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Introducción a la Histología

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    Introducción a la Histología Introducción a la Histología Presentation Transcript

    • Prof. MSc. José Antonio Romero Palmera Bárbula, Febrero 2009
      • Histología:
            • Concepto y aplicaciones científicas y clínicas.
      • Técnica histológica:
      • Etapas en la preparación de tejidos para su estudio al microscopio óptico y electrónico.
      • Histoquímica y Citoquímica:
      • Aplicación, tipos, fundamentos químicos de la coloración.
      • Microscopía:
      • Tipos de microscopios y aplicación. Microscopio óptico: partes, funcionamiento. Microscopio electrónico: de transmisión y de barrido.
      O bjetivo G eneral: Especificar las herramientas que utiliza la histología para el estudio ultraestructural de tejidos y de la célula como unidad morfológica y funcional del organismo. C ontenido
    • Aplicaciones científicas y clínicas Ciencia que estudia los tejidos orgánicos: su estructura microscópica, su desarrollo y sus funciones Del griego Histo Tejido Logos Tratado
    • Serie de pasos que han de darse para obtener un preparado observable con el microscopio óptico Mediato (post mortem ) Inmediato (in vivo) Métodos de examen
      • Toma de muestra
      • Fijación
      • Deshidratación
      • Preparación para la inclusión
      • Inclusión
      • Modelado del bloque – catalogación
      • Sección con el micrótomo extendido de los cortes – pegado
      • Coloraciones: de rutina o especiales
      • Las glándulas exocrinas y endocrinas lo más rápidamente posible.
      • El páncreas y el riñón deben extraerse no más de 10 a 15 min.
      • Otros órganos tales como intestino delgado y/o grueso, estómago, hígado, se deben extraer no más allá de los 30 min.
      • Los músculos esqueléticos, huesos, piel, encéfalo, médula, ganglios nerviosos no deben extraerse más allá de 60 min.
      El muestreo debe realizarse antes de: Autólisis y/o Putrefacción Los tejidos y órganos se han de extraer considerando las siguientes prioridades:
      • No deben ser mayores de 1 cm de espesor; deben ser tomados en ángulos rectos a la superficie de los órganos.
      • A veces pueden cortarse trozos de órganos de mayor tamaño, 2 o 3 cm y luego de algunas horas en fijador en que las piezas están más fáciles de manejar, se realizan cortes más pequeños de los mismos.
      • La cantidad de líquido fijador en microscopia óptica debe ser aproximadamente 10 a 20 veces el volumen de la muestra.
      Formalina al 10% 24 horas
      • Una buen a fijación debe:
            • Actuar con rapidez, matando y fijando a las células antes de que aparezcan los fenómenos agónicos o post-mortem (autólisis, desintegración, etc.)
            • 2. Poseer alto poder de penetración para asegurar la fijación correcta hasta en las capas profundas de la pieza a fijar
            • 3. Conservar, en lo posible, los detalles estructurales que presentaban in vivo
            • 4. Permitir o favorecer el empleo de los procedimientos necesarios para su observación ulterior (ejecución de cortes, coloración, etc.)
            • 5. Impedir la desaparición de los elementos solubles durante la fijación o después de ella
            • 6. No provocar o impedir la producción de estructuras artificiales
            • 7. No retraer excesivamente los tejidos ni volverlos friables o quebradizos
      Es una operación destinada a provocar la “ MUERTE ” de las células, conservándolas, cuanto sea posible en el estado en que están durante la vida.
      • Coagulando las proteínas sin combinarse con ellas (alcohol, ácido pícrico, yodo, calor)
      • Formando combinaciones químicas con las sustancias orgánicas (ácido crómico y sus sales)
      • Reduciéndose en contacto con las mismas y originando en su seno un precipitado sumamente fino (ácido ósmico, bicloruro de mercurio, cloruro de oro)
      • La mayor parte de los fijadores actúan como oxidantes, favoreciendo así la coloración ulterior de los tejidos
      • Formol al 10%
      • Alcohol etílico absoluto o de 96%
      • Alcohol metílico
      • Ácido ósmico al 1 ó 2%
      • Bicromato de potasio al 3-5%
      Químicos SIMPLES COMPUESTOS
      • Líquido de Fleming, mezcla cromo-osmio-acética.
