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  1. 1. INSTITUTO TECNOLÓGICO SUPERIOR DE ALAMO TEMAPACHE INGENIERIA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS RESIDENCIA PROFESIONAL NOMBRE DEL PROYECTO: “OBTENCIÓN DE FRUCTANOS EN LAS DIFERENTES ETAPAS FENOLÓGICAS DEL CULTIVO DE CEBOLLA (Allium cepa l.) EN INVERNADERO, PARA SU USO EN ALIMENTOS FUNCIONALES.” PRESENTA: VIANEY ARGÜELLES MARTINEZ N°CONTROL: 081G0065 INSTITUTO TECNOLOGICO DE TLAJOMULCO JALISCO (ITTJ) ASESOR INTERNO: MC. REYNOL FERNÁNDEZ AGUILAR ASESOR EXTERNO: DRA. LUZ ADRIANA VÍZCAINO RODRIGUEZ. XOYOTITLA, ÁLAMO TEMAPACHE, VER. ENERO 2013.
  2. 2. El presente trabajo: “OBTENCIÓN DE FRUCTANOS EN LAS DIFERENTES ETAPAS CULTIVO CEBOLLA DE FENOLÓGICAS (Allium cepa DEL l.) EN INVERNADERO, PARA SU USO EN ALIMENTOS FUNCIONALES.” Se llevo a cabo en el laboratorio de Análisis instrumental y bioquímico, del departamento de posgrado e investigación (DEPI) en el Instituto Tecnológico de Tlajomulco Jalisco bajo la dirección de la Dra. L. Adriana Vizcaíno Rodríguez y Dr. Carlos Arias Castro.
  3. 3. SUBSECRETARiA DE EDUCACION SUPERIOR DIRECCION GENERAL DE EDUC.ACION SUPERIOR TECNOLOGICA 1NSTITlJTO 'I;ECNOLOCICO DE TLAjOMULCO. ~1~-·~~;~ .~~ ~;; •...• ,." t,,-'O ~'L ). ~~~i '1"'-_"-')'<0'-'" :;:" co ,.. ••..• :: ••••••••.•••.••.• ~••• _• .,.._ •••..• JALISCO Tldjornulco de l.tl1iiga.I:1liSco Asunto: Carta de conclusion de Residencia mtWl·NfJ Profesional L1C. BLANCA ESTELA SANTIAGO MARCELINO DEPARTAMENTO DE SERVICIO SOCIAL Y RESIDENCIAS PROFESIONALES PRESENTE Por medio de la presente, tengo a bien informarle 'que la estudian e de la Ingenieria en Industnas Alimentarias. VIANEY ARGUELLES MARTINEZ. con e! numero de controi 081 G0065 conciuy6 satisfactoriamente la Residencia Profesi.onal bajo mi supervision en el Departamento de Posgrado e Investigacion (DEPI) del Instituto Tecnologico de Tlajomulco Jalisco (ITT J) durante el penodo AgostoDlc!embre de 2012, con un total de 640 h ATENTAMENTE • l . /.....i..: ••.•..•...•. ~J,..~..".I"..••• ' ... ,. ! ~_. J • ',: ., .~. ~. ' •.•• ' ' •.• " •• ::- Ora Luz Adriana Vizcaino Rodriguez Profesor de Asignatura Investigador en el Lab Analisis Instrumental Bioquimico Ccp Expedienle. Km. 10 Carr. a San Miguel Cuyutlan Tels. (33) 3772-4426 Y 3772-4388 / Tlajof1lulco de Zllfiiga. ]alisco Fax: (33) 3772-4'fL7 Ext 1U4. ern;]il: ':".' ..
  4. 4. INSTITUTO TECNOLOGICO EVALUAC'ON SUPERIOR DE ALAMO- TEMAPACHE DEL RESIDENTE POR LA DEPENENDENCIA OIY EMPRESA EVA 1 RP OBJETIVO: Obtener el punto de vista de la persona que se ha desempefiado como asesor extemo, en el desarrollo del proyecto de Residencias Profesionales. , LUGAR Y!FECHA: Tlajomulco de Zufiiga, Jal. Diciembre 18 de 2012. OMBRE DEL RESIDENTE: Vianey Arauelles Martinez .. NUMERO DE CONTROL: 081 G0065 CARRERA: I GE IERIA E INDUSTRIAS ALIMENT ARIAS TITULO DEL PROYECTO: OBTENCION DE FRUCTANOS EN ·LAS DIFERENTES ETAPAS FENOLOGICAS DEL CUL TIVO DE CEBOLLA (Allium cepa I.) EN INVERNADERO, PARA SU usa EN ALiMENTOS FUNCIONALES" OMBRE DE LA EMPRESA 0 DEPE DE CIA: INSTITUTO TEC OLOGICO DE TLAJOMULCO JALISCO (ITTJ) NOMBRE Y PUESTO DEL JEFE INMEDIATO (ASESOR EXTERNO): Ora. Luz Adriana Vizcaino Rodri ez. Profesor-investi ador TEMATICA GENERAL DEL PROYECTO DE RESIDENCIAS PROFESIO Identificar las actividades enzimaticas asociadas a la acumulacion de fructanos, durante las eta as fenoloaicas del crecimiento de cebolla en invernadero. Desarrollar el roceso de extraccion de los mismos su a licacion en alimentos funcionales. OBSERVACIONES Y RECOME DACIONES: Excelente traba'o de Residencia Profesional. Con base en 10 anterior se recomienda re rese al ITTl, Elaborar su tesis de Licenciatura. SOCiAL' R02/0112 ),......~ ::..{' .. F-DS.SyR.S-06
  5. 5. ESCALA DE PONDERACION PARA LA EVAlUACION EMPRESA DEL RESIDENTE POR LA LUGAR Y FECHA: Tlajomulco de Zuniga. Jal. Diciembre 18 de 2012 PUNT AJE MAXIMO ASPECTOS A EV ALUAR: 1. EXPRESION: ORAL Y ESCRIT A Deficiente 10 Aceptable Buena 2. INICIA TlV A Nula 10 Regular Adecuada 3. COOPERACION Colabora por sf mismo satisfactoriamente 5 Colabora sin reservas en cualquier actividad 4. DlSCIPLINA lnadecuada 10 Regular Adecuada 5. RESPONSABILIDAD Irresponsable 5 Responsable 6. CONOCIMIENTOS DE SU AREA Nulo Minimo 20 Regular Bueno 7. SOCIABILIDAD Receloso y poco sociable 5 Retrafdo pero amable y cortes Sociable 8. INTEGRACION A GRUPOS DE TRABAJO Nulo 5 Regular Bueno 9. LlDERAZGO Nulo 10 Regular Buena DE LA 10. CALlDAD EN EL DESEMPENO RESIDENCIA Mala 20 Deficiente Regular ~ Buena -.. CALlFICACION GLOBAL ASIGNADA: L MnC1Y1ol YtUCIV)O eod~'Jue-€... Ora. Luz Adriana Vizcaino Rodriguez. Nombre y firma Asesor externo R02/0112 __ CALIFICACION 10 9 4 9 5 19 5 5 9 20 .<:~:'~~':~ :'~ .. . " 94__ 2.E.P. DGEST l:1D1T00033 E.-'-,jO,'o:UlCO DE .~·'''J::liG,u, Jf1J.. CiREC&JJO del organismo F-DS.SyR.S-06
  6. 6. INSTITUTO TECNOLOGICO SUPERIOR DE ALAMO TEMAPACHE Asunto: Liberaci6n de asesor interno ; C. MC. ESTHER MORENO CARBAJAL JEFE DE CARRERA DE INGENIERIA EN INDUSTRIAS PRESENTE ALiMENTARIAS Par este medio Ie comunico que el informe final de residencia profesional denominado Obtenci6n de Fructanos en las Diferentes Etapas Fenol6gicas en el Cultivo de Cebolla (Allium sepa L.) en Invernadero para su uso en Alimentos Funcionales, presentado par el (Ia) C. Vianey Arguelles Martinez, can numero de control 081G0065 de la carrera de Ingenieria en Industrias Alimentarias. En su proceso de Revision ha concluido y Can el objetivo de asentar una calificaci6n acorde al del asesor exJ~l~'<?,( Ja ~esidencia ~umplio can las expectativas deseadas: . ,.., ) ) . I Avances de Presentacion Mensual Contenido y Forma Metodologia Aportacion a la Empresa Ponderacion 25% 25% 25% 25% I Calificacion -_.~ 25% i i I I 25% .25% i 25% ~ Obteniendo una calificaciorr de 100 (Cien) par tal motivo Ie informo que puede continuar can su proceso. in otro particular, se extiende los la presente 25 Alamo, en Xoyotitla, dias del mes de 1t:.l·- r i J . L .. _ .. ~ I,',' ~ l R04/0312 F-JC-18
  7. 7. INSTITUTO TECNOlOGICO SUPERIOR DE ALAMO TEMAPACHE OFICIO DEP No.003 Asunto: Reproducci6n de CD.. Xoyotitla, Alamo Temp.,23 de Enero de 2013. VIANEY ARGUELLES MARTiNEZ. PASANTE DE LA CARRERADE ING. EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS. PRE SEN T E. De acuerdo con el dictamen emitido analisis del Informe por la Comisi6n Revisora designada para el Final de Residencia Profesional presentado por ustedes cuyo titulo es: "OBTENCION DE FRUCTANOS EN LAS DIFERENTES ETAPAS FENOLOGICAS DE CULTIVO DE CEBOLA (ALLIUM CEPA I.) PARA SU usa EN ALIMENTOS FUNCIONALES" Y considerando que reune todos Profesionales vigente autorizo los requisitos marcados en el Manual de Residencias en el Sistema Nacional de Educaci6n Superior Tecnol6gica; para que proceda la reproducci6n electr6nica en CD, asi como tambien empastado de dicho trabajo. Le hago de su conocimiento para los fines conducentes alia liberaci6n residencia profesional, esperando que el logro del mismo sea congruente de la con sus aspiraciones profesionales. Aprovecho la ocasi6n para enviarles un cordial saludo C.C.p.- Archivo ALVC/dah· F-DIR-01 R21/1212 Carretera Potrero del L1ano-Tuxpan Km. 6.S Xoyolilla Mpio. de Alamo Temapache, Veracruz Tel. y Fax. (765) 844.00.38 I 844.00.39 www.itsaJamo.edu.mx _5 E_P _ •• ~:;..' ~ . ;.~" I (a) W ~ In ~ GOBIERNO DEL ESTADO DE VERACRUZ ~ -:. "adelante SEV ~~fDUO
  8. 8. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales ÍNDICE DE CONTENIDO ÍNDICE GENERAL. ÍNDICE DE FIGURAS. ÍNDICE DE TABLAS. página I IV VIII INTRODUCCION. I I PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 2 1.1 Antecedentes generales del ITTJ. 2 1.2 Organigrama del ITTJ. 4 1.3 Planteamiento del problema. 5 1.4 Justificación. 5 1.5 Objetivo general 6 1.5.1 Objetivos particulares. 6 1.6 Hipótesis. 7 1.7 Cronograma de actividades. I
