqüências complementa- 50 µmres, e proteínas podem ser detectadas pelo uso de anticorpos apropriados (verCapítulo 3). Tanto sondas de ácidos nucléicos como anticorpos podem ser mar-cados com uma variedade de substâncias que permitem sua visualização no mi-croscópio ótico, tornando possível determinar a localização de moléculas especí-ficas dentro de células individuais. A microscopia de fluorescência é um método muito sensível e amplamenteusado para o estudo da distribuição intracelular de moléculas (Figura 1.28). Umcorante fluorescente é usado para marcar a molécula de interesse dentro de célulasfixadas ou vivas. O corante fluorescente é uma molécula que absorve luz em umcomprimento de onda e emite luz em um segundo comprimento de onda. Essafluorescência é detectada pela iluminação da amostra com luz no comprimento deonda que excita o corante fluorescente, seguida do uso de filtros adequados paradetectar o comprimento de onda específico que o corante emite. A microscopia defluorescência pode ser usada para estudar diferentes moléculas dentro das células.Uma aplicação freqüente é a marcação direta de anticorpos contra uma proteínaespecífica com corante fluorescente, fazendo com que a distribuição intracelular daproteína possa ser determinada. Um avanço importante e recente na microscopia de fluorescência foi o uso daproteína fluorescente verde (GFP), do inglês Green Fluorescent Protein, de uma me-dusa para visualizar proteínas dentro de células vivas. A GFP pode ser fusionada aFigura 1.27 Microscopia de contraste de interferência diferencial intensificada por vídeoO processamento eletrônico de imagem permite a visualização de microtúbulos individuais. (Corte-sia de E. D. Salmon, University of North Carolina, Chapel Hill.) 2,5 µm
  • 23. 24 / GEOFFREY M. COOPER • ROBERT E. HAUSMAN (A) Ocular (B) Filtro barreira Espelho dicróico Luz fluorescente Lentes da objetiva Filtro excitatório Amostra 10 µmFigura 1.28 Microscopia defluorescência(A) A luz passa através de um filtro excita-tório para selecionar o comprimento deonda da luz (por exemplo, azul) que excitao corante fluorescente. Um espelho dicróicoreflete a luz excitada para baixo para atingira amostra. A luz fluorescente emitida pela qualquer proteína de interesse, pelo uso de técnicas-padrão de DNA recombinante,amostra (por exemplo, verde) passa através e então a proteína ligada à GFP pode ser introduzida nas células e detectada pordo espelho dicróico e por um segundo filtro(o filtro barreira) para selecionar o compri- microscopia de fluorescência, sem necessidade de fixar e corar a célula, como seriamento de onda da luz emitida pelo corante. preciso para a detecção de proteínas com anticorpos. Devido à sua versatilidade, o(B) Microscopia fluorescente de uma célula uso de GFP se tornou extremamente difundido em biologia celular e tem sido em-de pulmão na qual o DNA é corado em pregado para acompanhar a localização e os movimentos de uma ampla variedade deazul e os microtúbulos no citoplasma são proteínas dentro de células vivas (Figura 1.29).corados em verde. (Conly S. Rieder/Biolo-gical Photo Service.) A microscopia confocal combina a microscopia de fluorescência com a aná- lise eletrônica de imagens para obter imagens com contraste e detalhes aumenta- dos. Um pequeno ponto de luz, usualmente emitido por um laser, é focado na amostra, em uma profundidade específica. A luz fluorescente emitida é coletada por um detector com uma câmera de vídeo. Entretanto, antes da luz emitida alcançar o detector, ela deve passar através de uma abertura capilar (chamada de abertura confocal) precisamente colocada no ponto onde a luz emitida, a partir da profundidade escolhida na amostra, aproxima-se do foco (Figura 1.30). Con- seqüentemente, somente a luz emitida a partir do plano de foco é capaz de atin- gir o detector. Uma varredura da amostra gera uma imagem bidimensional doFigura 1.29 Microscopia defluorescência de uma proteínamarcada com GFPUma proteína mitocondrial fusionada àGFP foi introduzida em células humanasem cultura e visualizada por meio da mi-croscopia de fluorescência. (Courtesy of BDBiosciences Clontech.)
  • 24. A CÉLULA / 25Figura 1.30 Microscopia confocal Luz em focoUm fino feixe de luz é focado na amostra em uma profundidade específica, e a luz fluorescente emi- alcança o Detectortida é coletada por um detector. Antes de atingir o detector, a luz fluorescente emitida pela amostra detectorpassa através de uma abertura confocal colocada no ponto onde a luz emitida a partir da profundi-dade escolhida da amostra entra em foco. Como resultado, somente a luz emitida no foco da pro- Aberturafundidade escolhida da amostra é detectada. confocal Luz fora de foco é impe-plano de foco, uma imagem muito mais precisa que a obtida com a microscopia de dida de al-fluorescência padrão (Figura 1.31). Além do mais, uma série de imagens obtidas de cançar odiferentes profundidades pode ser usada para a construção de uma imagem tridi- detectormensional da amostra. Luz A microscopia de excitação multifóton é uma alternativa para a microscopia fluorescenteconfocal que pode ser usada em células vivas. A amostra é iluminada com um com- emitidaprimento de onda de luz que, para excitar o corante fluorescente, necessita da absor- Em focoção simultânea de dois ou mais fótons (Figura 1.32). A probabilidade de dois ou Fora de focomais fótons simultaneamente excitarem o corante fluorescente só é significativa noponto da amostra acima do qual o feixe do laser é focado, de modo que a fluorescên- Amostracia só é emitida a partir do plano de foco da luz emitida. Essa excitação altamentelocalizada fornece automaticamente uma resolução tridimensional, sem a necessida-de da passagem da luz emitida através de uma abertura capilar, como na microscopiaconfocal. Além do mais, a excitação localizada minimiza os danos à amostra, permi-tindo imagens tridimensionais de células vivas.Microscopia EletrônicaEm razão do limite da resolução do microscópio ótico, a análise de detalhes da estru-tura celular requer o uso de técnicas microscópicas mais potentes – por exemplo, amicroscopia eletrônica, que foi desenvolvida na década de 1930 e foi usada pelaprimeira vez para análise de amostras biológicas por Albert Claude, Keith Porter eGeorge Palade durante os anos de 1940 e 1950. O microscópio eletrônico pode Figura 1.31 Micrografia confocal de células humanas Microtúbulos e filamentos de actina são co- rados com corantes fluorescentes vermelho e verde, respectivamente. (K.G Murti/Vi- suals Unlimited.)