      • Líquido de Zenker, mezcla bicromato-sublimado-acética.
      • Líquido de Helly, mezcla Zenker-formol.
      • Líquido de Bouin, mezcla picro-formos-acética.
      • Liquido de Duboscq-Brasil, o Bouin alcohólico
      FÍSICOS Desecación, Calor seco, Calor húmedo, Frío y Congelación y desecación
    • Los tejidos contienen grandes cantidades de agua, tanto intracelular como extracelular, que debe ser eliminada y reemplazada por parafina Lavado en agua o alcohol Deshidratación Una lámina en un caja de deshidratación La deshidratación se hace en forma progresiva con sucesivos baños de alcohol, cada vez menos hidratados 70° – 80° – 90° – 96° – 100° Tiempos de permanencia en cada líquido: Alcohol 70: las piezas pueden permanecer varios días. Alcohol 96: 2 baños en un lapso de 24 h. Alcohol 100: 3 baños de una hora c/u.
    • Impregnación por un disolvente de la parafina Las piezas perfectamente deshidratadas se sumergen en el disolvente (xilol o toluol) Aclaración Se sumergen las piezas en parafina (56-58º de punto de fusión), mantenida líquida en la estufa a no más de 62ºC. Después de 1 a 2 horas se renueva la parafina Penetración de la Parafina En moldes de papel o de metal ad-hoc (barras de Leuckart) se vierte la parafina fundida, del mismo punto de fusión de la que ha servido para la penetración. Se colocan las piezas orientándolas y luego se pone el molde en heladera Inclusión Definitiva o Formación del Bloque 15-30 minutos
      • El objeto de la inclusión que hemos descripto anteriormente es hacer posible la reducción del tejido a cortes lo suficientemente delgados como para permitir el paso de la luz para examinarlo al microscopio.
      • Los cortes más corrientes son los de 4-6 micrones.
          • Micrótomo de deslizamiento
          • Micrótomo Tipo Minot
          • Micrótomo de Congelación
          • y el Crióstato o Criótomo
      CORTES Micrótomo tipo Minot
      • Los cortes de parafina se extienden en agua tibia contenida en un cristalizador.
      • Se introducen portaobjetos, cubiertos con una capa de adhesivo de Mayer y, con la ayuda de una aguja histológica, se colocan los cortes sobre el portaobjetos y a continuación se lo levanta
    • Tinción o Coloración de los Cortes Corte Deshidratado y Montado en un Portaobjeto
      • Desparafinar los cortes con xilol
      • Rehidratar con alcoholes de gradación decreciente (100%, 50%....agua)
      • Coloración
      • Aclarar el exceso de colorante con agua
      • Deshidratar
      • Montar (Resina + Cubreobjetos)
    • Coloración Proceso mediante el cual un cuerpo es teñido por una sustancia colorante, sin perder el color cuando es lavado con el disolvente Colorante Sustancias que pueden conferir color a otros cuerpos Clasificación
      • COLORANTES NATURALES:
          • Animales (carmín)
          • Vegetales (hematoxilina, orceína, azafrán)
      COLORANTES ARTIFICIALES O SINTÉTICOS (COLORES DE ANILINA) Ácidos, Básicos, Neutros e Indiferentes
      • Sales cuya base es coloreada y el ácido es incoloro (azul de metileno o clorhidrato de azul de metileno).
      • Reaccionan con los GRUPOS ANIÓNICOS de los componentes texturales, que son los grupos:
        • Fosfatos de Ácidos nucleicos (ADN y RNA)
        • Sulfatos se los glucosaminoglucanos
        • Grupo Carboxilo de las proteínas.
      • La reacción de estos grupos varía según el pH.
      • Son colorantes nucleares
      • Ejemplos:
      • Verde de Metileno, Azul de Metileno, Pironina G, Azul de toluidina y la Hematoxilina
      COLORANTES BÁSICOS
      • Los tejidos que reaccione con un colorante básico (o con Hematoxilina) se dice que es BASÓFILO y que presenta BASOFILIA. Estos componentes son:
          • La Heterocromatina y los Nucléolos del Núcleo por los grupos Fosfato ionizados.
