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CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y DE ESTUDIOS
          AVANZADOS DEL I.P.N. Unidad – Irapuato.


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Receptores          Segundos                 Cinasas dependientes     Reguladores
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      PRESENTES EN PLANTAS

 Respuesta a estímulos luminosos
   PHY y Fototropina son cina...
H+
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1. Primer
mensajero                              P          6. Cinasa
Evocador
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CLASIFICACIÓN DE LAS FOSFATASAS

 Fosfatasas de Ser/Thr
 Familia PPP             PP1: Levaduras, plantas y animales
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DOMINIOS ESTRUCTURALES DE LAS
     FOSFATASAS DE Ser/Thr
Familia PPP                           Dominio catalítico
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SUBUNIDADES Y REGULACIÓN DE LA
         FAMILIA PPP
PP1         PP1c        R                                PP1c        R...
DOMINIOS ESTRUCTURALES DE LAS
       FOSFATASAS DE Tyr
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N-terminal
                Central a3-helix
                                   Andersen et al Mol. Cell. Biol. 2001




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Fosfatasas en Arabidopsis


112 fosfatasas:
       PP2C (69)
       PTP (1)
       Ser/Thr familia PPP (23)
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LOCALIZACIÓN DE LAS
              FOSFATASAS ÁCIDAS
Las fosfatasas ácidas se suelen encontrar en casi todos los compartimi...
FUNCIÓN DE LAS FOSFATASAS ÁCIDAS



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FOSFATASAS ÁCIDAS PURPURAS (PAPs)


                Tipo I
                          polipéptidos de aproximadamente 35 kD...
DESFOSFORILACIÓN DE PROTEÍNAS DE LA
  MEMBRANA PLASMÁTICA DE BETABEL
                                Tiempo (min)
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OBJETIVO GENERAL




 La identificación, purificación y caracterización
 bioquímica de algunas fosfatasas presentes en la
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OBJETIVOS PARTICULARES

Purificar a homogeneidad una o varias fosfatasas presentes en
la membrana plasmática de betabel.

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PURIFICACIÓN DE LA FOSFATASA DE 95 kDa

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Pasos                Proteína Act. total       Act. Especifica      Purificación   Rendimiento
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CARACTERIZACIÓN DE LA FOSFATASA
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INHIBIDORES Y ACTIVADORES DE LA
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CONCLUSIONES I




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PURIFICACIÓN DE LAS FOSFATASAS
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CARACTERIZACIÓN DE LA FOSFATASA
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   Con n-octilglucósido se purificaron 2 fosfatasas de 82 y 36 kDa

    La fosfatasa de 82 kDa es una f...
ACTIVIDAD DE FOSFATASA EN VACUOLAS
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CONCLUSIONES IV


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   EN BETABELES CULTIVADOS BAJO
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CONCLUSIONES V




   Se observó un aumento en la actividad de fosfatasa en las
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CONCLUSIONES FINALES


Se purificaron 3 fosfatasas ácidas de la membrana plasmática de betabel
                  de 82, 36...
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Presentación de mi examen final para obtener el grado de Doctor en Ciencias con Especialidad en Biotecnología y Bioquímica de Plantas