  9. 9. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales II MARCO TEORICO 2.1 Los fructanos, definición e importancia para el hombre. 8 8 2.2 Importancia de los fructanos en la industria alimentaria y en la salud. 10 2.3 Métodos para determinar fructanos. 14 2.4 Síntesis de fructanos. 15 2.5 Aspectos generales de Allium cepa l. 17 2.6 Etapas fenológicas de Allium cepa L. 9 III. MATERIALES Y MÉTODOS 21 3.1 Reactivos. 21 3.2 Equipos. 22 3.3 Adecuación de hortalizas en invernadero. 23 3.4 Tratamiento a compuestos sulfurados 25 3.5 Extracción de jugo de cebolla. 26 3.6. Secado por aspersión. 26 3.7 Preparación de solvente para placa. 27 3.8 Preparación de la solución reveladora. 27 3.9 Preparación de buffer de acetato de sodio. 27 3.10 Obtención de curva patrón de HPLC. 28 3.11 Determinación de fructanos por la técnica de TLC. 28 3.12 Cuantificación de fructanos por HPLC. 24 3.13 Cuantificación de fructanos por intercambio iónico. 24 3.14 Determinación de proteínas. 30 3.15 Actividad enzimática. 30 3.16 Determinación de carbohidratos. 31 II
  10. 10. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales IV APLICACIÓN Y RESULTADOS 32 4.1 Compuestos sulfurados 32 4.2 Muestreo de hortalizas en invernadero 32 4.3 Curva estándar de calibración para HPLC 35 4.4 Identificación y cuantificación de fructanos por intercambio iónico 38 4.5 Identificación y Cuantificación de proteínas en etapas fenológicas de Allium 40 cepa L. 4.6 Identificación y cuantificación de carbohidratos en etapas fenológicas de Allium 43 cepa L. V DISCUCIÓN 47 VI CONCLUCIÓN 49 VII RECOMENDACIONES 50 VIII REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS. 51 III
  11. 11. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales ÍNDICE DE FIGURAS Figura Figura 1 Página Estructura básica de 10 fructana tipo levana. B estructura de inulina. Figura 2 Representación esquemática 17 de una planta de cebolla en la etapa de expansión de las hojas, previo al inicio de la bulbificación. Figura 3 Representación esquemática 18 de bulbo de cebolla. Figura 4 Esquema del ciclo normal 20 de desarrollo de la cebolla. Figura 5 Siembra de Allium cepa L. 23 en inverdadero. Figura 6 Intercambio iónico en 30 Relacion de peso en bulbo 32 Allium cepa L. Figura 7 de cebolla en las diferentes camas en inverdadero. Figura 8 Relacion de longitud de hojas cebolla en las diferentes camas en inverdadero. IV
  12. 12. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales Figura Figura 9 Pagina Relación de diámetro 33 de bulbo de cebolla en las diferentes camas en invernadero. Figura 10 Relación de tallo de 34 bulbo de cebolla en las diferentes camas en invernadero. Figura 11 Relación de altura de 34 bulbo de cebolla en las diferentes camas en invernadero. Figura 12 Comparación de la 35 variable de peso en las diferentes camas en invernadero Figura 13 Curva estándar de fructanos. La concentración 36 de fructanos está dado en mg/ml. V
  13. 13. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales pagina Figura 14 Curva estandar de glucosa. La concentracion 36 de glucosa está dado en mg/ml. Figura 15 Curva estándar de sacarosa. La concentración 37 de sacarosa está dado en mg/ml Figura 16 Curva estándar de fructosa. La concentración 37 de fructosa esta dado en mg/ml. Figura 17 Análisis de TLC de resinas 38 en intercambio iónico en Allium cepa L Figura 18 Cromatogramas HPLC de 39 de extracto de Allium cepa L. por intercambio iónico. VI
  14. 14. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales Pagina Figura 19 Análisis de TLC de las 41 diferentes etapas fenológicas de Allium cepa L. para proteínas Figura 20 Cromatogramas de proteínas 42 en etapas fenológicas de Allium cepa L Figura 21 Cuantificacion de fructanos 42 en etapas fenologicas de Allium cepa L. Figura 22 Análisis de TLC de las 43 diferentes etapas fenológicas de Allium cepa L. para la identificación de carbohidratos. Figura 23 Cromatogramas carbohidratos de en 44 etapas fenologicas de Allium cepa L. Figura 24 Cantidad de fructanos en etapas fenologicas de allium cepa. 45 VII
  15. 15. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales ÍNDICE DE TABLAS. Tabla Página Tabla 1 Objetivos fundamentales de los alimentos funcionales 11 Tabla 2 Efectos de algunos alimentos funcionales naturales de especie de relevancia. 12 Tabla 3 Propiedades funcionales de la inulina y sus derivados. 14 Tabla 4 Densidad de siembra en invernadero de Allium cepa L. 24 Tabla 5 Muestreos de Allium cepa 25 L. en invernadero Tabla 6 Tratamientos para reducir la presencia de compuestos sulfurados en cebolla. 26 Tabla 7 Parámetros del secado por aspersión. 27 Tabla 8 Preparación de solvente para placa de TLC. 27 Tabla 9 Cálculos para calibración 28 de curva estándar para HPLC 10 Cuantificación de fructanos en intercambio iónico de extractos de Allium cepa L. 40 VIII
  16. 16. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales INTRODUCCIÓN La cebolla (Allium cepa L.) ha sido tradicionalmente uno de los cultivos del sector hortícola más relevante a escala nacional. Ello se debe a su amplia distribución geográfica, superficie y consumo per cápita, así como a la gran cantidad de cultivares existentes para consumo. Esto sumado a que el país, también produce semillas de cebollas, lo que potencia la producción de cebolla fresca y de guarda para la exportación. (Aljaro, 2001a). En México se cultivan unas 40,000 hectáreas de cebolla. Las variedades blancas son para el mercado interno y las amarillas y rojas se destinan a la exportación. Tampico es la zona más importante con unas 8,000 hectáreas de producción de cebolla amarilla. (Fernando cuenca (1999). El consumo de cebolla supone aporte de nutrimentos importantes en la dieta humana , sin embargo se emplea fundamentalmente con el fin de condimentar alimentos, respecto a la composición de la cebolla cabe destacar además que no tiene almidón ni oligosacáridos de la rafinosa si no que usa diversos fructanos como reserva de carbohidratos.( Hansen, 1999 ; Jaime et at ., 2000). El consumo de cebolla y otros Alliums como el ajo y el puerro, está asociado con la reducción de riesgos de padecer enfermedades cardiovasculares, pulmonares y cáncer (Ariga et al., 1981, Kendler 1987; Augusti, 1990, Dorsch et al., 1996). Además es conocido su efecto antibiótico (Zohri et al., 1995). Los fructanos de plantas se encuentran ampliamente distribuidos en mono y dicotiledóneas. Abundan en las familias Liliaceae, Amaryllidaceae, Gramineae y Compositae. Varias plantas ricas en fructanos son comestibles totalmente o algunas de sus partes, por ejemplo, las raíces de achicoria, los espárragos, el apio, las cebollas, los ajos, las alcachofas, etc.( T.Girbéz y P.jímenez) 1
  17. 17. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales CAPITULO I PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 1.1 Antecedentes generales del Instituto Tecnológico de Tlajomulco Jalisco (ITTJ.) El Instituto Tecnológico de Tlajomulco Jalisco (ITTJ) pertenece a la Dirección General de Educación Superior Tecnológica (DGEST), de la Secretaría de Educación Pública (SEP). En el se imparte educación a nivel de Licenciatura y Posgrado en áreas relacionadas con el sector agroindustrial del México. En particular en el Departamento de Estudios de Posgrado e Investigación (DEPI) del ITTJ, cuenta con Profesores-Investigadores e infraestructura (Laboratorios, Invernaderos, Planta Piloto, etc.), requeridos para Programa la Maestría y Doctorado en Agrobiotecnología. El primero reconocido por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) y el segundo por la DGEST, los cuales otorgan becas a los estudiantes adscritos al Programa. Adicionalmente, el DEPI acepta estudiantes procedentes de carreras afines, para que realicen Residencias Profesionales y Tesis de Licenciatura, a fin de que fortalezcan su formación con enfoque en la investigación de desarrollo tecnológico agroindustrial. . 2