  • 25. 26 / GEOFFREY M. COOPER • ROBERT E. HAUSMANFigura 1.32 Microscopia de excitaçãode dois fótons FluoróforoA absorção simultânea de dois fótons é ne- Pulso de lasercessária para excitar o corante fluorescente.Isso somente ocorre no ponto da amostrano qual a luz é focada, de modo que a luzfluorescente é emitida apenas a partir deuma profundidade escolhida da amostra. Amostra Fluoróforo contendo excitado fluoróforos Excitação de dois fótons Fóton alcançar uma resolução muito maior que a obtida pelo microscópio ótico porque o comprimento de ondas dos elétrons é menor do que o da luz. O comprimento de onda dos elétrons em um microscópio eletrônico pode ser tão curto quanto 0,004 nm – cerca de 100.000 vezes menor que o comprimento de onda da luz visível. Teoricamente, esse comprimento de onda poderia permitir uma resolução de 0,002 nm, mas tal resolução não pode ser obtida na prática, porque a resolução é determi- nada não somente pelo comprimento de onda, mas também pela abertura numérica das lentes microscópicas. A abertura numérica é um fator limitante para a microsco- pia eletrônica porque as propriedades inerentes das lentes eletromagnéticas limitam seu ângulo de abertura em cerca de 0,5 grau, correspondente a aberturas numéricas de cerca de 0,01. Então, sob condições ótimas, a capacidade de resolução do micros- cópio eletrônico é de aproximadamente 0,2 nm. Além do mais, a resolução que pode ser obtida com amostras biológicas é também limitada pela perda inerente de con- traste da amostra. Conseqüentemente, para amostras biológicas, o limite prático da resolução do microscópio eletrônico é de 1 a 2 nm. Embora essa resolução seja muito menor que a predita simplesmente pelo comprimento de onda dos elétrons, ela represen- ta um aumento de mais cem vezes na capacidade de resolução do microscópio ótico. Dois tipos de microscopia eletrônica – transmissão e varredura – são amplamente utilizados para estudar as células. Em princípio, a microscopia eletrônica de transmissão é similar à observação de células coradas com o microscópio de campo claro. As amostras são fixadas e coradas com sais de metais pesados, que fornecem contraste através da dis- persão de elétrons. Um feixe de elétrons é passado através da amostra e focado para formar uma imagem em uma tela fluorescente. Elétrons que encontram um íon de metal pesado quando passam através da amostra são defletidos e não contribuem para a imagem final, de maneira que áreas coradas da amostra aparecem escuras. Amostras para serem examinadas por microscopia eletrônica de transmissão podem ser preparadas por coloração negativa ou positiva. Na coloração positiva, os tecidos da amostra são cortados em secções finas e corados com sais de metais pesa- dos (como tetraóxido de ósmio, acetato de urânio e citrato de chumbo) que reagem com lipídeos, proteínas e ácidos nucléicos. Esses íons de metais pesados ligam-se a uma variedade de estruturas celulares, que conseqüentemente aparecem escuras na imagem final (Figura 1.33). Um procedimento alternativo da coloração positiva pode ser usado também para identificar macromoléculas específicas dentro da célula. Por exemplo, anticorpos marcados com metais pesados eletrodensos (como partículas de ouro) são freqüentemente usados para determinar a localização subcelular de proteí- nas específicas com o microscópio eletrônico. Esse método é similar ao uso de anti- 5 µm corpos marcados com corantes fluorescentes na microscopia de fluorescência.Figura 1.33 Coloração positiva A coloração negativa é útil para a visualização de estruturas biológicas intactas,Micrografia eletrônica de transmissão deum polimorfonuclear corado positivamen- como uma bactéria, organelas subcelulares isoladas e macromoléculas (Figura 1.34).te. (Don W. Fawcett/Visuals Unlimited.) Nesse método, a amostra biológica é depositada sobre um filme de suporte, e um
  • 26. A CÉLULA / 27 Figura 1.34 Coloração negativa Micrografia eletrônica de transmissão de fi- lamentos de actina corados negativamente. (Cortesia de Roger Craig, University of Massachusetts Medical Center.)corante de metal pesado é seco ao redor da sua superfície. A amostra não-corada écoberta por um filme de corante eletrodenso, produzindo uma imagem na qual aamostra aparece clara contra um fundo escuro corado. O sombreamento metálico é outra técnica usada para visualizar a superfície deestruturas subcelulares isoladas ou macromoléculas com o microscópio eletrônico detransmissão (Figura 1.35). A amostra é coberta com uma fina camada de um metalvaporizado, como a platina. O metal é borrifado sobre a amostra em um ângulo tal queas superfícies da amostra em frente da fonte das moléculas de metal vaporizado são maiscobertas do que as outras. Esse revestimento diferencial cria um efeito de sombra,dando à amostra uma aparência tridimensional nas micrografias eletrônicas. A preparação de amostras por criofratura, em combinação com o sombrea-mento metálico, tem sido particularmente importante nos estudos da estrutura demembranas. Amostras são congeladas em nitrogênio líquido (a -196ºC) e então que-bradas com uma lâmina não-cortante. Freqüentemente, esse processo divide a bica-mada de lipídeos, revelando a face interior da membrana celular (Figura 1.36). Aamostra é então recoberta com platina, e o material biológico é dissolvido com áci-do, produzindo uma réplica metálica da superfície da amostra. O exame dessas répli-cas no microscópio eletrônico revela muitas alterações na superfície, corresponden-do às proteínas que atravessam a bicamada de lipídeos. Uma variação da criofraturaé chamada de esboço por congelamento, que permite, além das faces internas, avisualização das superfícies externas das membranas celulares. O segundo tipo de microscopia eletrônica, a microscopia eletrônica de varredura,é usado para dar uma imagem tridimensional das células (Figura 1.37). Na microscopiaeletrônica de varredura, o feixe de elétrons não passa através da amostra. Em vez disso, a Figura 1.35 Sombreamento metálico Micrografia eletrônica de filamentos de ac- tina/miosina do citoesqueleto preparados por sombreamento metálico. (Don W. Fa- wcett, J. Heuser/Photo Researchers, Inc.)
