Clase 6 cromatina y cromosomas

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Clase 6 cromatina y cromosomas

  1. 1. CROMATINA Estructura y funci ó n
  2. 2. Cromatina: estructura y funci ó n <ul><li>Primera clase </li></ul><ul><li>&quot; Cromosomas &quot; virales, bacterianos y eucariotas </li></ul><ul><li>Cromatina : </li></ul><ul><li> Niveles de compactado: </li></ul><ul><li>Nucleosoma, </li></ul><ul><li>Fibras, Cromosomas en interfase y mitosis </li></ul><ul><li>Segunda clase </li></ul><ul><li>Procesos celulares en el contexto de la cromatina : </li></ul><ul><li>Replicaci ón </li></ul><ul><li>Regulaci ó n de la expresi ón génica </li></ul>
  3. 3. En eucariotas, procariotas y virus: ADN asociado a prote í nas * EL ADN CABE DENTRO DE LA CÉLULA * ADN PROTEGIDO DE LESIONES; MÁS ESTABLE Organismo Dimensiones ARN/ADN Longitud VTM 0.008x 0.3 µm ARN (simple) 2µm=6.4kb Fago T4 0.065x0.1 µm ADN (doble) 55 µm=170 kb E. coli 1.7x0.65 µm 1 ADN doble 1.3 mm = 4.2 x10 3 kb H. sapiens (nucleo) 6µm diam. 46 cromosomas ADN doble 1.8 m = 6 x10 6 kb * ADN ORGANIZADO CONTROL DE LAS DIFERENTES FUNCIONES CELULARES (expresi ó n génica, replicaci ó n, recombinaci ó n, separaci ó n de cromosomas en la divisi ó n celular,...)
  4. 4. ADN de ØX174 Cromosomas eucarióticos en mitosis Bacteria lisada – ADN “compacto” EUCARIOTAS, PROCARIOTAS, VIRUS – ADN CONDENSADO POR ASOCIACIÓN CON PROTEÍNAS
  5. 5. EN VIRUS: ADN o ARN condensado dentro de las partículas virales por interacciones inespecíficas con proteínas de la cápside VMT: ARN en hélice dentro de la cápside
  6. 6. CROMOSOMA PROCARI Ó TICO Lisis: fibras en forma de bucles unidas a la envoltura rota de la célula LISIS E.coli <ul><li>Cromosomas circulares </li></ul><ul><li>Cromosomas lineales </li></ul><ul><li>Ambos (ej. Agrobacterium tumefaciens ) </li></ul>
  7. 7. CROMOSOMA PROCARI Ó TICO HLP1. <ul><li>Dominios en bucles de 40 kb aprox. de ADN superenrrollado; asociado a proteínas básicas </li></ul><ul><li>No se sabe c ó mo se mantienen unidos en su base </li></ul><ul><li>Cada dominio es independiente de los otros </li></ul>
  8. 8. PROTEÍNAS BÁSICAS DETECTADAS EN BACTERIAS Proteína Composición Contenido por células Semejanza con eucariontes HU Dímero subunidades a y b de 9.000 d. 40.000 dímeros Histona H2A H Dímero subunidades idénticas de 28.000 d. 30.000 dímero Histona H2B IHF Subunidad a de 10.500 d. Subunidad b de 9.500 d. Desconocido Desconocida H1 Subunidad de 15.000 d. 10.000 copias Desconocida HLP1 Monómero de 15.000 d. 20.000 copias Desconocida P Sububnidad de 3.000 d. Desconocido Protaminas
  9. 9. CROMOSOMA EUCARI Ó TICO - CROMATINA DIFERENTES NIVELES DE COMPACTADO 6 veces compactado 40 veces compactado > 1000 veces compactado > 10000 veces compactado
  10. 10. CROMATINA - NUCLEOSOMAS FIBRA DE 30 nm FIBRA DE 10 nm « collar de perlas » Suspension de nucleos a baja fuerza ionica: lisis y l iberación de fibras de cromatina de 30 nm Nucleasa microcóccica fuerza iónica
  11. 11. 205 405 805 605 Digestión suave con nucleasa microcóccica: se obtienen múltiplos de una determinada unidad de longitud: Repetición nucleosomal
  12. 12. <ul><li>Tratamiento más drástico con nucleasa </li></ul><ul><li>microc ó ccica: </li></ul><ul><li>Se liberan mononucleosomas </li></ul><ul><li>Se liberan nucleosomas recortados </li></ul><ul><li>Se liberan cores de histonas </li></ul>