  18. 18. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales Misión Somos una Institución de Educación Superior Tecnológica que ofrece servicios de calidad y formación integral de profesionistas de nivel licenciatura y posgrado competentes, que contribuyan al desarrollo del país mediante programas acreditados y procesos certificados con base en estándares de calidades nacionales e internacionales. Visión Constituirnos en 2020 como una Institución de Educación Superior e investigación, reconocida por su alto nivel de competencia en la intervención con el entorno y por la excelencia de nuestros egresados, como agentes de cambio hacia el desarrollo sustentable, respetuosos de nuestra cultura y tradiciones, como amplio liderazgo local, regional y nacional. 3
  19. 19. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales 1.2 Organigrama del ITTJ 4
  20. 20. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales 1.3 Planteamiento del problema. En México y en el mundo existe una gran variedad de hortalizas a las que desde tiempos remotos se les atribuye sabor a la comida y también a propiedades medicinales. La industria alimentaria actual se ha basado en los conocimientos tradicionales para la síntesis y elaboración de nuevos alimentos, que siguen descubriéndose nuevas aplicaciones. Actualmente los consumidores demandan productos de buen sabor y que posean atributos benéficos a la salud. En la hortaliza comestible cebolla (Allium cepa L.)Se ha estudiado las propiedades y su composición, así como también su aporte nutrimental en la dieta humana. Pero aun no se ha realizado estudios sobre la obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas, así como su aplicación. 1.4 Justificación La cebolla (Allium cepa L.) es una hortaliza de importancia en la medicina tradicional ya que cuenta con propiedades medicinales y que está asociada con la reducción de riesgos de padecer enfermedades cardiovasculares, pulmonares y cáncer. Esta hortaliza se caracteriza por ser la segunda fuente de fructanos en la dieta aportando el 25 %. Los fructanos afectan la microflora del colon, la fisiología gastrointestinal y el metabolismo de los lípidos. Los fructanos no son digeridos fácilmente en el estomago, representando una excelente fuente de fibra. El consumo de fructanos está asociado con la incidencia de enfermedades. Sin embargo aun no se ha reportado la obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas y su uso en aplicación de alimentos funcionales. 5
  21. 21. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales 1.5 Objetivo general: Desarrollar en forma integral los procesos de extracción de fructanos, e identificación de las actividades enzimáticas responsables de su acumulación, en las etapas fenológicas del crecimiento de cebolla en invernadero, y su uso potencial en alimentos funcionales. 1.5.1 Objetivos particulares:  Establecer las condiciones de extracción de fructanos en cebolla.  Determinar el contenido y grado de polimerización en las etapas fenológicas del cultivo.  Identificar las actividades enzimáticas responsables de su biosíntesis.  Obtención de fructanos en polvo mediante secado por aspersión.  Determinar las propiedades fisicoquímicas de los fructanos extraídos para su uso en alimentos funcionales. 1.5 Hipótesis La obtención de fructanos en invernadero para su uso en alimentos funcionales dependerá de la etapa fenológica en la que se encuentre. 6
  22. 22. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales 1.6 Cronograma de actividades Mes Ago Sep Oct Nov Dic x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x Actividad 1. Revisión y análisis de la literatura en el tema. 2. Establecer condiciones de extracción de fructanos a partir de plantas de cebolla. 3. Determinar el contenido y grado de polimerización de fructanos y las actividades enzimáticas asociadas en las etapas fenológicas del cultivo. 4. Obtención de fructanos en polvo mediante secado por aspersión de extractos acuosos. 5. Formular un alimento suplementado con fructanos de cebolla en polvo. 6. Evaluar sensorialmente el alimento desarrollado. 7. Seminarios de avance 8. Informes escritos de avance en el tema x x x x 7
  23. 23. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales CAPITULO II. MARCO TEORICO 2.1 Los fructanos, definición e importancia para el hombre. Se denomina fructano a cualquier carbohidrato que tenga uno o más uniones fructosa fructosa: por lo tanto, los fructanos son oligosacáridos de fructosa o polisacáridos de fructosa de longitud variable lineares o ramificados con dos tipos de estructura, las inulinas y los levanos. Ambos carbohidratos, inulinas y levanos. (Figura 1), se sintetizan de manera natural y artificial a partir de unidades de sacarosa con donadores de fructosa mediante las enzimas sacarosa‐sacarosa fructosil‐transferasa. (T.Girbés y P.jiménez) Los fructanos son polímeros de fructosa, lineales o ramificados, unidos mediante enlaces glicosídicos β (2-1) y/o β (2-6) y pueden presentar una molécula de glucosa interna o terminal. Son considerados carbohidratos de reserva en aproximadamente el 15% de las plantas superiores. (Mancilla-Margalli., 2006). Las cadenas de los fructanos pueden ser lineales o ramificadas. Las ramificaciones ocurren cuando los carbonos anoméricos de dos fructofuranos quedan conectados al O-1 y al O-6 de un mismo residuo de fructosa. El numero y tamaño de las ramificaciones es variable y depende principalmente del origen de cada fructano. (Waterhouse y chatterton, 1993). En la clasificación de los fructanos se combinan tres criterios esenciales: el tipo de enlace predominante entre los residuos de fructosa, el grado de polimeración (GP) de la molécula y su procedencia. (Yun 1996). Las enzimas encargadas de llevar a cabo la síntesis y degradación de este tipo de carbohidratos son las fructosiltransferasas (FTFs) pertenecientes a la familia 32 de las glicosilhidrolasas. Las enzimas necesarias para iniciar la síntesis de fructanos son la 1-SST (sacarosa: sacarosa 1-fructosiltransferasa), responsable de comenzar la formación del 8
  24. 24. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales fructano más sencillo tipo inulina (1-kestosa) y la 1-FFT (fructano: fructano 1fructosiltransferasa), que elonga la cadena de fructanos a partir de la 1-kestosa. Se han identificado otras enzimas involucradas en la síntesis y degradación de los diferentes tipos de fructanos en diversos sistemas vegetales como son la 6G-FFT (fructano: fructano 6Gfructosiltransferasa), la 6-SFT (sacarosa: fructano 6-fructosiltransferasa) y la 1-FEH (1fructanexohidrolasa). (Mellado-Mojica 2009). Las kesto-n-osas son fructanos oligomericos que contienen una sacarosa unida a uno o varios residuos de fructosa. En la naturaleza las mas abundantes son las kestotriosas (GP =3), la kestotetraosa (GP = 4) y la kestopentosa (GP=5) que en conjunto reciben el nombre de fructooligosacáridos y pueden ser de origen microbiano o vegeteal (Yun 1996). En el reino vegetal, solo el 15 % de la flora angiosperma es capaz de producir fructanos. Estas especies se enmarcan fundamentalmente en las ordenes asterales (Ej. Achicoria, y alcachofa), liliales(Ej. Cebolla y tulipanes) y poales (Ej. Trigo y cebada), considerados los mas avanzados desde el punto de vista evolutivo.(Hendry y Wallace , 1993). Los fructanos constituyen el principal carbohidrato de almacenamiento de las plantas que los producen, a diferencias del almidón, los fructanos son altamente solubles en agua y se producen en las vacuolas tanto de órganos de reserva como de tejidos con fotosíntesis activa. (Wiemkem y cols., 1995). Los FOS, son carbohidratos principalmente compuestos por la fructosa y algunos casos residuos de glucosa (Yun 2003). Los FOS conocidos como fructanos, son compuestos cuya estructura se encuentra formada por unidades repetitivas de disacáridos tales como la sucrosa, la inulobiosa y la levanobiosa . La unión de grupos fructosilos a la sucrosa en diferentes posiciones genera cetosas, las cuales son el fundamento de todos los fructanos naturales.(Suzuki y chatterton 1996). La naturaleza de estos enlaces tiene importantes implicaciones bioquímicas que se asocian a una marcada indigestibilidad de los mismos cuando son consumidos por los seres humanos. (Perrin et at 2001). 9