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  1. 1. CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y DE ESTUDIOS AVANZADOS DEL I.P.N. Unidad – Irapuato. PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA DE LAS FOSFATASAS ÁCIDAS DE MEMBRANA PLASMÁTICA DE BETABEL (Beta vulgaris L.) M. en C. Eduardo Armienta Aldana Asesor de tesis: Dr. Luis E. González de la Vara Sinodales: Dra. Marina Gavilanes Ruiz Dr. César Ordorica Falomir Dr. John Paul Délano Frier Depto. Biotecnología y Bioquímica Dr. Plinio Guzmán Villate Lab. Bionergética y Biomembranas Dr. Neftalí Ochoa Alejo
  2. 2. Receptores Segundos Cinasas dependientes Reguladores mensajeros de segundos mensajeros hacia abajo Membrana Plasmática Tipo I: Canales iónicos Ca2+ Cinasas Ca2+-depend. Cinasas Temperatura Calmodulina-depend. ABA Tipo II: Receptores acoplados MAP a proteínas G KKK Citocininas Proteína MAP Giberelinas Uniendo GTP KK MAP Regulación Luz K hacia Patógenos abajo IAA Tipo III: Cinasas receptores Ser/Thr MAP KKK Ser/Thr cinasas MAP Oligogalacturonidos KK Histidina cinasa MAP Etileno K H D Citocininas H D Taylor y Whitelaw, 2001
  3. 3. VÍAS DE TRANSDUCCIÓN DE SEÑALES PRESENTES EN PLANTAS Respuesta a estímulos luminosos PHY y Fototropina son cinasas Respuesta a hormonas CTR1 es cinasa, ABI1 y ABI2 son fosfatasas Regulación del ciclo celular CDK es cinasa y cdc25 es fosfatasa Respuesta a patógenos Xa21 es cinasa Interacciones célula-célula SRK1 y CLV1 son cinasas
  4. 4. H+ 5. H+-ATPasa 1. Primer mensajero P 6. Cinasa Evocador 4. Efector Pi H+ Fosfatasa 3. Proteína G 2. Receptor Vera Estrella et al. 1994
  5. 5. PROCESO DE FOSFORILACIÓN/DESFOSFORILACIÓN ATP ADP Proteínas cinasas Ser Ser Proteína Thr Proteína Thr P Tyr Tyr Proteínas fosfatasas Pi
  6. 6. CLASIFICACIÓN DE LAS FOSFATASAS Fosfatasas de Ser/Thr Familia PPP PP1: Levaduras, plantas y animales PP2A: Levaduras plantas y animales PP2B: Levaduras, plantas(?) y animales Nuevas: PP4, PP5, PP6, RdgC/PP7 (levaduras, plantas(?) y animales Familia PPM PP2C: Levaduras, animales y plantas (ej. ABI, KAPP, MP2C) Fosfatasas de Tyr Específicas de Tyr Parecidas a receptores: animales Intracelulares: Levaduras, animales y plantas (ej. AtPTP1) VH1 Especificidad dual MKPs: Levaduras, animales y plantas (ej. AtDsPTP1) CDC25: Levaduras, animales y plantas(?) PTEN Luan, 2003
  7. 7. DOMINIOS ESTRUCTURALES DE LAS FOSFATASAS DE Ser/Thr Familia PPP Dominio catalítico PP1 PP2A, PP4, PP6 PP5 Motivos TPR PP2B Unión a CnB Unión a CaM RdgC/PP7 Unión a Ca2+ Familia PPM Dominio catalítico PP2C (rata) AtPP2C KAPP ABI MP2C Luan, 2003
  8. 8. SUBUNIDADES Y REGULACIÓN DE LA FAMILIA PPP PP1 PP1c R PP1c R A A A PP2A PP2Ac PP2Ac PP2Ac B B B + nM Ca2+ + nM Ca2+ CnB CnB PP2B CnA CnA CnA CaM - Ca2+ - Ca2+ CnB CaM CaM Inactiva Inactiva Activa Luan, 2003
  9. 9. DOMINIOS ESTRUCTURALES DE LAS FOSFATASAS DE Tyr Dominio catalítico Dominio SH2 Fibronectina III Membrana Plasmática HPTPb PTP1B AtPTP1 VH-1 CD45 PTPm CDC25 MKP-1 AtDsPTP1 SHPs Parecidas a receptores Intracelulares Especificidad dual Específicas de Tyr Luan et al., 2001
