• Share
  • Email
  • Embed
  • Like
  • Save
  • Private Content
Tailieu.vncty.com   chuyen gen-gao_vang_5039
 

Tailieu.vncty.com chuyen gen-gao_vang_5039

on

  • 99 views

http://tailieu.vncty.com

http://tailieu.vncty.com

Statistics

Views

Total Views
99
Views on SlideShare
97
Embed Views
2

Actions

Likes
0
Downloads
0
Comments
0

2 Embeds 2

http://tailieu.vncty.com 1
http://www.slideee.com 1

Accessibility

Categories

Upload Details

Uploaded via as Microsoft Word

Usage Rights

© All Rights Reserved

Report content

Flagged as inappropriate Flag as inappropriate
Flag as inappropriate

Select your reason for flagging this presentation as inappropriate.

Cancel
  • Full Name Full Name Comment goes here.
    Are you sure you want to
    Your message goes here
    Processing…
Post Comment
Edit your comment

    Tailieu.vncty.com   chuyen gen-gao_vang_5039 Tailieu.vncty.com chuyen gen-gao_vang_5039 Document Transcript

    • GVHD: Tạ Ngọc Ly 1 SVTH: Võ Khắc Phi LỜI CẢM ƠN Hoàn thành Đồ án này cho tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo Thầy Tạ Ngọc Ly đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập, thực tập nghiên cứu vừa qua. Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi được trang bị nhiều kiến thức bổ ích cũng như hoàn thành Đồ án này. Cuối cùng xin cho phép con được cảm ơn các bạn trong lớp 09SHLT đã động viên, giúp đỡ cho tôi hoàn thành Đồ án này. Xin được tri ân tất cả những người. Đà Nẵng, ngày 22 tháng 12 năm 2009 Sinh viên thực hiện Võ Khắc Phi
    • GVHD: Tạ Ngọc Ly 2 SVTH: Võ Khắc Phi ĐẶT VẤN ĐỀ Gạo là thức ăn chính cho hơn 3 tỷ người trên thế giới, cung cấp chủ yếu nguồn năng lượng và protein trong khẩu phần ăn của người dân châu á cũng như châu Phi. Hạn chế ở gạo là không có hoặc chứa ít các vi chất dinh dữơng thiết yếu, như không chứa vitamin A, rất ít vitamin E, sắt và kẽm. Thêm vào đó, nhiều trường hợp vi chất lại ở dạng khó hấp thu. Điều này là nguyên nhân chính gây ra hiện tượng suy dinh dưỡng ở nhiều nước đang phát triển nơi người dân dựa vào gạo là nguồn thức ăn chính. Hiện nay trên thế giới có khỏang trên 2 tỷ người suy dinh dưỡng do thiếu chất vi lượng sắt, vitamin A, iốt và kẽm. Vì vậy, thiếu vi chất dinh dưỡng đang còn là vấn đề sức khỏe cộng đồng ở các nước đang phát triển. ở Việt Nam, tình trạng thiếu chất sắt, vitamin A còn khá phổ biến nhất là ở các vùng sâu, vùng xa, miền núi. Hậu quả cho xã hội và cá nhân do thiếu vi chất dinh dưỡng rất lớn như hạn chế khả năng làm việc, giảm phát triển trí tuệ, dễ mắc các bệnh nhiễm trùng. Trong các năm qua, các hoạt động chính của chiến lược thanh toán bệnh do thiếu dinh dưỡng là bổ sung vi chất bằng đường uống cho các đối tượng có nguy cơ cao, đa dạng hóa bữa ăn, tăng cường vi chất vào thực phẩm. Tuy nhiên, biện pháp này chưa thể giải quyết được vấn đề vì tốn kém. Các loại thực phẩm giàu dinh dưỡng nằm ngoàI khả năng thu nhập của cộng đồng dân cư nghèo. Vì vậy, hiện nay một giải pháp mới được đề nghị là chọn tạo các giống cây trồng, đặc biệt là lúa, có chứa hàm lượng các vi chất dinh dưỡng cao hơn các giống đang có. Giải pháp tăng cường vi chất bằng sinh học (biofortification) này được xem là hiệu quả, kinh tế và bền vững. Theo hướng này, các trung tâm nghiên cứu lúa gạo trên thế giới đã tiến hành nghiên cứu tạo được nhiều