  • 27. 28 / GEOFFREY M. COOPER • ROBERT E. HAUSMAN(A) (B) Figura 1.36 Criofratura (A) A criofratura divide a bicamada de lipídeos,Proteínas deixando as proteínas associadas a uma das duas metades da membrana. (B) Micrografia de mem- brana plasmática criofragmentada de duas células adjacentes. Proteínas que atravessam a bicamada de lipídeos aparecem como partículas dentro das Fosfolipídeos membranas (seta). (Don W. Fawcett/Photo Rese- archers, Inc.) superfície da célula é coberta com um metal pesado, e um feixe de elétrons é usado para varrer a superfície da amostra. Elétrons que são dispersos ou emitidos a partir da superfí- cie da amostra são detectados para gerarem uma imagem tridimensional conforme o feixe de elétrons move-se através da célula. Uma vez que a resolução da microscopia eletrônica de varredura é de somente 10 nm, seu uso é geralmente restrito ao estudo de células inteiras em vez de organelas subcelulares ou macromoléculas. Fracionamento Subcelular Embora o microscópio eletrônico permita visualização detalhada da estrutura celular, a microscopia sozinha não é suficiente para definir as funções dos vários componentes de células eucarióticas. Para responder a muitas das questões concernentes às funções das organelas subcelulares, tem sido necessário isolar as organelas de células eucarióticas de modo que possam ser utilizadas para estudos bioquímicos. Isso é geralmente realizado por centrifugação diferencial – um método desenvolvido primariamente por Albert Clau- de, Christian de Duve e seus colegas nas décadas de 1940 e 1950 para separar componen- tes da célula com base em seus tamanhos e densidades. A primeira etapa no fracionamento subcelular é a ruptura da membrana plas- mática sob condições em que não ocorra a destruição dos componentes internos da célula. Diversos métodos são usados, incluindo sonicação (exposição a sons de alta freqüência), trituração com homogeneizadores mecânicos ou tratamento com mace- radores de alta velocidade (liquidificadores). Todos esses procedimentos quebram a membrana plasmática e o retículo endoplasmático em pequenos fragmentos, en- quanto deixam intactos outros componentes da célula (como núcleo, lisossomos, peroxissomos, mitocôndrias e cloroplastos). A suspensão de células rompidas (chamada de lisado ou homogenato) é então fracionada em seus componentes por uma série de centrifugações em uma ultracen- 5 µm trífuga, que roda amostras em velocidades muito grandes (acima de 100.000 rpm) para produzir forças até 500.000 vezes maiores que a gravidade. Essa força leva osFigura 1.37 Microscopia eletrônica devarredura componentes celulares a moverem-se em direção ao fundo do tubo da centrífuga eMicrografia eletrônica de varredura de formarem um sedimento (um processo chamado de sedimentação) em uma veloci-um macrófago. (David Phillips/Visuals dade que depende do seu tamanho e densidade, com as estruturas maiores e maisUnlimited.) pesadas sedimentando-se mais rapidamente (Figura 1.38). Geralmente, o homoge-
  • 28. A CÉLULA / 29 Figura 1.38 Fracionamento subcelular As células são lisadas e os componentes subcelulares são separa- dos por uma série de centrifugações com velocidades crescentes. Após cada centrifugação, as organelas que se sedimentaram no fundo do tubo são recolhidas. O sobrenadante é novamente centrifugado em uma velocidade maior para sedimentar as orga- nelas seguintes em tamanho. Centrifugar a 800 × a gravidade (10 min)Suspensão decélulas rompidas contendocomponentes subcelulares,como lisossomos, peroxissomose fragmentos da membrana Centrifugar sobrenadante a 15.000 × a gravidade (10 min)Núcleossedimentados Centrifugar sobrenadante a 100.000 × a gravidade (60 min)Mitocôndrias,lisossomos eperoxissomossedimentados Centrifugar sobrenadante a 200.000 × a gravidade (3 horas)Fragmentos da membranaplasmática e retículoendoplasmáticosedimentados Citosol Ribossomos sedimentados
  • 29. 30 / GEOFFREY M. COOPER • ROBERT E. HAUSMAN nato celular é primeiro centrifugado a uma baixa velocidade, na qual sedimentam apenas as células não-lisadas e a maior estrutura subcelular – o núcleo. Então, uma fração enriquecida de núcleos pode ser recuperada do sedimento da centrifugação a uma baixa velocidade enquanto os outros componentes celulares permanecem no sobrenadante (a solução remanescente). O sobrenadante é então centrifugado a uma maior velocidade para sedimentar as mitocôndrias, os cloroplastos, os lisossomos e os peroxissomos. A recentrifugação do sobrenadante em velocidade ainda mais alta sedimenta fragmentos da membrana citoplasmática e o retículo endoplasmático. Uma quarta centrifugação, com velocidade ainda mais alta, sedimenta os ribossomos, dei- xando somente a porção solúvel do citoplasma (o citosol) no sobrenadante. As frações obtidas pela centrifugação diferencial correspondem a preparações enriquecidas, mas ainda não-puras, de organelas. Um grau maior de purificação pode ser obtido por centrifugação em gradiente de densidade, na qual as organelas são separadas por sedimentação através de um gradiente de uma substância densa, como a sacarose. Na centrifugação por velocidade, o material de partida é colocado no topo do gradiente de sacarose (Figura 1.39). Partículas de diferentes tamanhos sedi- mentam através do gradiente em taxas