  10. 10. N-terminal Central a3-helix Andersen et al Mol. Cell. Biol. 2001 PP1 PTP
  11. 11. Fosfatasas en Arabidopsis 112 fosfatasas: PP2C (69) PTP (1) Ser/Thr familia PPP (23) Fosfatasas de especificidad dual (18) Fosfatasas de bajo peso molecular (1) Kerk et al. 2002
  12. 12. LOCALIZACIÓN DE LAS FOSFATASAS ÁCIDAS Las fosfatasas ácidas se suelen encontrar en casi todos los compartimientos subcelulares, pero principalmente en vacuolas (Mimura et al., 2003), citoplasma y pared celular (Sano et al., 2003) Localización Referencia Células de tomate Stenzel et al., 2003 Raíces de Arabidopsis del Pozo et al., 1999 Semillas de lupino y secretadas de raíces de lupino Olczak y Wątorek, 2003 Li y Tadano, 1996 Frijol colorado Grote et al., 1998
  13. 13. FUNCIÓN DE LAS FOSFATASAS ÁCIDAS Función Referencia Disponibilidad de P Narang et al., 2000 Stenzel et al., 2003 Estrés salino, hídrico u osmótico Knight y Knight, 2001 Zhu, 2002 González et al., 2003 Wang et al., 2003 Germinación de semillas de Vigna sinensis Biswas y Cundiff, 1991 Almacenamiento vegetativo (VSP) Berger et al., 1995 Funciones metabólicas Turner y Plaxton, 2001 Movilización de P y metabolismo del oxígeno (actividad de peroxidasa) del Pozo et al., 1999
  14. 14. FOSFATASAS ÁCIDAS PURPURAS (PAPs) Tipo I polipéptidos de aproximadamente 35 kDa Centros binucleares Fe2+-Fe3+ Tipo II Polipéptidos de aproximadamente 55 kDa Centros binucleares Zn2+-Fe3+ Se han descrito 24 genes de PAPs en el genoma de Arabidopsis (Li et al., 2002) Las fosfatasas ácidas reportadas por Olczak y Wątorek (2003) son PAPs, así como la descrita por del Pozo et al., 1999
  15. 15. DESFOSFORILACIÓN DE PROTEÍNAS DE LA MEMBRANA PLASMÁTICA DE BETABEL Tiempo (min) 0.5 1 5 10 20 40 60 80 116 97 67 45 29 Autorradiografía Armienta Aldana, 1999
  16. 16. OBJETIVO GENERAL La identificación, purificación y caracterización bioquímica de algunas fosfatasas presentes en la membrana plasmática de betabel (Beta vulgaris L.)
  17. 17. OBJETIVOS PARTICULARES Purificar a homogeneidad una o varias fosfatasas presentes en la membrana plasmática de betabel. Estudiar la actividad enzimática y las características bioquímicas de las fosfatasas purificadas. Determinar el grado de asociación de las fosfatasas con la membrana plasmática de betabel. Determinar su posible función en la planta, mediante la medición de la actividad de fosfatasa en membranas plasmáticas de betabeles cultivados bajo dos regímenes de estrés (estrés salino y estrés de fosfato).
  18. 18. PURIFICACIÓN DE LA FOSFATASA DE 95 kDa Membranas Plasmáticas de Betabel Extracción con Tritón X-114 Fase Superior Fase Inferior Cromatografía Reextración con Tritón X-114 Columna de DEAE-Sefarosa Cromatografía Columna de CM-Sefarosa Fase Superior Fase Inferior Armienta Aldana, 1999