dòng lúa giàu β-caroten (tiền vitamin A) bằng phương pháp chuyển nạp gen qua trung gian Agrobacterium tumefaciens và chọn lọc bằng mannose thay thế cho hệ thống chọn lọc bằng chất kháng sinh hoặc chất diệt cỏ. Phương pháp chuyển nạp gen này có ý nghĩa trong việc tạo ra các dòng lúa biến đổi gen sạch, khắc phục các mối lo ngại về tính an toàn của cây biến đổi gen hiện nay. Để góp phần phổ biến cho mọi người hiểu về ý nghĩa của việc nghiên cứu lúa (gạo) chuyển gen giàu β- caroten, cũng như cách thức mà các nhà khoa học tạo ra giống lúa này, em đã chọn đề tài “Tìm hiểu Phương pháp chuyển gen thực vật tạo gạo vàng giàu vitamin A” để vừa phát triển kiến thức của bản thân vừa tạo ra một nguồn tư liệu cho mọi người cùng tham khảo. Do thời gian có nhiều hạn chế, kiến thức chuyên môn còn non kém nên những gì trình bày trong đề tài này khó lòng tránh khỏi nhiều thiếu xót. Kính mong nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ và góp ý của quý thầy cô và các bạn để bài tìm đề tài của tôi được hoàn thiện hơn.
    • GVHD: Tạ Ngọc Ly 3 SVTH: Võ Khắc Phi Phần 1: TỔNG QUAN A. CHUYỂN GEN THỰC VẬT 1.1. Khái niệm chuyển gen thực vật Công nghệ chuyển gen thực vật là đưa vào một loài cây trồng những gen mong muốn có nguồn gốc từ những cơ thể sống khác nhau, không chỉ giữa các loài có họ gần nhau mà còn ở những loài rất xa nhau bằng các phương pháp vật lý, hóa học, sinh học, để tạo giống thực vật thu được giống mới nhanh hơn và vượt qua những giới hạn của kỹ thuật tạo giống truyền thống. Cây chuyển gen (transgenic plant) là cây mang một hoặc nhiều gen được đưa vào bằng phương thức nhân tạo thay vì thông qua lai tạo như trước đây. Những gen được tạo đưa vào (gen chuyển) có thể được phân lập từ những loài thực vật có quan hệ họ hàng hoặc từ những loài khác biệt hoàn toàn. Thực vật tạo ra được gọi là thực vật “chuyển gen” mặc dù trên thực tế tất cả thực vật đều được “chuyển gen” từ tổ tiên hoang dại của chúng bởi quá trình thuần hóa, chọn lọc và lai giống có kiểm soát trong một thời gian dài. 1.2. Các phương pháp chuyển gen thực vật Nhiều phương pháp khác nhau đã được phát minh để đưa gen vào tế bào và mô thực vật. Kỹ thuật đơn giản nhất là chuyển DNA trần bằng vi tiêm (microinjection), xung điện (electroporation), súng bắn gen. Ngoài ra còn phương pháp phức tạp và hiệu quả hơn là chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium,... Tuỳ thuộc vào đối tượng chuyển gen mà người ta lựa chọn phương pháp chuyển gen phù hợp. 1.2.1. Vi tiêm Nguyên tắc của phương pháp vi tiêm là một lượng nhỏ DNA được tiêm trực tiếp vào nhân tế bào phôi trần hoặc tế bào nguyên vẹn một cách cơ học dưới kính hiển vi. Phương pháp này cho phép đưa gen vào đúng vị trí mong muốn ở từng tế bào với hiệu quả tương đối cao.Tuy nhiên do đòi hỏi phải tinh vi, tỉ mỉ và cực kỳ chính xác nên hạn