diferentes, movendo-se como bandas defini- das. Após a centrifugação, a coleta das frações individuais do gradiente permite uma A amostra é colocada no topo de um gradiente de sacarose. Partículas de sedimentação lenta Centrifugar Partículas de diferentes tamanhos Gradiente sedimentam como bandas definidas. de sacarose Partículas de sedimentação rápida Coletar as frações do gradiente.Figura 1.39 Centrifugação de velocidade em um gradiente de densidadeA amostra é colocada no topo de um gradiente de sacarose e as partículas de tama-nhos diferentes sedimentam através do gradiente como bandas definidas. As partícu-las separadas são coletadas em frações individuais do gradiente, que podem ser obti- Partículas de Partículas dedas simplesmente furando o fundo do tubo de centrifugação e coletando-se as gotas. sedimentação rápida sedimentação lenta
  • 30. A CÉLULA / 31resolução suficiente para separar organelas de tamanhos semelhantes, como mito-côndrias, lisossomos e peroxissomos. A centrifugação de equilíbrio em gradientes de densidade pode ser usada paraseparar componentes subcelulares com base nas suas densidades de flutuação, inde-pendentemente de seu tamanho ou forma. Neste processo, a amostra é centrifugadaem um gradiente contendo alta concentração de sacarose ou cloreto de césio. Em vezde serem separadas com base na velocidade de sedimentação, as partículas da amos-tra são centrifugadas até atingirem uma posição de equilíbrio, na qual sua densidadeé igual à da solução de sacarose ou cloreto de césio. Essas centrifugações de equilíbriosão úteis na separação de diferentes tipos de membranas e são suficientemente sensí-veis para separar macromoléculas que são marcadas com diferentes isótopos. Umexemplo clássico, discutido no Capítulo 3, é a análise da replicação do DNA atravésda separação de moléculas de DNA contendo isótopos pesados e leves de nitrogênio(15N e 14N) por centrifugação de equilíbrio em gradiente de cloreto de césio.Crescimento de Células Animais em CulturaA habilidade de estudar células depende muito de quão facilmente elas podem sercultivadas e manipuladas em laboratório. Apesar do processo ser tecnicamente maisdifícil do que cultivar bactérias ou leveduras, uma grande variedade de células deanimais e plantas pode ser cultivada e manipulada em cultura. Esses sistemas decultivo de células in vitro têm permitido que os cientistas estudem o crescimento e adiferenciação celular, bem como efetuem manipulações genéticas necessárias para acompreensão da estrutura e função dos genes. As culturas de células animais são iniciadas pelo isolamento de células a partirde pedaços de tecidos e, a seguir, as células são adicionadas em placas de cultivocontendo meio nutritivo. A maioria dos tipos de células animais, como fibroblastose células epiteliais, adere-se e cresce na superfície plástica das placas usadas para cul-tivo de células (Figura 1.40). Embriões e tumores são freqüentemente usados comomaterial de partida, já que eles contêm células de crescimento rápido. Particular-mente, fibroblastos de embriões crescem muito bem em cultura e como conseqüên-cia são um dos tipos mais amplamente estudados de células animais. Entretanto, sobcondições apropriadas, muitos tipos de células especializadas também podem crescerem cultura, permitindo que suas propriedades diferenciadas possam ser estudadasem um ambiente experimental controlado. As células-tronco embrionárias são umexemplo particularmente interessante. Essas células são estabelecidas em cultura apartir de embriões precoces e mantêm sua capacidade de diferenciar-se em todos ostipos de células presentes em organismos adultos. Conseqüentemente, as células-tronco embrionárias desempenham um papel importante no estudo das funções demuitos genes no desenvolvimento do camundongo, assim como oferecem a possibi-lidade de contribuir para o tratamento de doenças humanas, fornecendo uma fontede tecidos para transplantoterapias. Os meios de cultura necessários para a propagação de células animais são muitomais complexos que o meio mínimo suficiente para sustentar o crescimento de bac-térias e leveduras. Os primeiros estudos de cultura celular utilizavam meios compos-tos de componentes indefinidos, como plasma, soro e extratos de embrião. Um im-portante avanço foi feito em 1955, quando Harry Eagle descreveu o primeiro meiodefinido que sustentava o crescimento de células animais. Além de sais e glicose, osmeios usados para cultivo de células animais contêm vários aminoácidos e vitaminas,que as células não podem sintetizar. O meio de crescimento para a maioria das célu-las animais em cultura também inclui soro, que serve como fonte de fatores de cres- 10 µmcimento necessários para estimular a divisão celular. Vários fatores de crescimentotêm sido identificados. Eles servem como reguladores essenciais para o crescimento e Figura 1.40 Células animais em culturaa diferenciação de células em organismos multicelulares, fornecendo sinais pelos quais Micrografia eletrônica de varredura de fi- broblastos humanos aderidos à superfície decélulas diferentes comunicam-se entre si. Por exemplo, uma importante função uma placa de cultura. (David M. Phillips/dos fibroblastos da pele no animal intacto é a proliferação quando for necessário Visuals Unlimited.)