  19. 19. Pasos Proteína Act. total Act. Especifica Purificación Rendimiento (mg) (nmol mg-1 ) (nmol mg-1 min-1) (veces) (%) Memb. Plasmáticas 15.047 74.09 4.924 1 Extracción TX-114 5.829 95.05 16.31 3 128 DEAE-Sefarosa 0.288 28.85 100.0 20 39 CM-Sefarosa 0.016 3.762 230.0 47 5.1 (empleando pNPP como sustrato) CM MPB F.S. DEAE 0.1 M 0.5 M kDa 116 9 95 kDa 7 67 MPM: Marcadores de peso molecular MPB: Membranas plasmáticas de betabel FS: Fase superior 45 DEAE: Mezcla de fracc. de la columna de DEAE-Sefarosa 29 0.1 M: Fracc. eluídas con 0.1 M NaCl 0.5 M: Fracc. eluídas con 0.5 M NaCl Armienta Aldana, 1999
  20. 20. CARACTERIZACIÓN DE LA FOSFATASA DE 95 kDa 1 2 3 4 5 6 7 Fosfatasa (nmol mg-1 min-1) 80 70 60 50 116 40 97 95 kDa 30 20 67 10 0 45 -10 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 pH 29 F.S 0.1 M 0.5 M . kDa 116 97 95 kDa 67 1. Fracción citosólica de Arabidopsis 45 2. Fracción microsomal de Arabidopsis 3. Gradiente de glicerol de SN 29 4. Gradiente de glicerol de FS FS: Fase superior 5. Fracción purificada de CM-Sefarosa 0.1 M: Fracc. eluídas con 0.1 M NaCl 6. Sobrenadante 0.5 M: Fracc. eluídas con 0.5 M NaCl 7. Membrana plasmática de betabel
  21. 21. INHIBIDORES Y ACTIVADORES DE LA FOSFATASA DE 95 kDa (nmol mg-1 min-1) % Act. Control 61.5 100 Molibdato 1 mM 9.5 15 Citrato 2 mM 55.4 90 ZnSO4. 7H2O 1 mM 53.9 88 Heparina 20 mg/mL 64.3 105 MnSO4 1 mM 39.3 64 DTT 1 mM 62.2 101 Control 90.0 100 Vanadato 2 mM 70.1 78 Control 480.8 100 FeSO4 3 mM (incubación) 499.3 104 Control 226.0 100 FeCl3 3 mM (incubación) 318.1 141 (Actividades medidas con pNPP a 405 nm) Armienta Aldana, 1999
  22. 22. CONCLUSIONES I Con TX-114 se extrajo una fosfatasa de 95 kDa, mostró un pH óptimo de 6.0, también mostró actividad de fosfatasa en gel, no desfosforiló fosfoproteínas, fue inhibida por molibdato y activada por iones hierro
  23. 23. PURIFICACIÓN DE LAS FOSFATASAS DE 82 kDa Y 36 kDa Membranas plasmáticas de betabel Extracción con n-octilglucósido Centrifugación Sobrenadante Pastilla Cromatografía Columna de Sefacríl S-300-HR Cromatografía Columna de DEAE-Sefarosa
  24. 24. 35 0.18 Act. Vol. Proteína 1 2 3 4 5 Sefacríl 0.16 Fosfatasa (nmol mL-1 min-1) 30 0.14 25 0.12 20 mg/mL 0.10 116 15 0.08 97 0.06 82 kDa 10 0.04 67 65 kDa 5 0.02 0 0.00 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 45 36 kDa Fracción Act. Vol. 18 0.014 Proteína 29 * DEAE Fosfatasa (nmol mL-1 min-1) 16 0.012 14 0.010 12 mg/mL 1. Membranas plasmáticas de betabel 10 0.008 2. Sobrenadante de la extracción con 8 0.006 n-octilglucósido 6 0.004 3. Mezcla de fracciónes de la columna de Sefacril (S10-S11) 4 + 0.002 2 4. Fracción de la columna de DEAE-Sefarosa 0 0.000 con actividad de fosfatasa de 82 kDa * NR A B D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 5. Fracción de la columna de DEAE-Sefarosa Fracción con actividad de fosfatasa de 36 kDa +
  25. 25. TABLA DE PURIFICACIÓN DE FOSFATASA DE 82 kDa Proteina Act. Total Act. Específica Purificación Rendimiento (mg) (nmol min-1) (nmol mg-1 min-1) (Veces) (%) Membranas 5.51 159.5 28.9 1.0 100 Plasmáticas Extracto de 1.96 96.7 49.4 1.7 60.7 Octilglucósido Sefacril S300-HR 0.0499 23.5 470.2 16.2 14.7 DEAE-Sefarosa 0.0018 6.71 3726 129 4.2 (empleando pNPP como sustrato)