  25. 25. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales Figura 1. Estructura básica de fructana tipo levana. B estructura de inulina (López et at., 2003) 2.2 Importancia de los alimentos funcionales en la industria alimentaria y en la salud Se entiende por alimento a toda sustancia o mezcla de sustancias naturales o elaboradas que, ingeridas por el hombre, aportan al organismo la energía y los nutrientes (carbohidratos, proteínas, lípidos, vitaminas, minerales). Todo alimento consumido debe ser inocuo, aspecto básico de su calidad. (Ulloa y espinosa 2010) La definición de la salud ya no está restringida a la ausencia de enfermedades, si no que incluyen el buen estado físico, mental y sicológico; los alimentos no solo son requeridos por el cuerpo, sino que también juegan un papel importante en la calidad de vida. (Aswell, 2002). Un AF es el que contiene al menos un elemento nutriente o no nutriente positivo para una o varias funciones del organismo. (Tabla 1), mas allá del aspecto nutricional convencional, encaminado a incrementar el bienestar o disminuir el riesgo de enfermar. Un AF puede serlo para toda la población o solo para un grupo especifico. Tabla 1. Objetivos fundamentales de los alimentos funcionales. 10
  26. 26. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales Tabla 1. Objetivos fundamentales de los alimentos funcionales. La lista de alimentos funcionales abarca tanto alimentos no modificados (tabla 2) como los alimentos procesados industrialmente. La trasformación de un alimento en funcional puede realizarse eliminando algún componente nocivo (alérgeno, grasas saturadas), fortificándolo con sustancias beneficiosas (cereales con minerales y vitaminas, pan con fibra, leche con calcio). Mediante la adición de un elemento no presente de forma habitual en el mismo (aceite con antioxidantes), la sustitución de un compuesto perjudicial por otro deseable (grasas por inulina, leche desnatada con ácidos grasos omega 3) o a nivel de optimización de la biodisponibilidad/estabilidad. (Marriott 2000) Según (Aswell, 2002), los alimentos funcionales están basados en nutrientes específicos y componentes de alimentos que afectan positivamente específicas funciones en el cuerpo, de 11
  27. 27. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales hecho existen áreas importantes de la fisiología humana, relevante para los alimentos funcionales por ejemplo:  Defensas en contra de estrés oxidativo.  Fisiología gastrointestinal.  Fisiología cardiovascular.  Desarrollo temprano del cuerpo y crecimiento.  Regulación de procesos metabólicos básicos.  Desarrollo congnotivo mental.  Desempeño físico. Tabla 2. Efectos de algunos alimentos funcionales naturales de especie de relevancia. 12
  28. 28. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales Los FOS son más solubles en agua y poseen un sabor moderadamente dulce, los que los hace magníficos, para ser empleados como sustitutos de azúcar. En combinación con otros azúcares, pueden potenciar el sabor afrutado de ciertos productos. Contribuyen a la textura muestran propiedades humectantes, reducen la actividad de agua, y los efectos que sufren los productos, al someterse a cambios bruscos de temperatura, ya sean productos que se escaldan, hierven o congelan (Van et at., 1995) La inulina y sus derivados ofrecen múltiples usos como ingredientes en la formulación de productos (tabla 3) La inulina tiene propiedades similares a las del almidón, mientras que la oligofructosa presenta propiedades más parecidas a la sacarosa, (Rodríguez R, Jiménez A, Fernández J, Guillén R, Heredia A 2006). La inulina mejora la aceptabilidad de yogures elaborados con leche descremada, impartiéndole una mayor cremosidad, también actúa como agente espesante, retiene el agua y estabiliza geles (Kip P, Meyer D, Jellema R 2005). Los geles se pueden formar por efecto mecánico o térmico, y el obtenido por el segundo método presenta mejor textura y firmeza (Kim Y, Faqih M, Wang S. 2001).La capacidad de formar gel es determinante en su uso como sustituto de grasas en productos lácteos, untables, aderezos, salsas y otros productos en los que las propiedades funcionales que otorgan las grasas son indispensables para lograr los efectos sensoriales deseados por los consumidores (Franck, A. 2002). Es importante destacar que tanto la inulina como sus derivados fueron aceptados como ingredientes GRAS (generalmente reconocido como seguro) por el FDA desde 1992, lo cual indica que pueden usarse sin restricciones en formulaciones alimenticias incluso en las destinadas para infantes (Coussement P. 1999). 13
  29. 29. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales Tabla 3. Propiedades funcionales de la inulina y sus derivados. 2.3 Métodos para determinar fructanos. Para obtener confiabilidad en la selección de un método, es necesario que este haya sido utilizado las veces suficientes, en diferentes laboratorios. No siempre el método más nuevo es el mejor. (Prior, et al., 2005). Los técnicas fundamentales que determinan la obtención de fructanos son basados en 1) la cromatografía en capa fina (TLC, por sus siglas en ingles), 2) la cromatografía de alta eficiencia (HPLC, por sus siglas en ingles). Que nos dan resultados cualitativos y cuantificados. 14
  30. 30. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales El método de TLC es la técnica más utilizada en la química analítica, constituye una metodología imprescindible en estudios bioquímicos, estructurales etc. No solo utilizando como técnica de separación e identificación sino como método método preparatorio, incluso a escalas industriales. Dependiendo del tipo de la naturaleza de la fase estacionaria y de la fase móvil se pueden distinguir distintos tipos de cromatografía. 1 cromatografía solido – liquido. La fase estacionaria es un sólido y la móvil un liquido. 2.- cromatografía liquido- líquido. La fase estacionaria es un líquido anclado a un soporte solido. La cromatografía de intercambio iónico (cromatografía iónica) es un proceso que permite la separación de iones y moléculas polares basadas en las propiedades de carga de moléculas. Para la obtención de proteínas se basa en la técnica de diálisis que separa las proteínas de las moléculas de bajo peso molecular que procede de un extracto de un tejido o de un extracto celular. 2.4 Funciones fisiológicas de los fructanos. Los fructanos son sustancias a los que se les ha asociado una serie de funciones en pro de la salud, dentro de las cuales destacan su efecto benéfico como prebiótico, en la disponibilidad de minerales, el fortalecimiento de los mecanismos de defensa, el mejoramiento del metabolismo de líquidos, así como prevención de ciertas enfermedades. Efecto prebiótico. Se entiende por prebiótico a los componentes alimentarios no dirigibles que benefician a la salud del huésped por estimulación selectiva de crecimiento y/o actividad de una o un número limitado de baterías del colon. Dentro de las bacterias que son promovidas por la presencia de fructanos en el colon se encuentran las identificadas como bifidobacterias, las cuales realizan la fermentación de tales minerales. Durante el proceso de fermentación de ciertos fructanos del tipo oligofructosa o inulina se forman ácidos grasos de cadena corta y ácido láctico. Los ácidos grasos de cadena corta estimulan el crecimiento de las células de la mucosa colorrectal, retarda la atrofia de la mucosa y disminuye el riesgo de trasformación maligna del colon. 15