  13. 13. <ul><li>PARTÍCULA NUCLEOSÓMICA CENTRAL </li></ul><ul><li>146 pb de ADN enrollados alrededor de la PARTÍCULA NUCLEOSÓMICA CENTRAL o CORE de histonas (2 vueltas) </li></ul><ul><li>Tetrámero de H3 y H4 </li></ul><ul><li>2 dímeros de H2A y H2B </li></ul>OCTÁMERO 6 nm
  14. 14. <ul><li>NUCLEOSOMA </li></ul><ul><li>146 pb ADN enrollados en el core </li></ul><ul><li>ADN ligador de largo variable </li></ul><ul><li>Histona H1 </li></ul>EN PROMEDIO Especie Repetición nucleosomal Longitud del ligador S. cerevisiae 160-165 13-18 Erizo de mar (espermatozoide) 260 110 D. melanogaster 180 33 Humano 185-200 38-53
  15. 15. EN LA CROMATINA HAY OTRAS PROTEINAS: HMGs, protaminas, y todas las enzimas necesarias para la duplicación, transcripción, etc. del ADN.
  16. 16. <ul><li>HISTONAS DEL CENTRALES o del CORE </li></ul><ul><li>- Proteínas pequeñas (11- 15 Kda) </li></ul><ul><li>Muy conservadas - RELEVANCIA </li></ul><ul><li>Alta carga + (ricas en Lys y Arg) </li></ul><ul><li>- Dominio “pliegue histónico” - 3 hélices-  separadas por asas cortas no estructuradas </li></ul><ul><li>- Colas N-terminales ¡¡IMPORTANTES!! </li></ul>
  17. 17. Histona Nº residuos Pm Contenido en moles % de Modificación Lys  Arg H1 213 21.000 27,7 1,4 Fosforilación H2A 129 13.900 10,9 9,3 Fosforilación, acetilación H2B 125 13.774 15,2 6,1 Fosforilación, acetilación H3 135 15.273 9,6 13,3 Acetilación, metilación fosforilación H4 102 11.236 10,8 13,7 Acetilación, metilación fosforilación
  18. 18. <ul><li>Se forman heterodímeros H3-H4 </li></ul><ul><li>Se forma tetr á mero H3 - H4 </li></ul><ul><li>Uni ó n al ADN </li></ul><ul><li>Dos d í meros H2A-H2B son reclutados </li></ul>¿ C ó mo se arma un nucleosoma?: Las histonas se asocian de manera ORDENADA para formar un nucleosoma
  19. 19. <ul><li>Tetrámero se une a 60 pb centrales de los 146 </li></ul><ul><li>Dímeros H2A-H2B a 30 pb a cada lado de esos 60 pb </li></ul><ul><li>Hélice N-ter de cada H3 contactan 13 pb en cada extremo del ADN </li></ul>ESTRUCTURA ATÓMICA DEL NUCLEOSOMA A ALTA RESOLUCIÓN EJE DIÁDICO
  20. 20. INTERACCIONES ADN-histonas <ul><li>14 sitios de contacto diferentes, uno por cada vez que el surco menor del ADN está frente al octámero de histonas </li></ul><ul><li>142 puentes de hidrógeno (entre a.a. y O del enlace fosfodiéster cerca del surco menor) </li></ul><ul><li>enlaces por cargas + de histonas y – del ADN </li></ul><ul><li>(INTERACCIONES INESPECÍFICAS) </li></ul>
  21. 21. Colas N-terminales de histonas del core dirigen el enroscado del ADN en sentido levógiro :
  22. 22. ¿ C ó mo se disponen los nucleosomas en la fibra de 10 nm? <ul><li>2 factores favorecen la ubicación de un nucleosoma: </li></ul><ul><li>Facilidad para que se curve la doble hélice: secuencias ricas en AT en surco menor </li></ul><ul><li>Presencia de proteínas no histonas unidas al ADN con gran afinidad </li></ul>- Longitud variable en el genoma - Posicionamiento dinámico
  23. 23. Fibra de 30 nm: Una vez que se forman los nucleosomas, la fibra de 10 nm se condensa en el siguiente nivel de compactado
  24. 24. 2 modelos para la fibra de 30 nm: SOLENOIDE ZIGZAG ADN ligador ADN ligador INTERVIENEN: - H1 - Colas N-terminales de las histonas del core
  25. 25. Histona H1 o ligadora <ul><li>Prote í na pequeña; un poco más grande que las del core </li></ul><ul><li>Secuencia menos conservada </li></ul><ul><li>Estructura típica </li></ul>¿ Dónde se ubica en el nucleosoma? Modelos: Protección de 20 pb adicionales de ADN de digestión con nucleasa microcóccica