    • GVHD: Tạ Ngọc Ly 4 SVTH: Võ Khắc Phi chế số lượng tế bào vi tiêm và ngoài ra còn có thể làm tổn thương đến tế bào phôi do tác nhân cơ học gây ra khi tiến hành vi tiêm. A B A Hình 1.2.1 - A -Thiết bị tạo kim, B- máy vi thao tác C Hình 1.2.1 - C - Hình ảnh vi tiêm Hệ thống này gồm có hai bộ phận chính là kính hiển vi và máy vi thao tác. Kính hiển vi dùng cho mục đích này là kính hiển vi soi ngược (vật kính xoay ngược lên). Ðộ phóng đại thích hợp cho việc tiến hành vi tiêm vào phôi cá một tế bào là khoảng từ 40-60 lần. Máy vi thao tác gồm 2 phần giống hệt nhau được bố trí hai bên kính hiển vi, một dùng để điều chỉnh kim tiêm, một dùng cho kim giữ. Tính năng của máy này là cho phép điều chỉnh các kim theo không gian 3 chiều. Kim tiêm và kim giữ được lắp vào máy vi thao tác và được nối với syringe qua ống bằng chất dẻo được nạp đầy dầu parafin. Vi tiêm được tiến hành qua các bước: nạp gen vào kim tiêm bằng phương pháp capillar (ngâm đầu kim tiêm vào dung dịch gen khoảng 10 -12 giờ) hoặc bơm trực tiếp dung dịch gen vào, lắp kim tiêm và kim giữ vào máy vi thao tác, chuyển trứng tiền nhân vào đĩa petri có chứa môi trường được đặt dưới kính hiển vi, giữ trứng tiền nhân
    • GVHD: Tạ Ngọc Ly 5 SVTH: Võ Khắc Phi vào đầu kim giữ bằng lực hút của syringe, điều chỉnh kính hiển vi để xác định đĩa phôi và điều chỉnh máy vi thao tác để đưa kim tiêm vào vị trí của trứng tiền nhân, đẩy gen vào trứng tiền nhân bằng cách vặn nhẹ syringe. Khi thấy trứng tiền nhân hơi phồng to và trở nên sáng hơn thì dừng lại và kéo nhanh kim tiêm ra. Trứng tiền nhân sau khi tiêm được di chuyển xa đến cuối đĩa petri trước khi tiêm trứng tiền nhân tiếp theo. Mỗi một nhóm trứng tiền nhân đã hoàn thành được chuyển sang một đĩa môi trường khác để ấp và đánh giá bằng mắt trong một vài tiếng. Sau đó tất cả các trứng tiền nhân được nhìn thấy rõ ràng và được chuyển vào ống dẫn trứng của con cái nhận. Ðối với thực vật thì phương pháp này được sử dụng đối với các tế bào tiền phôi của hợp tử hoặc các tế bào tiền phôi của hạt phấn. Tuy nhiên sự xâm nhập của gen chuyển vào DNA tế bào vật chủ là một quá trình ngẫu nhiên và xác suất để gen chuyển xen vào vị trí DNA vật chủ mà sẽ cho phép nó biểu hiện là thấp. Hiệu quả của vi tiêm là không cao. 1.2.2. Súng bắn gen Súng bắn gen (Gene gun) là một thiết bị sử dụng để đưa thông tin di truyền vào tế bào, được thiết kế đầu tiên cho biến nạp DNA ngoại lai vào tế bào thực vật. Tên chính xác và đầy đủ của súng bắn gen là hệ thống phân phối hạt biolistics (biolistic particle delivery system) và kỹ thuật này thường được gọi một cách đơn giản là biolistics (sự kết hợp giữa hai thuật ngữ biology (sinh học) và ballistics (sự bắn tung)). Mặc dù có nhiều thiết kế kỹ thuật khác nhau nhưng nguyên lý chung của phương pháp này là sử dụng áp lực xung của khí helium để gia tốc các hạt. Súng bắn gen bao gồm hai buồng bằng thép không gỉ, kích thước 6“x7“x10“ nối với hai bơm chân không. DNA ngoại lai được gắn vào các hạt tungsten có đường kính rất nhỏ, khoảng 1µm (các kim loại năng khác như vàng và bạc cũng được sử dụng nhưng không thường xuyên do giá cả đắt). Các hạt này được đặt trên một cái đĩa ở mặt bên trong của súng. Sự bùng nổ khí helium ở 1000psi làm cho cái đĩa bắn về phía trước với tốc độ 1300 food/s, tương đương với tốc độ khi một viên đạn rời khỏi nòng súng. Một tấm chắn làm dừng đĩa lại và các hạt vàng hay tungsten được phóng về phía các tế bào đích. Chúng xuyên qua vách tế bào và phóng thích các phân tử DNA.
