Isolasi bakteri pada sampel urin Inokulasi dan identifikasi

1. PRAKTIKUM BAKTERIOLOGI
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI
DARI SPESIMEN URIN

2. HARI 1
“Isolasi bakteri dari sampel urin pada
media BAP, MC, dan BHI”

Hari, tanggal :
 Tujuan
:
Senin, 26 November 2012
Mengetahui ciri bakteri yang
tumbuh pada media BAP dan
MC

3. Ose
loop
Spiritus
Inkubator
Mikro pipet+tip
Korek api

4. Pipet ukur
Centrifuge
Objek glass
Bola hisap
Cover glass
Mikroskop

5. Bahan :

Blood Agar Plate (BAP)
Manitol Salt Agar (MSA)

6. Pengenceran Urin
 Dipipet NaCl 0,85% sebanyak 9,8 ml dan urin
sebanyak 0,2 ml (200 mikron)
 Dimasukkan ke dlm tabung reaksi,
dihomogenkan

7. Panaskan ose loop hingga berpijar, lalu dinginkan
Diambil koloni dr sampel urin yg telah diencerkan,
kmd ditanam pada media BAP dan MC
Digoreskan dgn goresan
Radian ( Seperti Papan
catur)
Diinkubasi pd suhu
37o C selama 24 jam

8. Dipanaskan ose hingga berpijar, di dinginkan
Ambil 1 ose urin, masukkan ke dalam media BHI
secara aseptik
Inkubasi pada suhu 37o C
selama 24 jam

9. Urin di Centifuge dgn kec 3500 rpm selama 5 menit
Buang supernatan dgn membalikkan tabung scr cepat
Kocok endapan, lalu ambil
2 tetes letakkan pd objek
glass, tutup dgn cover
glass
Amati Sel Leukosit pd perbesaran 10x

10. Pemeriksaan leukosit
 0-1 sel/LPB

11. HARI 2
“Isolasi bakteri”

Hari, tanggal :
 Tujuan
:
Selasa, 27 November 2012
Mendapatkan biakkan bakteri
dari sampel urin yang telah
ditanam pada media BHI

12. Ose
loop
Spiritus
Inkubator
Mikro pipet+tip
Korek api

13. Bahan :

Blood Agar Plate (BAP)
Manitol Salt Agar (MSA)
Kultur bakteri pd
media BHI

14. Dipipet bakteri dari BHI sebanyak 50 mikron ke media BAP dan MC
Dibuat goresan radian dengan ose
loop (seperti papan catur)
Diinkubasi pd suhu 37o C selama 24 jam

15. Pada media BAP :
 Koloni Bakteri berwarna
putih abu-abu
Pada media MC
 Koloni berwarna kuning,
media juga berwarna
kuning

16. HARI 3
“Identifikasi bakteri”

Hari, tanggal :
 Tujuan
:
Rabu, 28 November 2012
Mengidentifikasi bakteri

17. Ose
loop
Spiritus
Inkubator
Ose
Jarum
Pipet tetes
Korek api

18. Objek glass
Mikroskop

19. Media :

Gula-gula
(Glukosa, laktosa, Manitol, Maltosa, Sukrosa)

Malonate broth

Nitrat broth

MRVP

Glukosa oF Parafin & non Parafin

SIM

PAA

TSIA

Simmon citrate

Urea agar

20. 



Gentien violet
Lugol
Alkohol absolut
Safranin

21. 1.
2.
Diamati pertumbuhan bakteri pd media BAP &
MC
Dilakukan pewarnaan gram

22. 3.
Dilakukan penanaman pd media Identifikasi
Sterilkan ose, kmd dinginkan
Diambil koloni dgn ose tsb
Ditanam koloni bakteri ke dlm media
u/ Media cair (Gula-gula,
MRVP, Nitrat broth, Malonate,
Glukosa oF), ose yg telah
terisi koloni bakteri
dimasukkan ke dlm tabung &
di goyangkan