  • 31. 32 / GEOFFREY M. COOPER • ROBERT E. HAUSMAN EXPERIMENTO-CHAVE Cultura de Células Animais Nutrition Needs of Mammalian Cells in Tissue Culture Harry Eagle National Institutes of Health, Bethesda, MD Science, Volume 122, 1955, pages 501-504 O Contexto componentes desse meio, Eagle foi ca- As primeiras culturas de células envol- paz de determinar os nutrientes especí- veram o crescimento de células a partir ficos necessários para o crescimento ce- de fragmentos de tecidos que foram lular. Além dos sais e da glicose, esses nutrientes incluem 13 aminoácidos e Harry Eagle apoiados em coágulos de plasma – um sistema de cultura que estava muito dis- várias vitaminas. Também foi necessária tante do necessário para análises experi- uma pequena quantidade de proteínas ampla variedade de células sob condi- mentais. No final da década de 1940, de soro. O meio básico desenvolvido ções experimentais definidas, que tem um grande avanço foi o estabelecimen- por Eagle está descrito na tabela anexa, sido essencial para estudos do cresci- to de linhagens celulares que cresciam a uma cópia do seu artigo de 1955*. mento e da diferenciação de células partir de células isoladas aderidas à su- animais, incluindo a identificação dos perfície de placas de cultura. Mas essas O Impacto fatores de crescimento presentes no células eram ainda cultivadas em meios O meio desenvolvido por Eagle é ain- soro – atualmente sabe-se que inclu- indefinidos que consistiam em uma da o meio básico usado para cultura em polipeptídeos que controlam o combinação variada de soro e extratos de células animais. Seu uso tem per- comportamento das células indivi- embrionários. Por exemplo, uma linha- mitido aos cientistas o cultivo de uma duais no animal intacto. gem de célula de câncer humano am- plamente usada (chamada de células Table 4. Basal media for cultivation of the HeLa cell and mouse fibroblast (10 ) HeLa) foi estabelecida inicialmente em L-Amino acids* Vitamins‡ 1952 pelo crescimento em um meio (mM ) (mM ) Miscellaneous contendo plasma de galinha, extrato de Arginine 0.1 Biotin 10-3 Glucose 5mM§ embrião bovino e soro de cordão umbi- Cystine 0.05 (0.02)† Choline 10-3 Penicillin 0.005%# lical humano. O uso desse meio de cul- Glutamine 2.0 (1.0)|| Folic acid 10-3 Streptomycin 0.005%# tura complexo e indefinido torna im- Histidine 0.05 (00.2)† Nicotinamide 10-3 Phenol red 0.0005%# Isoleucine 0.2 Pantothemic acid 10-3 ________________________ possível a análise das necessidades es- Leucine 0.2 (0.1)† Pyridoxal 10-3 pecíficas para o crescimento de células Lysine 0.2 (0.1)† Thiamine 10-3 For studies of cell nutrition animais. Harry Eagle foi o primeiro a Methionine 0.05 Riboflavin 10-4 Dialyzed horse serum, 1%† resolver esse problema, mediante a Phenylalanine 0.1 (0.05)† ____________________ Dialyzed human serum, 5% Threonine 0.2 (0.1)† Salts§ ________________________ realização de uma análise sistemática Tryptophan 0.02 (0.01)† (mM ) For stock cultures dos nutrientes necessários para sus- Tyrosine 0.1 ____________________ Whole horse serum, 5%† tentar o crescimento de células ani- Valine 0.2 (0.1)† NaCl 100 Whole human serum, 10% mais em cultura. KCl 5 NaH2PO4 . H2O 1 Os Experimentos NaHCO3 20 CaCl2 1 Eagle estudou o crescimento de duas li- MgCl2 0.5 nhagens de células estabelecidas: células * Conveniently stored in the refrigerator as a single stock solution containing 20 times the indicated concentration of HeLa e uma linhagem de fibroblasto de each amino acid. † For mouse fibroblast. camundongo chamada de células L. Ele ‡ Conveniently stored as a single stock solution containing 100 or 1000 times the indicated concentration of each vitamin; foi capaz de cultivar essas células em kept frozen. § Conveniently stored in the refrigerator in two stock solutions, one containing NaCl, KCl, NaH2PO4, NaHCO3, and glucose um meio contendo uma mistura de at 10 times the indicated concentration of each, and the second containing CaCl2 and MgCl2 at 20 times the indicated sais, carboidratos, aminoácidos e vita- concentration. || Conveniently stored as a 100mM stock solution; frozen when not in use. minas, suplementado com proteínas de # Conveniently stored as a single stock solution containing 100 times the indicated concentrations of penicillin, streptomycin, soro. Variando sistematicamente os and phenol red. *N. de T. Esta tabela foi mantida em inglês em função de seu valor histórico.
  • 32. A CÉLULA / 33reparar danos resultantes de um corte ou ferimento. A divisão é induzida por umfator de crescimento liberado por plaquetas durante a coagulação sangüínea, es-timulando, desse modo, a proliferação de fibroblastos na região próxima ao teci-do lesado. A identificação de fatores de crescimento específicos tem tornado pos-sível a cultura de uma variedade de células em meio sem soro (meio no qual osoro é substituído por fatores de crescimento específicos necessários para a pro-liferação das células em questão). As primeiras culturas celulares estabelecidas a partir de um tecido são chamadasde culturas primárias (Figura 1.41). As células em uma cultura primária geralmentecrescem até cobrirem a superfície da placa de cultura. Então, elas devem ser removi-das da placa e colocadas em uma nova placa com menor concentração de células paraformar uma cultura secundária. Este processo pode ser repetido muitas vezes, mas amaioria das células normais não pode ser crescida em cultura indefinidamente. Porexemplo, fibroblastos humanos normais geralmente podem ser cultivados por 50 a100 duplicações da população, após o que eles param de crescer e morrem. Emcontraste, células-tronco embrionárias e células deriva-das de tumores com freqüência proliferam indefinida- Tecidomente em cultura e são chamadas de linhagens de célu-las imortalizadas ou permanentes. Além disso, uma va-riedade de linhagens de células imortalizadas de roedo-res tem sido isolada a partir de culturas de fibroblastosnormais. Em vez de morrerem, como a maioria das suascompanheiras, algumas poucas células dessas culturas Um pedaço de tecido écontinuam a proliferar indefinidamente, formando li- dissociado em uma suspensãonhagens celulares como as derivadas de tumores. Essas de células individuais.linhagens de células permanentes têm sido muito úteispara vários tipos de experimentos porque fornecem umafonte contínua e uniforme de células que podem ser As células são colocadasmanipuladas, clonadas e indefinidamente propagadas em uma placa de culturaem laboratório. com meio nutritivo. Mesmo sob condições ótimas, o tempo de divi- Suspensão desão das células animais com maior capacidade de cres- célulascimento é ao redor de 20 horas – dez vezes maior queo tempo de divisão das leveduras. Conseqüentemen- Meio líquidote, experimentos com células animais cultivadas são Culturamais difíceis e mais demorados que os com bactérias primáriae leveduras. Por exemplo, o crescimento de uma co-lônia visível de células animais a partir de uma única As células da cultura primária aderem-secélula demora uma semana ou mais, ao passo que à placa e crescem até cobrirem acolônias de E. coli ou leveduras demoram uma noite superfície da placa de cultura.para crescerem a partir de uma única célula. Contu-do, manipulações genéticas de células de animais emcultura têm sido indispensáveis para a compreensãoda estrutura e função celular.Cultura de Células Vegetais As células podem ser então removidasCélulas vegetais também podem ser cultivadas em meios da placa de cultura e replaqueadas em uma concentração menor para formarcontendo moléculas reguladoras de crescimento adequa- uma cultura secundária.das. Em contraste com os fatores de crescimento poli-peptídicos que regulam a proliferação da maioria dascélulas animais, os reguladores de crescimento das células vegetais são moléculas Culturapequenas que podem passar através da parede da célula vegetal. Quando providos de secundáriamisturas adequadas dessas moléculas reguladoras do crescimento, muitos tipos de célulasvegetais proliferam em cultura, produzindo uma massa de células indiferenciadas, cha-mada de calo (Figura 1.42). Figura 1.41 Cultura de células animais