    • GVHD: Tạ Ngọc Ly 6 SVTH: Võ Khắc Phi Hình 1.2. 2 – Súng bắn gen thực vật và nguyên lý hoạt động Mục tiêu của súng bắn gen thường là callus của các tế bào thực vật giống nhau sinh trưởng trong môi trường gel trên đĩa petri. Sau khi các hạt tungsten đã va chạm vào đĩa, gel và callus bị phá vỡ nhiều. Tuy nhiên một số tế bào không bị phá vỡ khi va chạm mạnhvà đã tiếp nhận các hạt tungsten được bao bọc DNA và cuối cùng các phân tử DNA ngoại lai đã xâm nhập và hợp nhất vào nhiễm sắc thể thực vật. Các tế bào từ đĩa petri được tập hợp lại và chọn lọc các tế bào đã hợp nhất thành công và biểu hiện DNA ngoại lai bằng các kỹ thuật hóa sinh hiện đại như sử dụng gen chọn lọc nối tiếp và Northern blots. Các tế bào đơn đã chọn lọc từ callus có thể được xử lý với một số hormone thực vật như auxin, gibberelin và mỗi một tế bào có thể phân chia, biệt hóa thành các tế bào mô, cơ quan, tế bào chuyên hóa của toàn bộ cây. Cây mới có nguồn gốc từ một tế bào nảy mầm thành công có thể mang các đặc tính di truyền mới. Phương pháp này có ưu điểm là thao tác dễ dàng, có thể chuyển gen vào nhiều loại tế bào và mô, các tế bào được biến nạp có tỉ lệ sống sót cao, cho phép đưa các gen vào tế bào ở vị trí mong muốn....Do vậy nó được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. 1.2.3. Xung điện Kỹ thuật xung điện (electroporation) là một phương pháp cơ học được sử dụng để đưa các phân tử phân cực vào trong tế bào chủ qua màng tế bào. Trong phương pháp này, một xung điện cao thế trong khoảnh khắc (vài phần nghìn giây) có khả năng làm rối loạn cấu trúc màng kép phospholipid, tạo ra các lỗ thủng tạm thời cho phép các phân tử DNA ngoại lai từ môi trường xâm nhập vào bên trong tế bào.
    • GVHD: Tạ Ngọc Ly 7 SVTH: Võ Khắc Phi Ðể tạo ra xung điện cao thế trong một thời gian ngắn người ta sử dụng một thiết bị gọi là máy xung gen (gene pulser). Khi công tắc thứ nhất đóng, tụ điện nạp điện vào và tích một điện áp cao. Khi công tắc thứ hai đóng, điện áp này phóng qua dịch huyền phù tế bào. Một xung điện cần thiết cho kỹ thuật này thường là khoảng 10.000- 100.000 v/cm (thay đổi tùy theo kích thước của tế bào) trong vài phần triệu giây đến một phần ngàn giây. Xung điện này làm rối loạn phospholipid kép của màng tế bào và tạo ra các lỗ tạm thời. Khả năng điện qua màng tế bào cùng lúc tăng lên 0,5-1,0 v vì vậy các phân tử đã được nạp điện này đi qua màng tế bào thông qua các lỗ bằng cách thức tương tự như điện di. Hình 1.2.3 – Máy xung gen và sơ đồ bố trí mạch cơ bản của máy xung điện Khi các ion đã nạp điện và các phân tử đi qua các lỗ, màng tế bào phóng điện và các lỗ này đóng lại một cách nhanh chóng và phospolipid kép phục hồi lại cấu trúc cũ. Lúc này các phân tử mong muốn đã ở trong tế bào và chúng được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. Phương pháp này có thể sử dụng đối với tế bào thực ật ở dạng protoplast... Với một số cây một lá mầm quan trọng (loài lúa phụ Japonica, ngô, lúa mì). Hiệu quả biến nạp cao. 1.2.4. Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium Agrobacterium có khả năng xâm nhiễm tế bào thực vật bằng cách chuyển một đoạn DNA của nó vào tế bào thực vật. Khi DNA vi khuẩn được hợp nhất với nhiễm sắc thể thực vật, nó sẽ tấn công vào hệ thống tổ chức của tế bào một cách có hiệu quả và sử dụng nó để đảm bảo cho sự sinh sôi của quần thể vi khuẩn. Mặc dù hệ thống chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium là có hiệu quả đối với một số loài nhưng