          • Ergatoplasma (parte del citoplasma) por grupos Fosfato ionizados.
          • Matriz del Cartílago por grupos Sulfato ionizados.
      • Sales cuya base es incolora y su ácido es coloreado (eosina o eosinato de sodio)
      • Se unen primariamente a los componentes texturales por medio de enlaces electrostáticos de manera similar pero opuesta a la de los colorantes básicos
      • Las anilinas ácidas reaccionan con grupos catiónicos, como los GRUPOS AMINO IONIZADOS de las proteínas
      • Son colorantes citoplasmáticos
        • Los componentes texturales que se tiñen de colorantes ácidos se dice que son ACIDÓFILOS y que presentan ACIDOFILIA.
        • Son acidofilos:
        • La mayor parte del citoplasma no especializado.
        • Filamentos Citoplasmáticos.
        • Fibras extracelulares
      COLORANTES ÁCIDOS
    • Hematoxilina – Eosina 1º-Desparafinado. Estufa durante 30 min. a 60º. Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min. 2º- Hidratación. Alcohol absoluto-5min. Alcohol 96º-5min. Alcohol 70º-5min. 3º- Lavar en H2O destilada. 4º- Hematoxilina-5min. 5º- Lavar en H2O-2min. 6º-Eosina alcoholica-1min. 7º-Deshidratar. Alcohol de 70º Alcohol de 96º. Alcohol absoluto. Xilol. 8º- Montaje. La hematoxilina es un colorante catiónico mientras que la eosina es un colorante aniónico perteneciente a los xantenos. Se teñirán los núcleos de azul, citoplasmas en rosa, músculo en tonos rojizos a rosados fucsia, glóbulos rojos en naranja o rojo y la fibrina en rosa intenso Técnica Micrografía de Intestino Delgado(5X ) H&E Micrografía de Piel (5X) H&E
    • NEUTROS AZUL DE METILENO METACROMÁTICO AZUL DE TOLUIDINA Azul de Metileno Azul de Toluidina
      • CONVENCIONALES:
          • H-E
          • TRICRÓMICOS: Van Gieson, Masson,
          • Gallego.
          • TÉCNICAS DE PLATA
          • GIEMSA: Extensiones de sangre, citologías
          • PAPANICOLAU: Citologías
      • HISTOQUÍMICOS:
          • Sudán III Lípidos
          • Carmín de Best, PAS Glucógeno
          • Azul de Prusia Hierro
          • Von Kossa Calcio
          • Orceína Fibras elásticas
      • INMUNOHISTOQUÍMICOS
      • Elástica de Van Gieson
      • Es una técnica para la coloración de fibras colágenas y elásticas.
      • El colágeno parece que capta un colorante ácido.
      • Tiñe el colágeno de rojo, núcleos y fibras elásticas de negro y citoplasma de amarillo.
      Van Gieson Pared de la tráquea, Van Gieson.
    • Van Gieson
    • Azan (Azocamin + Aniline blue)
      • Color Rojo
      • Núcleos celulares
      • Color Rosa
      • Citoplasma celular
      • (color rojo-naranja: fibras musculares y hematíes)
      • Color Azul
      • Mucinógeno
      • Fibras de colágeno
      Región distal del glande. Coloración: Azan. Escala de reproducción: 200x
    • Sales de Plata
      • color negro-marrón oscuro:
        • Fibras de reticulina,
        • Dendritas
        • Axones neuronales
        • Prolongaciones gliales
      Micrografía de un corte transversal de músculo liso teñido con sales de plata para la demostración de fibras reticulares. Micrografía de Mesenterio. Impregnación argéntica. Micrografía de Lengua (Mastocitos). Impregnación argéntica.