  26. 26. Al aumentar la concentraci ón salina en presencia de histona H1 se forma una fibra de 30 nm:
  27. 27. Las colas N-terminales de las histonas intervienen en la formaci ó n de la fibra de 30 nm Recordar : Las colas de las histonas son blanco de modificaciones post-traduccionales
  28. 28. Compactado en la fibra de 30 nm, un cromosoma humano aún mediría 0.1 cm = 10 veces más grande que el núcleo celular!! Niveles de mayor compactado (?) que varían en el ciclo celular en respuesta a señales del ciclo celular Cromatina saliendo de un núcleo lisado en interfase Cromosoma mitótico
  29. 29. CROMATINA EN INTERFASE * La cromatina es una estructura fluida y dinámica en la que se deben &quot; exponer &quot; las secuencias de ADN para que se den los diferentes procesos celulares. * Estructura de cromosomas en interfase: cromosomas plumosos, cromosomas politénicos * 2 «formas» de cromatina en interfase: EUCROMATINA y HETEROCROMATINA
  30. 30. CROMOSOMAS “ESPECIALES” EN INTERFASE CROMOSOMAS PLUMOSOS («lampbrush») Cromosomas apareados en premeiosis en oocitos inmaduros de anfibios – CROMOSOMAS GIGANTES BUCLES: genes que se expresan EJE: cromatina condensada (ANDAMIAJE CROMOSÓMICO)
  31. 31. CROMOSOMAS POLITENICOS Cromosomas de larvas de insectos; múltiples ciclos de síntesis de ADN sin división celular Los cromosomas homólogos se mantienen unidos, paralelos D. melanogaster <ul><li>5000 bandas e interbandas </li></ul><ul><li>3 a 30 kb = 0.005 a 0.0005 µm </li></ul><ul><li>- Interbandas: 5 % genoma </li></ul><ul><li>Bandas: > condensaci ón cromatina y/o > contenido de proteínas </li></ul><ul><li>Patr ón reconocible </li></ul><ul><li>Genes en interbandas se expresan más </li></ul>BANDA INTERBANDA
  32. 32. CROMOSOMAS POLITENICOS MAS ADELANTE VEREMOS LOS MECANISMOS IMPLICADOS EN ESTA «APERTURA» DE LA CROMATINA Tiempo ECDISONA CAMBIOS EN LA EXPRESION GENICA APARICIÓN DE «PUFFS»: la cromatina se descomprime y hay transcripci ó n
  33. 33. ANILLOS DE BALBIANI (Chironomus tentans):
  34. 34. LO QUE OCURRE EN CROMOSOMAS PLUMOSOS Y POLITENICOS EN CUANTO A PODRIA SER LO QUE OCURRE EN TODOS LOS CROMOSOMAS EN INTERFASE
  35. 35. EUCROMATINA Y HETEROCROMATINA En la cromatina se distinguen zonas más y menos densas
  36. 36. <ul><li>EUCROMATINA </li></ul><ul><li>Estructura menos condensada, compuesta mayormente de fibra de 30 nm </li></ul><ul><li>HETEROCROMATINA </li></ul><ul><li>Forma altamente condensada </li></ul><ul><li>Incluye proteínas adicionales </li></ul><ul><li>Genes no expresados (silenciados) en la mayoría de los casos; repetidos (tandems) de secuencias cortas </li></ul><ul><li>Mantenimiento de telómeros y centrómeros de cromosomas </li></ul>
  37. 37. TELÓMERO -Secuencias cortas repetidas Ej. 5´TTAGGG 3’ (humano) - Gran parte monocatenario (3’) formando una estructura especial, resistente a nucleasas
  38. 38. Estructura especial de la cromatina: - Desacetilada - Asociada a proteínas especiales
  39. 39. <ul><li>CENTRÓMERO </li></ul><ul><li>- Resistencia en la mitosis; unión a huso durante la mitosis a través del cinetocoro </li></ul><ul><li>- Diferente largo en los diferentes organismos </li></ul><ul><li>Ej. levadura: 125 pb </li></ul><ul><ul><li>humano: varios miles de Kb </li></ul></ul><ul><ul><li>- Secuencias repetidas no características- satélites  </li></ul></ul><ul><li>Histonas desacetiladas, metiladas </li></ul><ul><li>Histonas especiales ej CENP-A, variante de H3 </li></ul><ul><li>(N-terminal con extensión; unión a cinetocoro?) </li></ul><ul><li>-Docenas de proteínas asociadas </li></ul>