  • 33. 34 / GEOFFREY M. COOPER • ROBERT E. HAUSMAN É notável que muitas células vegetais sejam capazes de formar qualquer um dos diferentes tipos de células e teci- dos, essencialmente necessários para regenerar uma planta inteira. Conseqüentemente, sob apropriadas manipulações de nutrientes e de moléculas reguladoras de crescimento, células vegetais indiferenciadas em cultura podem ser indu- zidas a formar uma variedade de tecidos da planta, incluí- das raízes, troncos e folhas. Em muitos casos, até uma plan- ta inteira pode ser regenerada a partir de uma única célula em cultura. Além do interesse teórico, a capacidade de pro- duzir uma nova planta a partir de uma única célula que te- nha sido manipulada em cultura torna fácil a introdução de alterações genéticas em plantas, fornecendo importantes pos- sibilidades para a engenharia genética na agricultura.Figura 1.42 Cultura de células vegetais VírusUma massa indiferenciada de células vegetais Vírus são parasitas intracelulares que não podem replicar por si próprios. Eles(um calo) crescendo em um meio sólido. reproduzem-se pela infecção de uma célula hospedeira e pela usurpação da ma-(John N. A. Lott/Biological Photo Service.) quinaria celular para produzir mais partículas virais. Nas formas mais simples, os vírus são compostos somente do ácido nucléico genômico (ou DNA ou RNA) circundado por uma capa protéica (Figura 1.43). Os vírus são importantes na biologia celular e molecular porque fornecem sistemas simples que podem ser usados para investigar as funções das células. Pelo fato de a replicação viral de- pender do metabolismo da célula infectada, estudos dos vírus têm revelado mui- tos aspectos fundamentais da biologia celular. Estudos de vírus que infectam bactérias contribuíram substancialmente para nossa compreensão acerca dos me- canismos básicos da genética molecular, e experimentos com vírus de vegetais (vírus do mosaico do tabaco) foram os primeiros a demonstrarem o potencial genético do RNA. Vírus de animais têm fornecido sondas especialmente úteis para a investigação de várias atividades das células eucarióticas. O crescimento rápido e o genoma de pequeno tamanho tornam as bactérias excelentes alvos para experimentos na biologia molecular, e os vírus bacterianos (bac- teriófagos) simplificam ainda mais o estudo da genética bacteriana. Um dos mais importantes bacteriófagos é o T4, que infecta e replica em E. coli. A infecção com uma única partícula de T4 leva à formação de aproximadamente 200 partículas vi- rais filhas em um período de 20 a 30 minutos. A célula inicialmente infectada rompe (lise), liberando as partículas virais no meio, onde elas podem infectar novas células. (A) (B)Figura 1.43 Estrutura de um vírus deanimal(A) A partícula do papilomavírus contémuma pequena molécula de DNA circular re-coberta por uma capa protéica (o capsídeo).(B) Micrografia eletrônica de partículas depapilomavírus humano. Foi adicionada colo-ração artificial. (B, Linda Stannard/Science 50 nmPhoto Library/Photo Researchers, Inc.) DNA Proteínas do capsídeo
  • 34. A CÉLULA / 35 MEDICINA MOLECULAR Vírus e CâncerA DoençaO câncer é um grupo de doenças ca- de um gene causador de câncer (on- Outros cânceres humanos são cau-racterizado pela proliferação descon- cogene) carregado pelo vírus, e à sados por mutações em genes de célulastrolada de células. O crescimento de descoberta de genes relacionados em normais, a maioria delas ocorrendo du-células animais normais é cuidadosa- células normais de todas as espécies rante a vida do indivíduo, em vez de se-mente regulado para atingir as neces- de vertebrados, inclusive humanos. rem herdadas. Estudos em vírus causa-sidades de um organismo completo. Agora, sabe-se que alguns cânceres dores de câncer têm levado à identifica-Em contraste, as células cancerosas humanos são causados por vírus; ção de muitos dos genes responsáveiscrescem de um modo não-regulado, outros resultam de mutações em ge- por cânceres não-induzidos por vírus eacabando por invadir e interferir nes celulares normais semelhantes à compreensão dos mecanismos mole-com a função de tecidos e órgãos ao primeiro oncogene identificado culares responsáveis pelo desenvolvi-normais. O câncer é a segunda das no RSV. mento de câncer. Os principais esforçoscausas mais comuns de morte (após atuais são direcionados para o uso deas doenças cardíacas) nos Estados Prevenção e Tratamento tais informações sobre a biologia celularUnidos. Aproximadamente um em Os cânceres humanos que são causa- e molecular dos cânceres no desenvolvi-cada três norte-americanos desenvol- dos por vírus incluem o cervical e ou- mento de novos métodos para o seuverá câncer em algum momento de tros cânceres anogenitais (papilomaví- tratamento.sua vida e, apesar dos grandes avanços rus), câncer hepático (vírus das hepa- Realmente, a primeira droga re-no tratamento, aproximadamente um tites B e C) e alguns tipos de linfomas sultante de engenharia genética eficazem cada quatro norte-americanos (vírus de Epstein-Barr e vírus linfo- no tratamento de um câncer humanomorrerá dessa doença. O entendi- trópico das células T humanas). Jun- (a droga STI-571, discutida no capí-mento das causas do câncer e o desen- tos, esses cânceres induzidos por vírus tulo 15) foi desenvolvida contra umvolvimento de métodos mais efetivos representam cerca de 20% da inci- gene muito semelhante ao oncogenepara o seu tratamento representam dência mundial de câncer. Em princí- do RSV.um dos principais objetivos da pes- pio, esses cânceres poderiam ser pre-quisa médica. venidos por vacinação contra os vírus responsáveis, e um considerável avan- ReferênciaBases Celulares e Moleculares ço nessa área foi feito pelo desenvolvi- Rous, P. 1911. A sarcoma of the fowlSabe-se que o câncer resulta de mu- mento de uma vacina eficaz contra o transmissible by an agent separabletações nos genes que normalmente vírus da hepatite B. from the tumor cells. J. Exp. Med.controlam a proliferação celular. Os 13:397-411.principais indícios que levaram àidentificação desses genes surgiramde estudos de vírus que causam cân-cer em animais, o protótipo dosquais foi isolado por Peyton Rousem 1911. Rous descobriu que sarco-mas (cânceres dos tecidos conjunti-vos) em galinhas poderiam sertransmitidos por um vírus, agoraconhecido por vírus do sarcoma deRous, ou RSV. Uma vez que o RSVé um retrovírus com um genoma desomente 10.000 pares de bases, elepode ser alvo de análises molecula-res com muito mais facilidade que ogenoma complexo das galinhas oude células de animais. Finalmente,esses estudos levaram à identificação O tumor transplantável de onde foi isolado o vírus do sarcoma de Rous.