    • GVHD: Tạ Ngọc Ly 8 SVTH: Võ Khắc Phi không phải tất cả thực vật có thể được biến nạp bằng con đường này. Ðặc biệt, lớp một lá mầm bao gồm các cây ngũ cốc chính trên thế giới như lúa, lúa mì và ngô là không được biến nạp dễ dàng nhờ A. tumefaciens. Ðể khai thác và sử dụng A. tumefaciens như là một vector chuyển gen các nhà khoa học đã loại bỏ các gen gây khối u và gen mã hoá opine của T - DNA và thay thế vào đó là các marker chọn lọc, trong khi vẫn duy trì các vùng bờ phải và bờ trái của T- DNA và các gen vir. Gen chuyển được xen vào giữa các vùng bờ của T - DNA. Nó sẽ được chuyển vào tế bào và trở nên hợp nhất với nhiễm sắc thể tế bào thực vật. Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium đã được kiểm tra đối với sự xâm nhập bền vững, sự biểu hiện và sự di truyền của các gen chuyển đặc biệt. Tuy nhiên, một vài yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp là loại mô được biến nạp, giai đoạn phát triển của mô, mức độ khởi đầu của vi khuẩn A. tumefaciens sử dụng, môi trường để nuôi cấy mô sau khi biến nạp, marker được sử dụng để chọn lọc thể biến nạp, loại vector sử dụng và kiểu gen của thực vật. Hình 1.2. 4 Chuyển gen nhờ Agrobacterium 1.3. Mục đích, ý nghĩa, và một số thành tựu của chuyển gen thực vật 1.3.1. Mục đích của chuyển gen thực vật Mục đích của Công nghệ chuyển gen thực vật chủ yếu là: + Duy trì và mở rộng đa dạng sinh học (biodiversity). + Tăng khả năng kháng (sức khỏe cây trồng và chống chịu các điều kiện bất lợi). + Nâng cao chất lượng sản phẩm. + Cải thiện khả năng tích lũy dinh dưỡng. + Tăng cường tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học. + Tạo ra sản phẩm không gây hại môi trường. 1.3.2. Ý nghĩa của chuyển gen thực vật Nhìn chung, việc ứng dụng cây chuyển gen đã có những lợi ích rõ rệt như sau: - Tăng sản lượng.
    • GVHD: Tạ Ngọc Ly 9 SVTH: Võ Khắc Phi - Giảm chi phí sản xuất. - Tăng lợi nhuận nông nghiệp. - Cải thiện môi trường. 1.3.3. Một số thành tựu của chuyển gen thực vật - Chuyển gen tạo Lúa gạo giàu vitamin A và sắt. - Chuyển gen tạo Khoai tây tăng hàm lượng tinh bột. - Chuyển gen tạo Vaccine thực phẩm (edible vaccine) ở ngô và khoai tây. - Chuyển gen tạo những giống ngô có thể trồng được trong điều kiện nghèo dinh dưỡng. - Chuyển gen tạo dầu ăn có lợi cho sức khoẻ hơn từ đậu nành và cải dầu. 1.4. Những nguy cơ từ chuyển gen thực vật Bên cạnh những ưu điểm chuyển gen thực vật cũng có những nguy cơ tiềm ẩn trong việc phát triển những kỹ thuật mới. Bao gồm: - Mối nguy hiểm trong việc vô tình đưa những chất gây dị ứng hoặc làm giảm dinh dưỡng vào thực phẩm. - Khả năng phát tán những gen biến nạp trong cây trồng sang họ hàng hoang dại. - Sâu bệnh có nguy cơ tăng cường tính kháng với các chất độc tiết ra từ cây chuyển gen. - Nguy cơ những chất độc này tác động tới các sinh vật không phải là loại sinh vật cần diệt, vì thế có thể làm mất cân bằng sinh thái. Nhìn chung, mặc dù còn những điểm còn chưa rõ ràng về cây chuyển gen nhưng với khả năng tạo ra những giống cây trồng mới có giá trị kinh tế, công nghệ này có vai trò không thể phủ nhận được. Tuy vậy, vẫn còn một số vấn đề đáng lo ngại. Để giải quyết những vấn đề này thì những kết luận thu được phải dựa trên những thông tin tin cậy và có cơ sở khoa học.