  26. 26. TABLA DE PURIFICACIÓN DE FOSFATASA DE 36 kDa Proteina Act. Total Act. Específica Purificación Rendimiento (mg) (pmol min-1) (pmol mg-1 min-1) (Veces) (%) Membranas 7.58 701.7 92.6 1 100 Plasmáticas Extracto de 1.98 232.7 117.3 1.27 33.2 Octilglucósdio Sefacril S300-HR 0.0544 83.01 1526 16.5 11.8 DEAE-Sefarosa 0.0013 9.15 6845 73.9 1.3 (empleando 32P-MBP como sustrato)
  27. 27. Actividad de fosfatasa (pmol mL-1 min-1) 14 12 10 8 6 4 2 0 B 3 4 5 6 7 8 Ext. Con TX-114 Ext. con octilglucósido Fracción 134 94 FS: Fase superior de la extracción con TX-114 S5, S6 y S7: Fracciones obtenidas de la columna 69 56 de Sefacríl provenientes de la FS SN: Sobrenadante obtenido de la extracción con 43 n-octilglucósido 34 S5, S6 y S7: Fracciones obtenidas de la columna 24 de Sefacríl provenientes del SN 22 P: pastilla resultante de la extracción con n-octilglucósido FS S5 S6 S7 SN S5 S6 S7 P
  28. 28. CARACTERIZACIÓN DE LA FOSFATASA DE 82 kDa 3500 3000 Fosfatasa (nmol mg-1 min-1) Fosfatasa (nmol mg-1 min-1) 3000 2500 2500 2000 2000 1500 1500 1000 1000 500 500 0 0 0 2 4 6 8 10 12 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 pH Concentración pNPP (mM)
  29. 29. USO DE DIVERSOS INHIBIDORES Y ACTIVADORES, ASÍ COMO DE DIVERSOS SUSTRATOS 200 Inhibidor 180 Activador 82-kDa Sustrato APasa 160 Sin efecto 140 (nmol mg-1 min-1) % Actividad de Fosfatasa 120 p-Nitrofenil fosfato 4067 + 392 100 80 Fosfotirosina 4140 + 266 60 Fosfotreonina 3644 + 404 40 20 Fosfoserina 3757 + 215 0 ATP 4158 + 649 GTP 4172 + 927 Pirofosfato de sodio 4599 + 446 a-Naftil fosfato 3984 + 248 b-Naftil fosfato 4076 + 255
  30. 30. CARACTERIZACIÓN DE LA FOSFATASA DE 36 kDa 2500 20 18 Fosfatasa (nmol mg-1 min-1) Fosfatasa (nmol mg-1 min-1) 2000 16 14 1500 12 10 1000 8 6 500 4 0 2 0 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 pH Concentración MBP (mg/mL)
  31. 31. USO DE DIVERSOS INHIBIDORES Y ACTIVADORES Compuesto Concentración Actividad (%) Acido okadaico 2 nM 16.6 Acido okadaico 2 mM 0 Molibdato 1 mM 55.1 Vanadato 1 mM 99.3 NaF 5 mM 10.7 MgSO4 5 mM 31.2 MnSO4 5 mM 51.7 FeSO4 5 mM 80 KCl 150 mM 100 NaCl 150 mM 105
  32. 32. CONCLUSIONES II Con n-octilglucósido se purificaron 2 fosfatasas de 82 y 36 kDa La fosfatasa de 82 kDa es una fosfatasa ácida y no desfosforiló fosfoproteínas. Mostró un pH óptimo de 5.6 y una Km de 7.7 ± 2 mM. Fue inhibida por molibdato y activada por KCl La fosfatasa de 36 kDa es una fosfatasa de proteínas. Mostró un pH óptimo de 6.6 y no se alcanzó el punto de saturación con 2 mg/mL de sustrato (32P-MBP). Fue inhibida por ácido okadaico, mostrando características de una PP2A
  33. 33. ACTIVIDAD DE FOSFATASA EN VACUOLAS 1 2 3 4 5 6 7 300 116 97 Fosfatasa (nmol mg-1 min-1) 250 67 200 45 150 100 29 50 0 1 2 3 4 Fracción 1. Sobrenadante obtenido de la plasmólisis 1. Sobrenadante obtenido de la preparación de membranas de betabeles plasmáticas 2. Pastilla obtenida de la plasmólisis de 2. Fracción de la columna de DEAE con actividad de fosfatasa 3. Fracción purificada de la columna de CM-Sefarosa de la betabeles fosfatasa de 95 kDa 3. Sobrenadante obtenido de la centrifugación del 4. Sobrenadante obtenido de la plasmólisis de betabeles gradiente discontinuo de dextran 5. Pastilla obtenida de la plasmólisis de betabeles 6. Sobrenadante obtenido de la centrifugación del gradiente 4. Vacuolas discontinuo de dextran 7. Vacuolas