  40. 41. CROMOSOMAS EN MITOSIS - Nivel máximo de compactado; los cromosomas se observan como cuerpos bien definidos - Asociados a diferentes complejos de proteínas. si se extraen las histonas, se observa en microscopio electrónico bucles de ADN unidos a un andamiaje nuclear (40-90 kb = 10-30 nm)
  41. 42. Proteínas de andamiaje nuclear: - topoisomerasa II en base de los lazos : control en replicacion y transcripción? - SMCs “Structural maintenance of chromosomes” SMCs - COHESINAS - CONDENSINAS (+ ATP : formación de bucles) Formación de complejos en forma de anillos
  42. 43. ORGANIZACIÓN DE LOS CROMOSOMAS: BANDEADO DE PROTEÍNAS G Bandas G: bajo contenido de GC Bandas R: alto contenido de GC –genes + transcriptos Organización mantenida en la evolución:: IMPORTANTE
  43. 44. La cromatina es una estructura din á mica :porciones de ésta se descompactan para que tengan lugar los distintos procesos celulares - Replicaci ón - Regulaci ó n de la expresi ón génica
  44. 45. REPLICACIÓN En el sitio de replicación la fibra de 30 nm se desorganiza. Inmediatamente después de la replicación el ADN se asocia a nucleosomas.
  45. 46. <ul><li>Nuevos nucleosomas : 2 posibilidades </li></ul><ul><li>los nucleosomas viejos se desarman y sus histonas + nuevas histonas forman nuevos nucleosomas </li></ul><ul><li>Los cores “viejos” se mantienen </li></ul><ul><li>Experimento: Sobrecruzamiento de histonas </li></ul><ul><li>Células crecen en presencia de a. a. PESADOS </li></ul><ul><li>Replicación en presencia de a.a. livianos:: histonas nuevas son livianas </li></ul><ul><li>Se forman octámeros </li></ul><ul><li>Purificación de nucleosomas y fraccionamiento en gradiente de densidad </li></ul>
  46. 47. nucleosoma parental histonas sintetizadas de novo (livianas) A) Se conservan los octámeros B) Se forman octámeros nuevos (mezcla de histonas) A) dos densidades B) gradiente de densidades B) parece ser la correcta
  47. 48. In vivo el ensamblaje de los nucleosomas no es un proceso espont á neo. Se requieren chaperonas histónicas (ej. CAF-I, RCAF)
  48. 49. POSICIONAMIENTO DE NUCLEOSOMAS: A veces es un estorbo, a veces una ventaja: depende de dónde queden los sitios de unión de factores transcripcionales Si quedan escondidos, la cromatina deberá ser modificada para que los factores de transcripción puedan actuar. CROMATINA Y TRANSCRIPCIÓN
  49. 50. POSICIONAMIENTO DE LOS NUCLEOSOMAS POSICIONAMIENTO EXTRÍNSECO: El primer nucleosoma se posiciona en un determinado lugar, por secuencia o por proteína unida al ADN. El resto determinado por el primero 200 pb
  50. 51. PROMOTORES “PREPOSICIONADOS” - Sitios de unión de factores de transcripci ó n expuestos sobre el nucleosoma o en ADN ligador - Genes constitutivos suelen ser de este tipo Ej.: Promotor del gen hsp26 de D. melanogaster (respuesta al shock térmico) GAGA GAGA HSE HSE TATA pol II pol II (A) (B) HSTF TFIID transcripción interacción
  51. 52. <ul><li>Modificaciones de la estructura de la cromatina asociados a transcripción se han observado in vitro e in vivo </li></ul><ul><li>Esas modificaciones, ¿son necesarias para la transcripción o son consecuencia de la misma? </li></ul><ul><li>Se ha demostrado que en algunos promotores el “remodelado” de la cromatina puede tener lugar aún en ausencia de transcripción </li></ul>¿Qué pasa si los sitios de unión de factores de transcripción en un promotor NO están accesibles?