    • SVTH: Võ Khắc Phi GVHD: Tạ Ngọc Ly 10 B. GẠO 1.5. Gạo (Rice) Gạo là một sản phẩm lương thực thu từ cây lúa. Hạt gạo thường có màu trắng, nâu hoặc đỏ thẫm, chứa nhiều dinh dưỡng. Hạt gạo chính là nhân của thóc sau khi tách bỏ vỏ trấu và cám. Gạo là lương thực phổ biển của gần một nửa dân số thế giới. 1.5.1. Nguồn gốc Cây lúa hiện nay được nông dân gieo trồng là kết quả xử lý trong phòng thí nghiệm và lai tạo tự nhiên cũng như nhân tạo của nhiều thế kỷ từ cây lúa dại. Hình 1.5.1 – Cây lúa của nông dân, kết quả của các nhà khoa học Vì quỹ đất có giới hạn, các nhà khoa học đang nghiên cứu biến đổi gen của cây lúa để tạo ra giống lúa mới có năng suất cao, chống được bệnh tật và thời tiết khắc nghiệt, đồng thời rút ngắn thời gian chăm bón và sớm cho thu hoạch. Những thành công ban đầu của lúa biến đổi gen đã được ghi nhận, song hiện các nhà khoa học vẫn chưa thống nhất được liệu loại lúa này có tác động xấu đến sức khỏe con người hay không. 1.5.2. Sản xuất lúa gạo ở Việt Nam Việt Nam có hai vùng trồng lúa chính là đồng bằng sông Hồng ở phía Bắc và đồng bằng sông Cửu Long ở miền Nam. Hàng năm sản lượng của cả nước đạt 33-34 triệu tấn thóc, trong đó chỉ sử dụng khoảng 8 triệu tấn (tương đương 4 triệu tấn gạo sau khi xay xát) cho xuất khẩu, còn lại là tiêu thụ trong nước và bổ sung dự trữ quốc gia. - Ở miền Bắc một năm có hai vụ lúa chính: vụ chiêm và vụ mùa. - Ở miền Nam, nông dân trồng ba vụ một năm: vụ đông xuân (có sản lượng cao nhất và thóc cũng đạt chất lượng tốt nhất cho xuất khẩu), vụ hè thu và vụ ba. Do lũ
    • SVTH: Võ Khắc Phi GVHD: Tạ Ngọc Ly 11 hàng năm ở đồng bằng sông Cửu Long trong những năm gần đây ảnh hưởng đến sản xuất, một phần nữa người dân có thể kiếm lời ổn định hơn từ việc nuôi thủy sản (tôm) hay trồng cây ăn quả, chính quyền đã khuyến cáo nông dân giảm và chuyển đổi một phần đất trồng lúa vụ ba. Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn là bộ chủ quản, quản lý việc sản xuất lúa gạo của Việt Nam. 1.6. Gạo vàng (Golden Rice) Hình 1.6 – Hạt gạo vàng giàu β-caroten "Golden rice" là loại gạo được biến đổi gen nhằm tạo ra nhiều tiền tố vitamin A (β- caroten ) cho người dùng. Hạt gạo vàng còn gọi là “Hạt Hy Vọng” là một khám phá lớn của ngành nghiên cứu lúa gạo thế giới vào đầu thế kỷ 21. Trong năm 2000, công nghệ này đã gây ra tiếng vang lớn trong nghiên cứu về dinh dưỡng thế giới - một loại gạo biến đổi di truyền màu vàng có chứa tiền sinh tố A và một số lượng lớn chất sắt được phát minh. Từ năm 2000 và đến nay các viện nghiên cứu trên thế giới đã tạo được hai loại là GR1 và GR2. - GR1 được tạo ra khi chuyển gen sinh tiền tố Vitamin A từ cây hoa thủy tiên và Erwinia uredovora vào giống lúa Indica. - GR2 được cải tiến từ GR1 bằng cách thay gen sinh tiền tố Vitamin A từ cây hoa thủy tiên bằng gen từ cây bắp. GR2 sản xuất ra lượng tiền tố vitamin A cao gấp 23 lần so với GR1. 1.6.1. Tình hình phát triển của gạo vàng trên thế giới. Gạo vàng được bắt đấu tiến hành nghiên cứu từ năm 1999. Đến năm 2000 thì GR1 ra đời.
    • SVTH: Võ Khắc Phi GVHD: Tạ Ngọc Ly 12 Vào ngày 27-3-05, một đội ngũ khoa học gia của công ty Hạt Giống Syngenta ở Cambridge, Anh Quốc, đã tuyên bố khám phá được loại gạo vàng mới (GR 2) chứa lượng β-caroten gấp 23 lần lớn hơn gạo vàng cũ (GR 1) được khám phá vào năm 2000. Ngày 14-10-2008, Rockefeller Foundation tuyên bố sẽ tài trợ Viện Thí Nghiệm Lúa Quốc Tế (IRRI) ở Philippines để hỗ trợ dự án “Hạt gạo vàng”, nhằm tăng tốc quy trình kiểm tra chấp thuận loại lương thực GM này tại các nước đông dân: Ấn Độ, Bangladesh, Indonesia