    • GOMORI (Sales de Plata)
      • Sustancias específicas mediante reacciones químicas
        • Sudán III Lípidos
        • Carmín de Best, PAS Glucógeno
        • Azul de Prusia Hierro
        • Von Kossa Calcio
        • Orceína Fibras elásticas
    • 1º.- Cortes obtenidos por congelación (La inclusión en parafina disuelve las grasas). 2º.- Introducir los cortes en la mezcla a partes iguales de Sudan III y Rojo Escarlata (filtrado). 24 horas. 3º.- Lavar en agua destilada. 4º.- Teñir los nucleos con Hematoxilina de Groat--2 minutos. 5º.- Lavar y secar con papel de filtro. 6º.- Montar en Plasdona. Sudan Rojo . Arteria muscular SUDAN ROJO PARA TEÑIR LIPIDOS SIMPLES
    • PAS o del ácido peryódico de Schiff Se basa en la rotura de los enlaces -C-C- presentes en los carbohidratos por la acción del ácido peryódico, potente agente oxidante, liberándose grupos aldehído que al combinarse con el reactivo de Schiff dan un compuesto de color rojo púrpura intenso. Cuerpo Epidídimo de Conejo. PAS 400X Cabeza del Epidídimo de Conejo. PAS 400X color rosa-magenta: carbohidratos, mucoproteínas, proteoglicanos
    • PAS (Glucógeno)
    • Azul de Prusia (Hierro)
    • Von Kossa (Calcio)
    • Orceína (Fibras elásticas)
    • Estudia la composición química de la célula y permite detectar la localización topográfica de algunos principios inmediatos, enzimas, metales pesados y otras sustancias. Se considera como un nexo de unión entre la morfología y la bioquímica
      • En una reacción bioquímica hay tres pasos fundamentales:
      • Fijación:
        • Preservar las estructuras y reactividad funcional celulares
        • Existen diversos fijadores: metanol, etanol, acetona, glutaraldehído, formaldehído, etc.
      • Incubación
        • Consecuencia se liberar unos productos que bien por si mismos, o al combinarse con otra sustancia presente, dan lugar a un precipitado visible en el lugar de la reacción.
      • Contraste
      • Para resaltar en lo posible el producto de reacción y permitir una óptima visualización del núcleo y del citoplasma.
      Las reacciones deben tener 3 características: sensibilidad, especificidad y reproductibilidad
    • Detección de antígenos (biomoléculas) en células/tejidos mediante anticuerpos marcados “in situ”.
    •  
    • INMUNOFLURECESCIA Fluoresceína Vimentina
    • INMUNOFLURECESCIA Rodamina GFAP
    •  
    • INMUNOENZIMATICAS Islotes de Langerhans (Páncreas) Insulina Glucágon Corteza Cerebral Isomastotatina VIP
    • FOSFATASA ALCALINA FOSFATASA ACIDA ESTERASAS
    • INMUNO ORO (ORO COLOIDAL) NEUROHIPOFISIS
    • Es la distancia mínima que debe separar a dos objetos para que sean percibidos como dos objetos diferentes al ser observados con el microscopio Resina Epon / 1 μ m Azul de toluidina Parafina / 7 μ m PAS-Hematoxilina férrica
      • Selección de la muestra
      • Fijación de la muestra
      • Inclusión de la muestra
      • Corte de la muestra
      • Contraste [“tinción”] de los cortes
      • [Montaje de los cortes]
      • Examen de los cortes con el M.E.
      • Finalidad
        • Preservar los tejidos de forma similar a su estado “in vivo”
        • Aumentar la dureza de la muestra para facilitar su posterior corte
      • FIJADORES USADOS
        • Solución tamponada de glutaraldehído 2,5-5%
        • Solución tamponada de tetróxido de osmio 1-2%
      La fijación hace que precipiten las proteínas tisulares
      • Finalidad
      • Endurecer la muestra homogéneamente para obtener cortes ultrafinos
      • Método de inclusión en resina
        • Lavar el fijador en exceso de la muestra con una solución tampón
        • Contrastar “en bloque” (con acetato de uranilo, p. ej.)
        • Deshidratarla muestra con alcoholes de gradación creciente
        • Pasar la muestra por un disolvente (óxido de propileno...)
        • Introducir la muestra en una mezcla 1:1 de resina y disolvente a temperatura ambiente para que la muestra se embeba de resina
        • Introducir la muestra en resina pura [en una cápsula de gelatina o plástico] a 60oC para que polimerice y forme un bloque de resina que contenga la muestra
    •  
    • Citrato de plomo Acetato de uranilo
    • Interpretación de Cortes Histológicos
    • El microscopio óptico tiene un limite resolución de cerca de 200 nm (0.2 µm ). Este limite se debe a la longitud de onda de la luz (0.4-0.7 µm ) Las células observadas bajo el microscopio óptico pueden estar vivas o fijadas y teñidas Sistema Mecánico Sistema Óptico
      • OCULAR
      • Amplía la imagen del objetivo.