  34. 34. CONCLUSIONES III En preparaciones de vacuolas se observó actividad de fosfatasa y al parecer esta actividad corresponde a fosfatasas que no se han identificado
  35. 35. DETECCIÓN DE ACTIVIDAD DE FOSFATASA DE UNA EXTRACCIÓN SECUENCIAL DE MEMBRANAS PLASMÁTICAS DE BETABEL Membranas plasmáticas de betabel Diluir (0.2 M Sacarosa) Pastilla 1 Sobrenadante 1 1er Lavado (0.3 M KI) Pastilla 2 Sobrenadante 2 Extracción (0.05% (w/v) Brij 58 P) Pastilla 3 Sobrenadante 3 2do Lavado (0.3 M KI) Pastilla 4 Sobrenadante 4 Extracción (15 mM CHAPS) Pastilla 5 Sobrenadante 5 Resuspender Berzci y Møller, 1998
  36. 36. 35 45 30 pNPP 40 35 25 nmol min-1 30 20 25 15 20 Actividad de fosfatasa 15 10 10 5 5 Fosfatasa (%) 0 0 SN 1 SN 2 SN 3 SN 4 SN 5 P5 80 30 32P-MBP 70 25 pmol min-1 60 20 50 40 15 30 10 20 5 10 0 0 SN1 SN2 SN3 SN4 SN5 P5 Fracción
  37. 37. CONCLUSIONES IV Con la extracción secuencial a las membranas plasmáticas se observó que en todas las fracciones obtenidas se observaba actividad de fosfatasa Cuando se empleó pNPP y 32P-MBP como sustratos una buena parte de la actividad representa las proteínas solubles atrapadas en las vesículas. Por el otro lado, cuando se empleó 32P-MBP como sustrato, 27% de la actividad representa las proteínas asociadas débilmente a la membrana plasmática
  38. 38. DETECCIÓN DE ACTIVIDAD DE FOSFATASA EN BETABELES CULTIVADOS BAJO CONDICIONES DE ESTRÉS MPB C E.F. E.S. E.S. E.F. C MPB kDa kDa 116 134 97 67 94 69 45 56 43 29 34 24 22 Gel teñido con Inmunodetección MPB: Membrana plasmática de betabel azul de Coomassie con anticuerpos C: Control de invernadero E.S.: Betabeles bajo estrés salino E.F.: Betabeles bajo estrés de fosfato
  39. 39. - Mo 2 mM pNPP + Mo /+ 10 min 160 140 5 mM pNPP + Mo 140 120 120 100 100 nmol mg-1 min-1 nmol mg-1 min-1 80 80 60 60 40 40 20 20 0 0 E.S. E.F. C C E.S. E.F. MPB MPB: Membrana plasmática de betabel C: Control de invernadero E.S.: Betabeles bajo estrés salino E.F.: Betabeles bajo estrés de fosfato
  40. 40. CONCLUSIONES V Se observó un aumento en la actividad de fosfatasa en las muestras de membranas plasmáticas de betabeles bajo condiciones de estrés salino y de fosfato.
  41. 41. CONCLUSIONES FINALES Se purificaron 3 fosfatasas ácidas de la membrana plasmática de betabel de 82, 36 y 95 kDa, respectivamente La fosfatasa de 82 kDa es muy posiblemente una fosfatasa soluble La fosfatasa de 36 kDa es una fosfatasa de proteínas y tiene características de una PP2A (una subunidad catalítica de 36 kDa y una subunidad regulatoria de 65 kDa) La fosfatasa de 95 kDa es una fosfatasa inespecífica Aproximadamente un 47% de actividad de fosfatasa representa fosfatasas solubles atrapadas en las vesículas de membranas plasmáticas
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