  31. 31. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales Disponibilidad de minerales. Algunos constituyentes de los alimentos se consideran promotores potenciales de la absorción mineral, dentro de los que destacan lo oligosacáridos no digeribles, especialmente los fructanos tipo inulina. Dentro de los minerales que se absorben de mejor manera en presencia de fructanos destacan el calcio y el magnesio. Ello a su vez tiene una consecuencia benéfica en la salud de los huesos, especialmente en lo relativo a su mineralización, densidad y absorción. Mecanismos de defensa. Los fructanos afectan benéficamente una serie de funciones gastrointestinales, gracias a la modulación de su estructura, de la composición y de varias actividades de la mucosa y de la microflora. Se sabe también que afectan el epitelio intestinal mejorando la morfología de su mucosa, la composición de las mucinas, así como la resistencia a la colonización y las funciones químicas y enzimáticas del tracto gastrointestinal, reduciendo el riesgo de enfermedades relacionadas a la disfunción de la defensa gastrointestinal. Metabolismo de lípidos. Diversos estudios han demostrado que los fructanos tipo inulina afectan el metabolismo de lípidos, particularmente a través de la disminución de la trigliceridemia y colesterinemia. Prevención de enfermedades. Las principales enfermedades que se previenen por los fructanos tipo inulinas son: a) mitigación de estreñimiento, b) supresión de diarreas, especialmente las asociadas a infecciones intestinales, c) reducción del riesgo de osteoporosis, d) reducción de riesgo a la arterosclerosis cardiovascular asociada a dislipidemias, especialmente a hipertrigliceridemia y a la resistencia de insulina., e) reducción de riesgo a la obesidad y a la posibilidad de contraer diabetes tipo 2, ambas enfermedades asociadas a la resistencia de insulina, f) síndrome del intestino irritable, g) cáncer de colon inducido químicamente.( Ulloa. A., Espinosa 2010) 16
  32. 32. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales 2.5 Aspectos generales de Allium cepa L. Nombre común: cebolla Nombre científico: Allium cepa L. Anatomía. El tallo de la planta de cebolla es un disco basal que se encuentra por debajo de la superficie del suelo. En la parte superior y central de este disco se encuentra el meristemo apical, donde se inician las hojas, en forma opuesta y alternada, de tal manera que las hojas emergen en dos filas a 180º una de otra. Las hojas tienen dos partes bien diferenciadas: la vaina y la lámina. Las vainas de las hojas rodean completamente el punto de crecimiento formando un tubo que se proyecta desde el tallo y encierra en su interior a las hojas más jóvenes. Toda esta estructura se denomina ‘falso tallo’. En la unión de la vaina y lámina dela hoja hay una abertura por la cual sale la lámina de la siguiente hoja. La lámina es un tubo hueco cerrado en la punta, ligeramente achatado en su cara superior (Figura 2). Figura 2. Representación esquemática de una planta de cebolla en la etapa de expansión de las hojas, previo al inicio de la bulbificación (adaptado de Jones y Mann, 1963). 17
  33. 33. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales El bulbo es un órgano de reserva formado por las vainas de las hojas más jóvenes que se hinchan al aumentar el tamaño de sus células por la acumulación de carbohidratos de reserva (principalmente fructanos). Cuando comienza la acumulación de reservas en las vainas de las hojas jóvenes, las láminas dejan de crecer y las últimas hojas nunca llegan a formar su lámina. Cuando el bulbo comienza a madurar, las vainas de las 3 o 4 hojas viejas se deshidratan y forman una cubierta protectora que se cierra en la parte superior del bulbo e impide su deshidratación (Figura 3) Bajo las condiciones ambientales adecuadas el meristemo apical (y también otras yemas axilares) se diferencia en una yema floral dando origen a una inflorescencia. La inflorescencia es una umbela formada por hasta 600 flores y está ubicada en el extremo de un escapo verde y hueco que puede llegar a más de 1 m de largo. De un mismo bulbo pueden formarse varias inflorescencias (De Mason, 1990). Figura 3. Representación esquemática de bulbo de cebolla. Descripción botánica. La cebolla (Allium cepa L.), pertenece a la clase de las Monocotiledóneas, familia Alliaceae, genero Allium (HANELT, 1990). Es una planta bianual, que, en condiciones normales, se cultiva como anual para recolectar sus bulbos y, cuando se persigue la obtención de semillas, como bianual (MAROTO, 1994). La cebolla es originaria de Asia Central, sin embargo, su domesticación se realizó en varios lugares del mundo independientemente. Actualmente se produce con éxito en climas templados y secos, e incluso, en zonas con características subtropicales, no teniendo éxito 18
  34. 34. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales su producción en condiciones con exceso de humedad y altas temperaturas (Depresto et al., 1992, citado por Castillo, 1999). La cebolla se adapta a diferentes tipos de temperatura; desarrolla bien en climas cálidos, templados y fríos, comprendidos entre los 50 y 300 metros de altura; produciéndose mejor en altitudes arriba de los 900 msnm., con ambiente seco y luminoso; temperatura ambiental entre los 18 y los 25 grados centígrados. Abajo de los 18 grados centígrados los bulbos no desarrollan bien obteniéndose únicamente crecimiento de los tallos, Es fotoperiódica, siendo las de días cortos que desarrollan el bulbo con 10 a 12 horas luz. 2.6 Etapas fenológicas de Allium cepa L. La primera fase de crecimiento herbáceo se inicia con la germinación, formándose una planta provista de un tallo muy cortó o disco, en el que se insertan las raíces y en el que existe un meristema que origina progresivamente hojas. En esta fase, la planta desarrolla ampliamente su sistema radicular y foliar (Maroto, 1994). La segunda fase corresponde a la formación de bulbos, ésta se inicia una vez que cesa la formación de follaje, y la planta inicia la movilización y acumulación de reservas en la base de las hojas, esto es ocasionado por el estímulo de días largos (Komochi, 1990). Paralelamente, se produce una síntesis muy intensa de glucosa y fructosa que van siendo acumulados en el bulbo (Maroto, 1994). La tercera fase o de reposo vegetativo es en la que el bulbo maduro está en latencia y la planta no se desarrolla. (Maroto, 1994). La cuarta fase se produce en el segundo año del cultivo, comienza con la floración y termina con la producción de semillas. Se produce una vez lograda la inducción floral por efecto de bajas temperaturas. Durante el desarrollo floral, el ápice comienza a elongarse y a 19
  35. 35. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales dar forma al escapo floral. El escapo es hueco, cilíndrico y más grueso en su parte media. En el extremo, se genera una umbela con pétalos blanco azulados (Castillo, 1999). La cebolla tiene un ciclo de vida bi-anual. En la primera estación de crecimiento se forma el bulbo (fase vegetativa) y en la segunda se forman las inflorescencias y se produce semilla botánica (fase reproductiva), la cual es el modo de reproducción de esta especie (Figura 4). En nuestro país, el ciclo se inicia en otoño y termina en primavera o inicios del verano. En regiones de latitudes más altas, con inviernos muy fríos y veranos frescos, el ciclo se inicia con la primavera y termina a mediados o fines del verano. Figura 4. Esquema del ciclo normal de desarrollo de la cebolla. (Dogliotti 2011) 20
  36. 36. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales CAPITULO III MATERIALES Y MÉTODOS. 3.1 Reactivos  Acetato de sodio anhydrous ( Fluka Analytical)  Acido clorhídrico ( J.T Baker)  Acido fosfórico  Agua destilada ( laboratorio)  Agua ultra pura ( Tedia)  Alcohol grado reactivo ( J.T Baker)  Anilina  Butanol ( Sigma – Aldrich)  Difenilamina  Fructosa ( Laboratorio)  Hidróxido de sodio ( Sigma – Aldrich )  Inulina de chicoria  Kestosa  Nistosa  Propanol ( Sigma – Aldrich)  Sacarosa  Vinagre ( comercial) 21