  • 35. 36 / GEOFFREY M. COOPER • ROBERT E. HAUSMAN Em uma cultura de bactérias crescendo em meio com ágar, a replicação do T4 leva à formação de uma área clara de células lisadas (uma placa) na camada de bactérias (Figura 1.44). Justamente pelo fato de as partículas virais infecciosas serem fáceis de cultivar e testar, mutantes virais – por exemplo, vírus que crescerão em uma cepa de E. coli, mas não em outra – são facilmente isolados. Assim, o T4 é manipulado muito mais facilmente que a E. coli para estudos de genética molecular. Além do mais, o genoma do T4 é 20 vezes menor que o da E. coli – aproximadamente 0,2 milhão de pares de bases – facilitando ainda mais as análises genéticas. Outros bacteriófagos têm genomas ainda menores – o mais simples consiste em moléculas de RNA de somente 3.600 nucleotídeos. Por isso, os vírus bacterianos têm fornecido sistemas experimentais extremamente práticos para a genética molecular. São basicamente os estudos desses vírus que têm levado à elucidação de muitos princípios fundamentais da biologia molecular.Figura 1.44 Placas de bacteriófagos Por causa da grande complexidade do genoma das células animais, os vírus têmPlacas de T4 são visíveis na camada de E. sido mais importantes nos estudos das células animais do que nos estudos das bacté-coli. Cada placa surge pela replicação de rias. Muitos vírus de animais replicam-se e podem ser observados pela formação deuma única partícula viral. (E.C.S. Chen/Vi- placas em culturas de células, parecido com o que fazem os bacteriófagos. Além dosuals Unlimited.) mais, os genomas dos vírus de animais são similares em complexidade aos dos vírus bacterianos (variando aproximadamente de 3.000 a 300.000 pares de bases), de modo que os vírus de animais são mais manipuláveis que suas células hospedeiras. Existe muita diversidade nos vírus de animais, cada um contendo ou DNA ou RNA como material genético (Tabela 1.3). A maioria dos vírus com genomas de RNA replica-se mediante síntese de novas cópias do RNA de seus genomas, a partir de moldes de RNA nas células infectadas. Contudo, uma família de vírus de animais – os retrovírus – contém genoma de RNA nas suas partículas virais, mas sintetiza uma cópia de DNA do seu próprio genoma nas células infectadas. Esses vírus fornecem um bom exemplo da importância dos vírus como modelos, porque os estudos dos retrovírus foram os primei- ros a demonstrarem a síntese de DNA a partir de RNA – um modo fundamental de transferir informações genéticas e que agora se sabe ocorrer em todas as células eucarióti- cas. Outros exemplos nos quais os vírus de animais forneceram importantes modelos para investigação de suas células hospedeiras incluem estudos de replicação de DNA, transcri- ção, processamento do RNA e transporte e secreção de proteínas. É particularmente notável que infecções de alguns vírus de animais, em vez de matarem as células hospedeiras, convertem uma célula normal em uma célula cancerosa. Estudos desses vírus carcinogênicos, primeiramente descritos por Peyton Rous em 1911, não somente têm fornecido bases para nossa atual compreensão do câncer no nível da biologia celular e molecular, mas também têm levado à elucidação de muitos mecanismos moleculares que controlam o crescimento e a diferenciação das células animais. TABELA 1.3 Exemplos de Vírus de Animais Tamanho do genoma (mi- Família de vírus Membro representativo lhares de pares de bases) Genoma de RNA Picornavírus Vírus da poliomielite 7-8 Togavírus Vírus da rubéola 12 Flavivírus Vírus da febre amarela 10 Paramixovírus Vírus do sarampo 16-20 Ortomixovírus Vírus da gripe 14 Retrovírus Vírus da imunodeficiência humana 9 Genoma de DNA Hepadnavírus Vírus da hepatite B 3,2 Papovavírus Vírus do papiloma humano 5-8 Adenovírus Adenovírus 36 Herpesvírus Vírus herpes simples 120-200 Poxvírus Vírus da varíola 130-280
  • 36. A CÉLULA / 37 RESUMO PALAVRAS-CHAVEA ORIGEM E A EVOLUÇÃO DAS CÉLULASA Primeira Célula: Todas as células atuais, tanto procarióticas como eucarióti- células procarióticas, células eu-cas, são descendentes de um único antepassado. Supõe-se que a primeira célula carióticas, mundo de RNA, fos-tenha surgido há pelo menos 3,8 bilhões de anos, como resultado da inclusão de folipídeos, anfipática, hidrofóbi-um RNA auto-replicativo em uma membrana de fosfolipídeos. ca, hidrofílicaA Evolução do Metabolismo: As primeiras reações para a geração de energia me- adenosina 5’-trifosfato (ATP),tabólica foram uma forma de glicólise anaeróbica. A fotossíntese então evoluiu, glicólise, fotossíntese, metabolis-seguida pelo metabolismo oxidativo. mo oxidativoProcariotos Atuais: Os procariotos atuais são divididos em dois grupos, as ar- arqueobactérias, eubactérias, cia-queobactérias e as eubactérias, que divergiram cedo na evolução. nobactérias, Escherichia coli (E. coli), parede celular, membrana plasmática, ribossomoCélulas Eucarióticas: As células eucarióticas, que são maiores e mais complexas núcleo, mitocôndria, cloroplasto,que as células procarióticas, contêm um núcleo, organelas citoplasmáticas e um lisossomo, peroxissomo, vacúolo,citoesqueleto. Supõe-se que elas tenham surgido a partir da associação simbióti- retículo endoplasmático, comple-ca de procariotos. xo de Golgi, citoesqueleto, en- dossimbioseO Desenvolvimento dos Organismos Multicelulares: Os eucariotos mais simples levedura, Saccharomyces cerevisi-são organismos unicelulares, como as leveduras e as amebas. Os organismos mul- ae, pseudópodo, célula epitelial,ticelulares evoluíram a partir da associação entre eucariotos unicelulares, e a divi- fibroblasto, eritrócito, granulóci-são