23. U/ media padat tabung miring (Simon citrate, Urea,
TSIA), ose yang telah tersi koloni bakteri digoreskan zigzag dr bagian pangkal ke bawah. Dan untuk media TSIA
jg dilakukan penusukkan use pd bagian tengah hingga
dasar
U/ media semi solid (SIM), ose yg telah terisi koloni
bakteri ditusukkan dr permukaan media hingga bagian
tengah (tdk sampai dasar)
Disterilkan kembali ose,
Diinkubasi pada suhu 37o C selama 24 jam

24. 
Pewarnaan gram
Ditemukan bakteri berwarna merah,
berbentuk basil

25. HARI 4
“Test Biokimia”

Hari, tanggal :
 Tujuan
:
Kamis, 29 November 2012
Mengetahui respon bakteri
yang tumbuh terhadap testtest biokimia

26. 
Pipet Tetes

27. 
Nitrit I dan Nitrit II

KOH 40%

α- naftol 5%

Metil red

FeCl2

Kovac

28. Diamati perubahan pada media Gula-gula, Malonate, Urea,
Simon citrate, TSIA, dan Glokosa oF, tanpa penambahan
reagen tertentu
Lakukan tes-tes biokimia dengan menambahkan reagenreagen tertentu ke dldalam media sbb:
Media MR +
reagen Metil
red 3 tetes
Media PAA +
reagen FeCl2 3
tetes
Media VP + reagen αnaftol 5% dan KOH 40%,
masing-masing setengah
volume media
Media SIM + reagen
kovac 3 tetes
Media Nitrat broth +
reagen Nitrit I dan Nitrit II,
dgn perbandingan 1:1

29. 




Glukosa
Terjadi perubahan warna
menjadi kuning
Laktosa
Terjadi perubahan warna
menjadi kuning
Manitol
Terjadi perubahan warna
menjadi kuning
Maltosa
Terjadi perubahan warna
menjadi kuning
Sukrosa
Terjadi perubahan warna
menjadi kuning

30. 


Malonate broth
Positif (+)
Terjadi perubahan warna
menjadi biru
Nitrat broth
Positif (+)
Terjadi perubahan warna
manjadi
Simmon Citrate
Positif (+)
Terjadi perubahan warna biru

31. TSIA
 H2S
:
Tidak
terdapat warna hitam
pada
tusukkan
 Lereng/dasar
:
Kuning/kuning  Reaksi
asam
 Gas
:
Pada
dasar media pecah dan
terangkat

32. 
PAA
Negatif (-)
Tidak terjadi
perubahan warna

Urea
Negatif (-)
Tidak tejadi
perubahan warna

33. SIM

Sulfur
Negatif (-)
Tidak terdapat warna hiam pada
tusukan

Indol
Negatif (-)
Tidak terjadi perubahan warna pada
reagen

motil
Positif (+)
Terdapat kekeruhan menyebar di
sekitar tusukan

34. Glukosa OF

Parafin
Positif (+)
Terjadi perubahan warna
menjadi kuning

Non parafin
Positif (+)
Terjadi perubahan warna
kuning

35. 
MR
Negatif (-)
Tidak terjadi
perubahan warna

VP
Positif (+)
Terbentuk cincin
merah

36. Dari praktikum yang telah dilakukan dapat
disimpulkan bahwa bakteri yang terdapat
dalam sampel urin ini adalah Enterobacter sp

37. PRAKTIKUM BAKTERIOLOGI
TES SENSITIVITAS BAKTERI

38. HARI 1
“TES SENSITIVITAS BAKTERI”
• Hari/tanggal : Senin/03 Desember 2012
• Tujuan
: Untuk mengetahui
kemampuan suatu
antibiotik dalam
menghambat
pertumbuhan bakteri.
• Metode
: Diffusion Test (Kirby Bauer)

39. Alat :
Ose
loop
Spiritus
Inkubator
Mikro pipet+tip
Korek api

40. Pipet ukur
Bola hisap
Lidi kapas steril
Pinset

41. Bahan :
Mueller Hinton Agar
Koloni pada media MC

42. • Disc obat
: 1. Nitrofurantoin
2. Norfloxacin
3. Ceftriaxone
4. Ampycilin
5. Polymycin

43. » Reagen : a. Asam sulfat (H2SO4 )
b. Barium klorida (BaCI2)
c. Natrium klorida (NaCl)

44. SKEMA CARA KERJA
Pembuatan standard Mac Farland (5 ml H2SO4 + 25 μl BaCI2 )
Pembuatan Suspensi Bakteri yang kekeruhannya sama dengan
standard Mac Farland yang dibuat
Penanaman bakteri pada media Mueller Hinton
Penempelan Disc Obat kemudian inkubasi suhu 35 ̊c selama
16-18 jam.