  37. 37. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales 3.2 Equipos  Balanza analítica ( OHAUS GA 200)  Cámara para electroforesis  Campana de extracción ( NOVATECH m- CE-120)  Centrifuga refrigerada ( Sorvall )  Extractor (moulinex)  Hojas de TLC silica gel ( 60F2 s4)  Horno de vacio ( M-lab-line m.3618 )  HPLC  Membrana para diálisis.  Parrila de calentamiento con agitación ( M- VELPS SCIENTIFICA )  Parrilla de calentamiento ( IKA C – MAG HS7)  Potenciómetro ( HANNA Istruments)  Refractómetro ( KRUSS OPTRONIC DR201- 95)  Refrigerador ( M- Revco m-ult2586-5-D35)  Spray dryer (M. Buchy)  Termómetro  Vortex ( DAIGGER Genie 2) 22
  38. 38. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales 3.3 Adecuación de hortalizas en invernadero. Con el fin de obtener el material biológico de Allium cepa L. Las semillas se sembraron en charolas el 10 de abril empleando como sustrato tierra preparada para la germinación la cual ocurrió el 14 de abril, en invernadero con temperatura 19 a 35 ºC y humedad relativa de 19-80 % y 57,000 lux. Variedad: Cebolla globo. Factores: Tipo de suelo: tierra negra y tierra café. Densidad de siembra: 28 y 40 ppm2. Variables de respuesta: Bulbo: Grosor, altura y peso. Tallo: Peso y longitud La siembra se realizo en el invernadero (Figura 5) 3 C 1 1 N 1 2 C 6 N 7 C 1 3 C Figura 5. Siembra de Allium cepa L. en inverdadero. 23
  39. 39. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales La densidad de siembra varió entre las camas (tabla 4) Ya que cada una se dividió en secciones por metro cuadrado. Tabla 4. Densidad de siembra en invernadero de Allium cepa L. Cama 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 3C 28 40 24 40 40 6N 34 39 37 39 36 38 38 40 37 7C 41 11N 40 40 40 12C 30 13N 20 20 20 20 39 20 16 20 20 24 20 11 12 16 20 24
  40. 40. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales Los muestreos y análisis (Tabla 5) Tabla 5. Muestreos de Allium cepa L. en invernadero.(*) Análisis que se le hicieron a cada etapa fenológica. Etapa Fecha Bulbo HOJA carbohidratos proteínas * * fenológica altura Trasplanté peso diámetro tallo longitud 12, 28 y 30-mayo Desarrollo y 12-jun crecimiento de hoja. Inicio de 17-jun bulbificación. Desarrollo y * * 26-jul crecimiento de * * * * * * * SOLO SE bulbo ANALIZÓ LA CAMA 13 N Madurez 1-ago * * Dormancia 17-ago * * Brotación. 28-ago * * * * * * * 25
  41. 41. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales 3.4 Tratamiento a compuestos sulfurados. Para reducir la presencia de compuestos sulfurados en extractos de cebolla, se realizo un diseño factorial con dos factores: vinagre y limón y 3 niveles: dilución 1:10, 1:20 y 1:30. Sin repetición. Variables de respuesta: evaluación sensorial: intensidad de irritación al analista. Los tratamientos a los que fueron sometidos los bulbos de cebolla ( tabla 6) divididos en 4 con volumen suficiente para cubrirla, se dejo en reposo durante 2 h a 4°C. Tabla 6. Tratamientos para reducir la presencia de compuestos sulfurados en cebolla. Factor Limón Tratamientos A B C Vinagre D E F 3.5 Extracción de jugo de cebolla. La cebolla se acondicionó con vinagre al 30% durante 2 h, posteriormente se extrajo empleando 250 g de material vegetal y 1000 ml de agua destilada con pH 4.3. Emplear blender y posteriormente extraer a 85 º C durante 45 minutos. Posteriormente centrifugar a 5000 rpm durante 16 minutos y temperatura de 10-20 ºC. Adicionar alcohol al 30% para precipitación de proteínas dejar en reposo toda la noche a 4 ºC. Posteriormente, centrifugar y evaporar el alcohol en BM a 85 ºC durante 45 minutos. 3.6. Secado por aspersión. El extracto se proceso en un secador por aspersión (Spray Dryer. M-Buchy), midiéndole parámetros como los grados brix y pH. Se acondiciono con los parámetros (tabla 7). 26
  42. 42. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales Tabla 7. Parámetros del secado por aspersión. Temperatura de entrada Temperatura real de entrada Temperatura de salida % de remoción de aire 200 200 113 80, 70, 60 12, 0.05% Alimentación litros/minuto 3.7 Preparación de solvente para placa. Se realizo una solución de solventes (tabla 8) para poder correr la placa de silica gel, en la cámara para electroforesis. Tabla 8. Preparación de solvente para placa de TLC. Solvente Mililitros Propanol 24 Butanol 6 Agua 8 Total de mililitros. 38 3.8 Preparación de la solución reveladora. Para la identificación de fructanos se realizo una solución de revelado pesando 1.16 gr de definilamina al 4% adicionando 25 ml de agua ultra pura, posteriormente se midió 1ml de anilina al 4 % y se agrego 25 ml de acetona. La mezcla de definilamina y anilina fue 27
  43. 43. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales homogeneizada con 5 ml de acido fosfórico al 85%. Posteriormente la mezcla mantuvo en agitación por un tiempo de 10 min. 3.9 Preparación de buffer de acetato de sodio. Para la preparación del buffer de acetato de sodio al 1N se utilizaron 82 g de acetato de sodio ( CH3COONa), adicionando1000ml de agua destilada, disolver y aforar. Para ajustar a un pH de 5.5 se tomaron 10 ml de buffer de acetato de sodio al 1N y se adiciono 90 ml de agua destilada para obtener un buffer al 0.1 N. 3.10 Obtención de curva estándar de HPLC. Para obtener una curva de calibración para el HPLC y poder cuantificar los fructanos , se realizaron cálculos basados en mg/ml para cada concentración de inulina de chicoria, sacarosa, glucosa y fructosa. (Tabla 9) Tabla 9. Cálculos para calibración de curva estándar para HPLC. Carbohidratos 3 mg/ml y agua 6 mg/ml 9 mg/ml 12mg/ml 15 mg/ml Inulina chicoria de 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 Sacarosa 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 Glucosa 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 Fructosa 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 Agua 4.8 3-6 2.4 1.2 - Mililitros totales. 6ml 6ml 6ml 6ml 6ml 28
  44. 44. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales Los datos obtenidos por el HPLC fueron procesados a través de Microsoft Exel 2007. Con lo cual se obtuvo la curva de calibración para el HPLC. 3.11 Determinación de fructanos por la técnica de TLC Para esta determinación se utilizaron placas de silica gel, se procede a medir, dependiendo el numero de muestras a realizar, una vez medida, se corta con un bisturí. Se mide 1cm en la parte inferior de la placa y se pone un margen de referencia a donde llegara nuestro solvente. Se deja 1cm por cada extremo de la placa y por cada muestra medir 0.8 cm y marcar. En la parte superior se marcaran los primeros 3, 5, 7 cm para tener referencia la corrida de la placa en el solvente. Una vez ya cortada y medida la placa de TLC. Se adicionara el solvente (propanol, butanol, agua) aproximadamente a 0.5 cm de la cámara y se dejara saturar por 15 min. Cerrando completamente la cámara. Después de este tiempo se introducirá la placa de TLC y se dejara correr en el primer cm marcado, una vez corrida se sacara para poder secarse a temperatura ambiente, así mismo se hará por cada corrida marcada con cada cm. Una vez terminado se dejara correr completamente y se dejara secar, para posterirmente rosear la placa con la solución de revelado y una vez seca se introducirá al horno a una temperatura de 90°C por tiempos de 5, 10, 15 y 20 dependiendo si se observan ya la presencia de fructanos en la placa de TLC. Esto se realizo también para observar fructanos en las etapas fenológicas e intercambio ionico.se realizo ensayo por duplicado. 3.12 Cuantificación de fructanos por la técnica de HPLC La técnica de HPLC se emplea para determinar las cantidades relativas de los diferentes compuestos que se encuentren presentes (glucosa, fructosa, sacarosa), pero no es muy preciso para compuestos de grado de polimerización mayores a 5 (GP > 5). La cuantificación de fructanos de la muestra de cebolla, fue tomar 1ml de extracto de cebolla centrifugado y adicionando 10 ml de agua destilada. La mezcla se homogenizo en un vortex. Ajustar a un PH de 7. Posteriormente de filtro y se colocaron en viales, para poder ser leídos en el HPLC, corriendo primero un estándar de (3, 6, 9, 12 15 mg/ml). 29