das funções levou ao desenvolvimento dos muitos tipos de células especiali- to, monócito, macrófago, linfóci-zadas que formam os animais e vegetais atuais. to, neurônioCÉLULAS COMO MODELOS EXPERIMENTAISE. coli : Em razão da sua simplicidade genética e facilidade de estudo, bactériascomo a E. coli são particularmente úteis para a pesquisa de aspectos fundamen-tais da bioquímica e biologia molecular.Leveduras : Sendo as células eucarióticas mais simples, as leveduras são mo-delos importantes para o estudo de vários aspectos da biologia celular deeucariotos.Dictyostelium discoideum: O eucarionte unicelular Dictyostelium discoideum é Dictyostelium discoideumamplamente usado para análises experimentais do movimento celular.Caenorhabditis elegans: O nematóide Caenorhabditis elegans é um organismo Caenorhabditis elegansmulticelular simples que serve como um modelo importante na biologia do de-senvolvimento.Drosophila melanogaster: Em virtude da extensa análise genética, estudos da Drosophila melanogastermosca-da-fruta Drosophila têm levado a grandes avanços no entendimento dodesenvolvimento animal.Arabidopsis thaliana: A pequena planta com flor Arabidopsis é amplamente usada Arabidopsis thalianacomo modelo para estudos da biologia molecular e do desenvolvimento de plantas.Vertebrados : Muitos tipos de células de vertebrados podem crescer em cultura, Xenopus laevis, “zebrafish”, ca-onde podem ser estudados em condições controladas. Tipos de células especiali- mundongo transgênico
  • 37. 38 / GEOFFREY M. COOPER • ROBERT E. HAUSMAN zadas, como os neurônios e as células musculares, fornecem modelos úteis para investigar aspectos particulares da biologia celular. O sapo Xenopus e o “zebra- fish” são modelos importantes para estudos do desenvolvimento inicial dos ver- tebrados, e o camundongo é uma espécie de mamífero adequada para análises genéticas. FERRAMENTAS DA BIOLOGIA CELULAR resolução, microscopia de campo Microscopia Ótica: Uma variedade de métodos é usada para visualizar as células claro, microscopia de contraste e estruturas subcelulares e para determinar a localização intracelular de molécu- de fase, microscopia de contraste las específicas pelo uso do microscópio ótico. de interferência diferencial, mi- croscopia de contraste de inter- ferência diferencial intensificada por vídeo, microscopia de fluo- rescência, proteína verde fluores- cente (GFP), microscopia confo- cal, microscopia de excitação multifóton microscopia eletrônica de Microscopia Eletrônica: A microscopia eletrônica, com uma resolução que é apro- transmissão, sombreamento ximadamente cem vezes maior que a da microscopia ótica, é usada para análise metálico, criofratura, esboço de detalhes da estrutura celular. por congelamento, microscopia eletrônica de varredura centrifugação diferencial, ultra- Fracionamento Subcelular: As organelas das células eucarióticas podem ser isola- centrífuga, centrifugação em das para análises bioquímicas por centrifugação diferencial. gradiente de densidade, centri- fugação por velocidade, centri- fugação de equilíbrio células-tronco embrionárias, Crescimento de Células Animais em Cultura: A propagação de células animais cultura primária, linhagem de em cultura tem permitido estudos dos mecanismos que controlam o crescimento células imortalizadas e a diferenciação celular. Cultura de Células Vegetais: Células vegetais em cultura podem diferenciar-se calo para formar células especializadas e, em alguns casos, podem regenerar plantas inteiras. bacteriófago, retrovírus Vírus: Os vírus fornecem um modelo simples para estudos da função celular.Perguntas1. Quais são as características fundamen- 4. Por que se pensa que a evolução da 6. Discuta as evidências de que as mito-tais que todas as células vivas comparti- fotossíntese tenha favorecido a evolu- côndrias e os cloroplastos se originaramlham na terra? Cite pelo menos três. ção subseqüente do metabolismo oxi- de bactérias que foram incorporadas dativo? pelo precursor das células eucarióticas.2. O que os experimentos de StanleyMiller mostraram sobre a formação de 5. Por que a formação de uma mem- 7. Que resolução pode ser obtida commoléculas orgânicas? brana plasmática semipermeável ao re- um microscópio óptico, se a amostra for dor de um grupo de macromoléculas visualizada através de ar, em vez de através3. Que tipo de macromolécula é capaz que se auto-replicam foi um passo tão de óleo? Considere que o comprimentode controlar sua auto-replicação? importante na origem da vida? de onda da luz visível é de 0,5 µm.
  • 38. A CÉLULA / 398. Que vantagem o uso da proteína permitem a separação, em um gradien- apropriado para a análise dos movimen-verde fluorescente (GFP) tem sobre o te de sacarose, pela centrifugação por tos de células animais?uso de anticorpos marcados com fluo- velocidade e pela centrifugação de equi-rescência, no estudo da localização e líbrio. 11. Por que a capacidade de cultivar célu-do movimento de uma proteína nas las-tronco embrionárias é importante?células? 10. As leveduras têm sido usadas como um modelo para o estudo de muitos 12. Qual a diferença entre culturas ce-9. Identifique as diferentes característi- aspectos da biologia das células eucarió- lulares primárias e linhagem de célulascas das propriedades das organelas que ticas. Por que elas não são um modelo imortalizadas?Referências e Leituras Adicionais Earth before 3,800 million years ago. Na- Neidhardt, F. C., R. Curtiss III., J. L. In- ture 384:55-59. [P] graham, E. C. C. Lin, K. B. Low Jr., B. Orgel, L. E. 1998. 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