và Philippines. Cơ quan Rockefeller hy vọng tài trợ nêu trên sẽ giúp Hạt gạo vàng đến tay nông dân sớm hơn để họ có thể sản xuất đại trà. 1.6.2. Ý nghĩa của việc tạo ra Gạo vàng (Golden Rice) Người ta dự tính khoảng 100 đến 140 triệu trẻ em trên thế giới đang bị thiếu vitamin A, gây ra mù mắt, bệnh sởi và tử vong. Việc nghiên cứu tạo thành công giống lúa cho Gạo vàng có thể cứu hàng trăm ngàn trẻ em bị mù hàng năm vì thiếu vitamin A. Gạo Vàng là sự kiện lớn nhất là khi mà giá lương thực ngày một cao, trên thị trường giống gạo này đã xuất hiện ở Iran 2005, đang khảo nghiệm ở Trung Quốc, Philipin và nhiều nước Châu Á khác. Theo dự báo Gạo vàng sẽ được thương mại hóa vào năm 2011 là một sản phẩm dinh dưỡng mới có tiềm năng lớn về mặt kinh tế. Hứa hẹn mang lại một nguồn thu nhập khổng lồ cho các Quốc gia đang đầu tư nghiên cứu và đang dần thành công trong đề tài “Golden rice” này. Gạo chuyển gen góp phần đảm bảo an ninh lương thực và xóa bỏ nạn đói. Gạo vàng ra đời mang ý nghĩa to lớn cho thấy sức mạnh và giá trị ứng dụng của công nghệ sinh học đối với đời sống con người.
    • SVTH: Võ Khắc Phi GVHD: Tạ Ngọc Ly 13 Phần 2: CHUYỂN GEN GẠO VÀNG 2.1. Đối tượng nghiên cứu: Sử dụng Phôi non và hạt gạo các giống lúa Taipei 309, IR64 và MTL 250 (Indica) có đặc điểm tốt về nông học, chất lượng để thực hiện biến đổi gen. Các Viện nghiên cứu đã sử dụng công nghệ biến đổi gen đưa một gen của cây thủy tiên hoa vàng hoặc từ cây ngô và vi khuẩn Erwinia uredovora vào bộ gen của lúa, tạo ra giống lúa mới có hàm lượng vi-ta-min A. Sử dụng hai loại vector chuyển gen gồm hai plasmid là pCaCar và pFun3 để chuyển gen vào vi khuẩn Agrobacterium tumefactien. Dùng vi khuẩn A. tumefactien đã được gắn plasmid nói trên để chuyển đoạn DNA mong muốn vào trong phôi của các giống lúa được chọn lọc. 2.2. Phương pháp nghiên cứu Hạt gạo vàng là một thành quả lớn trong chương trình nghiên cứu của đội ngũ khoa học gia Thụy Sĩ và Đức, được cơ quan Rockerfeller Foundation của Mỹ tài trợ 100 triệu USD trong 10 năm. Đội ngũ này được hướng dẫn bởi Giáo sư Ingo Potrykus, Viện Kỹ Thuật Liên Bang ở Thụy Sĩ, và Tiến Sĩ Peter Beyer, Đại học Freiburg ở Đức. Các nhà khoa học đã sử dụng phôi của hạt lúa nuôi cấy mô tái sinh cây lúa phòng thí nghiệm rồi chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để đưa tất cả các gen lạ vào phôi hạt lúa sau đó. Kiểm tra biểu hiện của gen qua kiểm tra kiểu hình (hạt gạo có màu vàng), kiểm tra theo phương pháp đánh giá cảm quan bằng mắt thường. Kiểm tra sự xuất hiện của các gen chuyển trong cây lúa chuyển gen bằng phương pháp điện di và PCR.
    • SVTH: Võ Khắc Phi GVHD: Tạ Ngọc Ly 14 2.3. Quy trình kỹ thuật chuyển gen Gạo vàng (Golden Rice) 2.3.1. Cơ chế tạo Gạo vàng (Golden Rice) β-caroten Bản thân hạt gạo có chứa geranyl geranyl diphosphate (GGPP) một tiền chất quan trọng trong tiến trình sinh tổng hợp β-caroten. Nhưng cây lúa thường thì lại không hề chứa β-caroten, bằng chứng là hạt gạo thường có màu trong suốt mà không hề có màu vàng đặc trưng của β-caroten. Để GGPP chuyển hóa thành các chất trung gian rồi chuyển thành β-caroten thì cần có các Ezim xúc tác tương ứng, nhưng bản thân cây lúa lại không có chứa các gen có nhiệm vụ sinh tổng hợp ra các enzim cần thiết để xúc tác cho các phản ứng chuyển hóa GGPP thàn β-caroten. Khi chuyển