  45. 45. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales 3.13 Cuantificación de fructanos por intercambio iónico Se extrajo el jugo de cebolla como lo marca el punto 3.5. Posteriormente el extracto se proceso con cada resina (figura 6) diviendola en 4 muestras. Se midieron parámetros como los grados brix, pH, y conductividad eléctrica. Se tomo tomó 1ml de cada muestra(A, B, C,D) y se homogenizo en 10 ml de agua destilada en un vortex, se ajusto a pH 7 y se filtraron para poder ser leídos en el HPLC. De la mismas muestras (A, B, C, D) se tomaron 5ml de cada muestra y se llevaron a -80 °C por un tiempo de 24 horas. Posteriormente se liofilizo cada muestra. Para el análisis en por 1mg de polvo liofilizado se adionaron 100µl se homogenizaron en un vortex. Y se tomo 1µl para TLC. Figura 6. Intercambio iónico en Allium cepa L. 30
  46. 46. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales 3.14 Determinación de proteínas Se limpiaron y separaron los bulbos de las hojas para procesar por separado. Se pesó el material vegetal se trituro con el mortero y se realizó extracción con buffer de acetato de sodio 0.1N con pH 5.5 durante 2h a temperatura de 5 ºC (nota: por cada 20g de material vegetal se adicionaron 100ml de buffer). Posteriormente se centrifugó a 5000rpm durante 16 minutos y rango de temperatura de 16 a 20 ºC. Se realizó diálisis con 3 cambios de agua durante 2 h. y se proceso por TLC y HPLC. 3.15 Actividad enzimática Posteriormente a cada tubo se le adicionaron 5ml de sacarosa 200mM + 1 ml de buffer de pH 5.5 al 0.1 N + 1 ml de extracto. Se incubó a 30 º C durante 24 h. se realizo por duplicado para cada muestra. 3.16 Determinación de carbohidratos Se pesó la muestra y se trató con vinagre al 30%, posteriormente se trituró y agregó agua en proporción 1:4. Se extrajo a BM a 80ºC durante 40 minutos. Se centrifugó y el sobrenadante se procesó por TLC y HPLC. 31
  47. 47. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales CAPITULO IV APLICACIÓN Y RESULTADOS 4.1 Compuestos sulfurados En el diseño factorial ver (tabla 5) el mejor resultado fue vinagre dil. 1:30. 4.2 Muestreo de hortalizas en invernadero En las figuras 7, 8, 9, 10 y 11 se muestran los resultados obtenidos de las variables de respuesta en Allium cepa L. en invernadero. A) Figura 7. Relacion de peso en bulbo de cebolla en las diferentes camas en inverdadero. 32
  48. 48. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales B) Figura 8. Relacion de longitud de hojas cebolla en las diferentes camas en inverdadero. C) Figura 9. Relación de diámetro de bulbo de cebolla en las diferentes camas en invernadero. 33
  49. 49. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales D) Figura 10. Relación de tallo de bulbo de cebolla en las diferentes camas en invernadero. E) Figura 11. Relación de altura de bulbo de cebolla en las diferentes camas en invernadero. 34
  50. 50. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales Al observar los resultados obtenidos se realizo una comparación de medias (Figura 11) para la variable de peso y se obtuvo en el tratamiento 13N (tierra negra, densidad de siembra de 20 plantas por m², existe diferencia estadísticamente significativa con un nivel de confianza del 95 %. Figura 12. Comparación de la variable de peso en las diferentes camas en invernadero. 4.3 Curva estándar de calibración para HPLC En la figura 13, 14,15 y 16. Se muestra los resultados obtenidos realizados a diferente concentración de cada estándar (fructanos, sacarosa, glucosa, glucosa) que va de un rango de concentración de 3 a 15 mg/ml. Donde “x” es la concentración en mg/ml, y “y” es el área de cada carbohidrato. El coeficiente de correlación (R²), nos indica que la variable independiente (X) y la dependiente (Y). 35
  51. 51. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales A) Figura 13. Curva estándar de fructanos. La concentración de fructanos está dado en mg/ml. B) Figura 14. Curva estandar de glucosa. La concentracion de glucosa está dado en mg/ml. 36
  52. 52. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales C) Figura 15. Curva estándar de sacarosa. La concentración de sacarosa está dado en mg/ml. D) Figura 16. Curva estándar de fructosa. La concentración de fructosa esta dado en mg/ml. 37
  53. 53. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales 4.4 Identificación y cuantificación de fructanos por intercambio iónico En la figura 17 se muestra la identificación de fructanos por la técnica de cromatografía en capa fina (TLC) en intercambio iónico de Allium cepa L. observándose actividad de inulinas [ β( 2, 1)] en todas las muestras, como también la presencia de los demás carbohidratos excepto de la fructosa. . G F S K N Fructanos E1 A B E2 C D Figura 17. Análisis de TLC de resinas en intercambio iónico en Allium cepa L. el carril 1 y 4 corresponde a una mezcla de estándares que contiene fructosa (F), kestosa (K), nistosa (N), glucosa (G) y sacarosa (S) .Los carriles 2, 3,5 y 6 corresponden a los extractos pasados por las resinas.(A) extracto sin pasar por resina, (B) resina de anionico fuerte, (C) resina cationica y (D) resina débil. Cuantificación de fructanos. En la figura 18. Se muestran los cromatogramas del intercambio iónico de los extractos de Allium cepa L. 38
  54. 54. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales Figura 18. Cromatogramas de HPLC de extracto de Allium cepa L. por intercambio iónico. 39
  55. 55. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales La cuantificación de fructanos de los extractos (A, B, C, D) pasados por intercambio iónico. (Tabla 10.) Tabla 10. Cuantificación de fructanos en intercambio iónico de extractos de Allium cepa L. TRATAMIENTO FRUCTANO SACAROSA GLUCOSA FRUCTOSA Mg/ml Mg/ml Mg/ml Mg/ml A 4.13 1.84 1.57 -0.46 B 2.27 0.73 2.46 2.88 C 2.58 2.23 2.07 2.04 D -0.04 -0.19 1.11 1.12 4.5 Identificación y Cuantificación de proteínas en etapas fenológicas de Allium cepa L. La identificación de proteínas en las diferentes etapas fenológicas de Allium cepa L. en invernadero se muestra en la placa de TLC (figura 19). En las primeras etapas de desarrollo y crecimiento de hoja, inicio de bulbificacion y desarrollo y crecimiento de bulbo, encontramos la presencia de fructanos a diferencia de las etapas de madurez, dormancia y Brotación con poca presencia de fructanos. En todas las etapas están presentes la glucosa y la fructosa. 40
  56. 56. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales G F K N FRUCTANOS A1 A2 B1 B2 C1 C2 M E D1 D2 E1 E2 F1 F2 Figura 19. Análisis de TLC de las diferentes etapas fenológicas de Allium cepa L. para proteínas. El carril 1 y 2 (A1, A2) representa la etapa de desarrollo y crecimiento de bulbo. El carril 3 y 4 (B1, B2) representa la etapa de inicio y bulbificacion. El carril 5 y 6(C1, C2) representa la etapa de desarrollo y crecimiento del bulbo. El carril 7 representa una mezcla de estándares que contiene: glucosa (G), fructosa (F), kestosa (K) y nistosa (N). El carril 8 y 9 (D1, D2) representa la etapa de madures. El carril 10 y 11 (E1, E2) representa la etapa de dormancia. El carril 12 y 13 (F1, F2) representa la etapa de Brotación. 41
  57. 57. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales Cuantificación de fructanos en las etapas fenológicas de Allium cepa L. La cuantificación de fructanos en las etapas fenológicas de Allium cepa L.se representa por los cromatogramas del HPLC (figura 20.) Figura 20. Cromatogramas de proteínas en etapas fenológicas de Allium cepa L. El porcentaje de fructanos se muestran en la figura 21. 42