  52. 53. EJEMPLO: Promotor de PHO5 de S. cerevisiae TATA PHO2 PHO4 carencia de fosfato TATA PHO2 PHO2 pol II TBP -1 -2 a b transcripción
  53. 54. PERO.... ¿Cómo se remodela la cromatina? <ul><li>COMPLEJOS REMODELADORES DE LA CROMATINA ATP-dependientes </li></ul><ul><li>MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES DE LAS HISTONAS </li></ul>
  54. 55. A) TATA TATA TBP SWI/SNF SWI/SNF TATA transcripción TBP TATA TBP SWI/SNF TATA SWI/SNF B) TBP transcripción Swi-Snf
  55. 56. MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES DE LAS HISTONAS DEL CORE <ul><li>Lisinas y Serinas de histonas del core sufren acetilación, metilación, fosforilación, ubiquitinación.... </li></ul><ul><li>- Mutaciones causan alteraciones de la expresión: </li></ul><ul><li>Ej. H4: *dominio R (aa 17 a 29) : implicado en represión </li></ul><ul><li>*dominio A (aa 1 a 16) : implicado en activación </li></ul><ul><li>Modo de acción: </li></ul><ul><ul><li>1) modificación de la interacción con ADN (carga) </li></ul></ul><ul><ul><li>2) Lugares de unión para proteínas </li></ul></ul>
  56. 57. “ Código de histonas”
  57. 58. SWI/SNF
  58. 59. DESACETILACIÓN DE HISTONAS <ul><li>Grandes complejos proteicos </li></ul><ul><li>Reclutados a determinados promotores por represores específicos </li></ul>1) Ume6 se una a promotor; interacción con Sin3 2) Sin3 es parte de complejo con RPD3 (HDAC)
  59. 60. COMPLEJOS DE ACCIÓN REPRESIVA - SILENCIAMIENTO Complejos de proteínas que establecen estructuras muy organizadas de la cromatina (de tipo de heterocromatina) Ej. telómeros de S. cerevisiae <ul><li>Rap1 se une a telómeros </li></ul><ul><li>Rap1 recluta Sir s </li></ul><ul><li>Interacción con histonas hipoacetiladas </li></ul><ul><li>Sir s se agregan </li></ul>
  60. 61. <ul><li>Las figuras de esta presentación han sido extraídas de: </li></ul><ul><li>- Lewin, B. 2004. Genes VIII. Pearson Prentice-Hall. </li></ul><ul><li>Watson, J.D. et al. 2004. Molecular Biology of the Gene. 5ª ed. Pearson Benjamin-Cummings. </li></ul><ul><li>Lodish, H. et al. 1999. Molecular Cell Biology. 4a ed. W.H. Freeman & Co. </li></ul><ul><li>Alberts, B. et. al. 2002. Molecular Biology of the Cell. 4a ed. Garland Publishers </li></ul><ul><li>Travers, A. (1999) “The location of linker histone in the nucleosome”; </li></ul><ul><li>TIBS 24: 4. </li></ul><ul><li>Thoma, F.; Koller. T.H. and Klug A. (1979) “Involvement of the histone H1 in the organization of the nucleosome and of the salt-dependent superstructures of chromatin”. </li></ul><ul><li>J. Cell. Biol. 83; 403 </li></ul>

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