      • OBJETIVO
      • Amplía la imagen de la preparación
      • CONDENSADOR
      • Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación.
      • DIAFRAGMA
      • Regula la cantidad de luz que entra en el condensador.
      • FUENTE DE ILUMINACION
      • Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.
      Sistema Óptico
      • SOPORTE
      • Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo.
      • PLATINA
      • Lugar donde se deposita la preparación.
      • CABEZAL
      • Contiene los sistemas de lentes oculares.
      • REVÓLVER
      • Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos.
      • TORNILLOS DE ENFOQUE
      • Macrométrico que aproxima el enfoque.
      • Micrométrico que consigue el enfoque correcto.
      Sistema Mecánico
      • 1.  Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina completamente. Si el microscopio se recogió correctamente en el uso anterior, ya debería estar en esas condiciones.
      • 2.  Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas.
      • 3.  Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición) o colocar el de 10 aumentos (10x) si la preparación es de bacterias.
      • 4.   Para realizar el enfoque:
        • a.  Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos.
        • b.  Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparación con el macrométrico y, cuando se observe algo nítida la muestra, girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fino.
      • 5.  Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operación desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación y por ello es fácil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparación si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersión si se observa una preparación que ya se enfocó con el objetivo de inmersión.
      MANEJO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO
      • Empleo del objetivo de inmersión:
        • a.  Bajar totalmente la platina.
        • b.  Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habrá que echar el aceite.
        • c.  Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino entre éste y el de x40.
        • d.  Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de luz.
        • e.  Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión.
        • f.   Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente.
        • g.  Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersión y la preparación es mínima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande.
        • h.  Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se mancharía de aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operación desde el paso 3.
        • i.   Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el revólver. En este momento ya se puede retirar la preparación de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersión en posición de observación.
        • j.  Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel especial para óptica. Comprobar también que el objetivo 40x está perfectamente limpio
    • 1.  Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en posición de observación, asegurarse de que la parte mecánica de la platina no sobresale del borde de la misma y dejarlo cubierto con su funda. 2. Cuando no se está  utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su funda para evitar que se ensucien y dañen las lentes. Si no se va a usar de forma prolongada, se debe guardar en su caja dentro de un armario para protegerlo del polvo. 3. Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy suavemente con un papel de filtro o, mejor, con un papel de óptica. 4. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se está  utilizando el microscopio. 5- Después de utilizar el objetivo de inmersión, hay que limpiar el aceite que queda en el objetivo con pañuelos especiales para óptica o con papel de filtro (menos recomendable). En cualquier caso se pasará el papel por la lente en un solo sentido y con suavidad. Si el aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo, hay que limpiarlo con una mezcla de alcohol-acetona (7:3) o xilol. No hay que abusar de este tipo de limpieza, porque si se aplican estos disolventes en exceso se pueden dañar las lentes y su sujeción. MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES
    • 6- No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macrométrico, micrométrico, platina, revólver y condensador). 7-  El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo siempre la mirada a la preparación para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de objetivo agarrándolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se está observando a través del ocular. 8- Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algún líquido, secarlo con un paño. Si se mancha de aceite, limpiarla con un paño humedecido en xilol. 9- Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesión práctica y, al acabar el curso, encargar a un técnico un ajuste y revisión general de los mismos. MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES
    • Utiliza un haz de electrones para producir la imagen. Permite conocer la ultraestructura de las células y de la matriz extracelular Filamento Calentado Lente Magnética Espécimen Lente Objetivo Lente Proyector Imagen sobre Pantalla Fluorescente
    • El haz de electrones no atraviesa la muestra, sino que choca contra su superficie. Permite una gran magnificación de las imágenes. Pantalla Visora Filamento Calentado Lente Rayo Deflector Lente Detector
    • Resina Epon / 1 μ m Azul de toluidina n
    •  
    • PREGUNTAS…..