45. • Cara kerja
:
A. Pembuatan standar Mac Farland
1. pipet 5 ml H2SO4 ke dalam tabung
reaksi.
2. pipet lagi 25 mikroliter BaCI2 dan
dimasukkan ke dalam tabung
reaksi tersebut.
3. homogenkan

46. B. Pembuatan suspensi bakteri
1. pijarkan ose pada lampu spiritus,
lalu dinginkan kembali.
2. koloni bakteri pada media MC
diambil menggunakan ose tersebut
dan dimasukkan dalam tebung
reaksi yang berisi NaCl 0,95%.
3. homogenkan dengan ose.

47. C. Perbandingan dengan standar Mac Farland
1. larutan suspensi bakteri tadi
dibandingkan dengan standard Mac
Farland yang telah di buat.
2. perbandingan kekeruhan antara 2
larutan tersebut di amati dan hasil
kekeruhan harus disamakan.

48. D. Penanaman pada media Mueller Hinton
1. Dicelupkan lidi kapas sterilke dalam suspensi
bakteri yang sudah di standarisasi,
didiamkan beberapa saat agar cairan dapat
meresap ke dalam kapas.
2. Selanjutnya lidi kapas itu digoreskan pada
permukaan media Mueller Hinton dengan
pola zig zag, seluruh permukaan media
harus penuh.
3. Setelah selesai media MH didiamkan
selama 5-15 menit supaya suspensi
bakteri meresap ke dalam agar.

49. E. Penempelan Disc Obat
1. dengan menggunakan pinset, disc
obat satu per satu diletakkan pada
permukaan media MH, jarak antara
masing-masing disc tidak kurang
dari 15 mm.
2. di inkubasi pada suhu 35 ̊c selama
16-18 jam.

50. HARI KEDUA
“Pengamatan Hasil Test Sensitivitas”
• Hari /bahan
• Tujuan
• Alat
• Bahan
: Selasa/ 04 Desember 2012
: mengamati dan mengukur
zona bening yang terbentuk
sebagai hasil dari tes
sensitivitas.
: penggaris
: media MH yang berisi disc
obat yang telah di inkubasi

51. Alat
Penggaris

52. Bahan

53. Cara Kerja
Dengan latar belakang gelap, dilakukan pengamatan terhadap zona bening yang
terbentuk disekitar disc obat yang ditanam
Diameter zona bening yang terbentuk di ukur dengan menggunakan penggaris
dan di catat hasilnya.
Hasil pengukuran di bandingkan dengan quality kontrol intuk memperoleh
kepastiannya (resisten, intermediet, atau sensitif).

54. • Quality control :
Nama
antibiotik
Diameter Zona Bening (mm)
Potency
Disc
Resisten
Intermediate
Sensitive
1
Nitrofurantoin (F)
300 μg
≤ 14
15-16
≥ 17
2
Norfloxacin (NOR)
10 μg
≤ 12
13-16
≥ 17
3
Polymycin B (PB)
300 unit
-
-
>11
4
Ampicilin (AMP)
• Gram negatif,
Staphylococcus
• Hemophilus,
influenza
≤ 11
12-13
≥ 14
≤ 19
-
≥ 20
10 μg

55. Hasil
•
•
•
•
•
Nitrofurantoin= 20 mm= sensitive
Polymyxin-B = 13 mm= sensitive
Ampycilin
= 0 mm = resistent
Norfloxacin = 17 mm= sensitive
Ceftriaxone = 0 mm = resistent

56. Kesimpulan
Dari praktikum yang telah di lakukan dapat
disimpulkan bahwa dari 5 disc obat yang
ditempelkan, 3 diantaranya bersifat sensitive
yaitu Nitrofurantoin, Norfloxacin dan PolynyxinB. Sedangkan Ampycilin dan Ceftriaxone bersifat
resistent

57. Sekian dan
terima kasih