  58. 58. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales Figura 21. Cuantificacion de fructanos en etapas fenologicas de Allium cepa L. 4.6 Identificación y cuantificación de carbohidratos en etapas fenológicas de Allium cepa L. La identificación de carbohidratos en las diferentes etapas fenológicas de Allium cepa L. en invernadero se muestra en la placa de TLC (figura 22). En las primeras etapas de desarrollo y crecimiento de hoja, inicio de bulbificacion y desarrollo y crecimiento de bulbo, no encontramos la presencia de fructanos a diferencia de las etapas de madurez, dormancia y Brotación la presencia de fructanos. En todas las etapas están presentes la glucosa y la fructosa. 43
  59. 59. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales G S F 1 F PD4 K PD5 N PD6 PD15 E1 A1 A2 B1 B2 C1 C2 E2 D1 D2 E1 E2 F1 F2 E2 Figura 21. Análisis de TLC de las diferentes etapas fenológicas de Allium cepa L. para la identificación de carbohidratos. El carril 2 y 3 (A1, A2) representa la etapa de desarrollo y crecimiento de hoja. El carril 4 y 5 (B1, B2) representa la etapa de inicio y bulbificacion. El carril 5 y 6(C1, C2) representa la etapa de desarrollo y crecimiento del bulbo. El carril 1,8 y15 representa una mezcla de estándares que contiene: glucosa (G), fructosa (F), kestosa (K) y nistosa (N). El carril 9 y 10 (D1, D2) representa la etapa de madures. El carril 11 y 12 (E1, E2) representa la etapa de dormancia. El carril 13 y 14 (F1, F2) representa la etapa de Brotación. 1,1-kestose; DP4, DP5, and DP15. 44
  60. 60. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales Cuantificación de fructanos La cuantificación de fructanos en las etapas fenológicas de Allium cepa L.se representa por los cromatogramas del HPLC (figura 23) podemos observar que la cuantificación de fructanos se presenta en las etapas de desarrollo y crecimiento de hoja, inicio y bulbificacio, dormancia y brotacion.(figura 24). Figura 23. Cromatogramas de carbohidratos en etapas fenologicas de Allium cepa L. 45
  61. 61. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales La cantidad de fructanos se precenta en la figura 24. Figura 24. Cantidad de fructanos en etapas fenologicas de allium cepa. 46
  62. 62. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales CAPITULO V DISCUCIÓN La mayoría de las plantas almacenan almidón o sacarosa como carbohidratos de reserva , pero aproximadamente el 15 % de todos los fructanos de especies de plantas con flores son polímeros lineales y ramificados de fructosa entre las plantas importantes se encuentran por ejemplo cereales( cebada, trigo y avena) hortalizas ( por ejemplo , la chicoria, cebolla y lechuga). (Hendry y Wallace, 1993) Los fructanos aislado a partir de estas plantas tienen una variedad de aplicacion. El tracto digestivo humano no contiene enzimas capaces para degradar los fructanos, por lo tanto, hay un fuerte interés desde la industria alimentaria para usarlos como ingredientes de alimentos bajos en calorías. (Hendry y Wallace, 1993;. Pilon-Smits et al, 1995). Estudios realizados en la extracción de de inulinas para su aplicación en alimentos funcionales, la extracción de fructanos se realiza en dos pasos. El primero se usa agua hirviendo, con agitación continua a pH 6,6 – 8,0 y se completa la extracción en un segundo paso , la solucion se mantiene en agitación a 80 °C por un tiempo de 10 min. Se deja reposar hasta alcanzar la temperatura ambiente. Se toma una alícuota (aprox 50 g) para ser sometida a la primera determinación cromatografíca de azúcares (glucosa, fructosa y sacarosa) a partir de la cual, y mediante cálculos analíticos, se obtendrá la cantidad de fructosa libre (Ff) y de sacarosa (S).(Lorena madrigal 2007) Con esto puedo inferir que posiblemente no fue posible recuperar el volumen deseado (g/ base seca) de Allium cepa L. al momento de la aspersión. En este mismo estudio se demostró que la cantidad de (g/100g base seca) de inulinas da como resultado a la cebolla (Allium cepa L.) en cuarto lugar con el 48 g de base seca. Siendo el primer lugar la pataca (Helianthus tuberosus) después de la achicoria (Cichorium intybus). 47
  63. 63. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales Por otra parte estudios realizados a Allium cepa L. en análisis bioquímicos en acumulación en carbohidratos atraves de cromatografía en capa fina ( TLC) revelaron la acumulación de fructanos incluyendo 1- kestosa y oligosacáridos con un grado de polimeracion (PD) >4 del invierno a la primavera. De acuerdo a nuestros análisis en las etapas fenológicas (figura 23) de Allium cepa L. la mayor cantidad de (DP) de fructanos se presentó una mayor cantidad de fructanos en el mes de agosto que corresponden ( etapa de madures, dormancia y la etapa de Brotación.) 48
  64. 64. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales CAPÍTULO VI CONCLUCIÓN  Realizada la extracción de fructanos en sus diferentes etapas fenológicas se mostro que en las últimas etapas poseen un mayor porcentaje de fructanos.  El rango de temperatura y el tiempo influyen en la actividad enzimática, para la obtención de fructanos en cebolla ( Allium cepa L.)  Para la obtención de fructanos incluye en general de tres etapas: extracción y preparación de las muestras, medición de sus parámetros y expresión de los resultados.  La inulina es un compuesto que se encuentra de manera natural en muchas especies vegetales y que actualmente se procede a escala industrial por extracción a partir de bulbos de Allium cepa L. 49
  65. 65. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales CAPÍTULO VII RECOMENDACIONES  los resultados obtenidos de los compuestos sulfurados podrían ser mejores si se probara dejar más tiempo en reposo a la cebolla y probando con diferentes temperaturas.  Para obtener mejor resultados en el secado por aspersión podrían utilizarse el método de sólidos totales para saber realmente que cantidad en g/ml son de nuestra muestra.  Tomar en cuenta la posibilidad que afecte la temperatura de almacenamiento de los bulbos de cebolla para la obtención de fructanos.  Para la determinación de fructanos se podría utilizar el método de AOAC 997.08 50
  66. 66. Obtención de fructanos en las diferentes etapas fenológicas del cultivo de cebolla (Allium cepa l.) en invernadero, para su uso en alimentos funcionales CAPÍTULO VII REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 1. Aljaro, A. 2001a. Estado tecnológico presente de la cebolla en Chile. In: Aljaro, A. ed. Segundo curso taller de cebollas. Santiago, agosto de 2001. pp13- 22. 2. Ariga, T., S. Oshiba y T. Tamada. 1981. Platelet aggregation inhibitor in garlic. Lancet 2:150. 3. Augusti, K.T. 1990. Therapeutic and medicinal values of onions and garlic. In: H. D. Rabinowitch y J. L. Brewster (eds.). Vol. III. Onions and Allied Crops. CRC Press, Boca Raton, Florida. p. 94-108. 4. Brewster, J.L. (eds). Onions and Allied Crops, Vol. 1. CRC Press, Boca Raton, Florida, pp.27–51. 5. CASTILLO, H. 1999. Aspectos ecofisiológicos del cultivo de cebolla. In: Tapia, M. eds. El Cultivo de la Cebolla. Santiago, Universidad de Chile pp. 19-24. 6. Coussement P. Inulin and Oligofructosa: safe intakes and legal status. J Nutr 1999; 129: 1412-1417 7. de Mason, D.A. 1990. Morphology and anatomy of Allium. In: Rabinowitch, H.D. and Brewster, J.L. (eds). Onions and Allied Crops, Vol. 1. CRC Press, Boca Raton, Florida, pp. 27–51 8. Dogliotti S., Colnago P., Curso de Fisiología de los Cultivos – Módulo Horticultura Facultad de Agronomía – Universidad de la República., Bases Fisiológicas del crecimiento y desarrollo de los principales cultivos hortícolas. Marzo (2011) 39-58 51
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