các đoạn gen psy, crtI, lcy vào trong cây lúa thì sẽ tạo ra một sự thay đổi rất lớn. Khi đó, gen psy là gen mã hóa để sinh tổng hợp ra enzim phytoen synthase có nhiệm vụ xúc tác để chuyển hóa GGPP (20 C) thành phytoen (40 C). Tiếp theo đoạn gen crtI mã hóa để sinh tổng hợp enzim phytoene desaturase có nhiệm vụ chuyển hóa phytoen thành ζ-Caroten rồi chuyển hóa tiếp thành Lycopen. Cuối cùng gen lcy mã hóa để sinh tổng hợp enzim Lycopen β-Cyclase có nhiệm vụ xúc tác chuyển hóa Lycopen thành β-caroten. Và kết quả là hạt gạo chuyển gen thể hiện kiểu hình có màu vàng đặc trưng của β-caroten và chứa một lượng tiền vitamin A rất lớn so với hạt gạo bình thường.
    • SVTH: Võ Khắc Phi GVHD: Tạ Ngọc Ly 15 Hình 2.3.1 – Sự khác biệt giữa gạo thường và gạo chuyển gen 2.3.2. Quy trình kỹ thuật Tách chiết gen psy và gen lyc từ cây Daffodil hoặc từ cây ngô Tách chiết gen crt1 từ vi khuẩn đất Erwinia - uredovora Chuẩn bị hạt giống B4 B3 Taipei 309, IR64 và Chuyển gen vào Plasmid pCaCar Chuyển gen vào Plasmid pFun3 MTL 250 (Indica) B5 Chuyển plasmid vào A. tumefactien Nuôi tăng sinh vi khuẩn B6 Nuôi cấy A. tumefactien trên đĩa thạch có chứa mầm tái sinh từ phôi B1 Chọn hạt có phôi tốt B2 B7 Nuôi cấy mô tái sinh cây từ phôi hạt lúa B8 Nuôi tăng sinh và tái tạo cây con từ mầm tái sinh đã chuyển gen B9 Trồng lúa chuyển gen và cho lai với giống lúa địa phương B10 Trồng đại trà thu sản phẩm gạo vàng
    • SVTH: Võ Khắc Phi GVHD: Tạ Ngọc Ly 16 2.3.3. Thuyết minh quy trình Trong cây lúa biến đổi gen người ta đưa vào để biểu hiện hai gen mã hóa, phytoene synthase (psy) và lycopene cyclase (lcy) từ cây hoa thủy tiên vàng và gen mã hóa carotoene synthetase 1 (crt1) từ vi khuẩn đất Erwinia uredovora. Nhưng người ta thấy rằng loại lúa này không cho nhiều tiền tố vitamin A như mong đợi vì psy làm giảm hiệu quả tích tụ β-caroten trong nội nhũ của hạt gạo. Vì thế gen psy từ cây hoa thủy tiên vàng được thay thế bằng gen psy từ ngô. Bước 1: Giống lúa Taipei 309, IR64 và MTL 250 (Indica) được trồng trong nhà kính với các điều kiện môi trường tối ưu, được sinh trưởng phát triển tốt, đảm bảo sạch bệnh. Người ta chọn những cây lúa có đặc điểm tốt, chọn hạt chắc mẩy, bóc vỏ để chọn phôi tốt rồi tiến hành bảo quản trong môi trường vô trùng. Hình 2.3.3 a – Cây lúa được trồng trong các điều kiện nhân tạo tối ưu để lấy nguyên liệu chuyển gen
    • SVTH: Võ Khắc Phi GVHD: Tạ Ngọc Ly 17 Bước 2: Tiến hành nuôi cấy mô từ phôi đã chọn lọc ở Bước 1 để chuẩn bị nguyên liệu cho giai đoạnc chuyển gen. Quá trình nuôi cấy sử dụng môi trường MS có thành phần như sau: A.Đa lượng (g/l) KNO3 19.0 NH4NO3 16.5 CaCl2.2H2O 4.4 MgSO4.7H2O 3.7 B.Phosphat (g/l) KH2PO4 1.7 NaH2PO4 1.7 C.Vi lượng1 (g/l) H3BO3 0.62 MnSO4.H2O 1.69 ZnSO4.2H2O 0.86 D.Vi lượng 2 (g/l) KI (Kali iodua) 0.83 Na2MoO4.2H2O 0.25 E.Vi lượng 3 (g/l) CuSO4.5H2O 0.25 CoCl2.6H2O 0.25 F.Sắt/EDTA (g/100ml) Na2EDTA 0.372 FeSO4.7H2O 0.278 G.Vitamin (mg/100ml) Glycin 200 Nicotinic acid 50 Pyridoxin-HCl 50 Thiamin-HCl 10 Myo-inositol 10.000 * Muốn có 1 lít môi trường làm việc MS
    • SVTH: Võ Khắc Phi GVHD: Tạ Ngọc Ly 18 -Chuẩn bị một bình dung tích 2 lít, chứa sẵn 400ml nước cất -Thêm 100ml A và 100ml B -Thêm 10ml C và 10ml F -Thêm 1ml D và 1ml G -Thêm 0,1ml E -Thêm nước cất cho đủ 1 lít. Bước 3: Tách chiết ADN từ vi khuẩn đất Erwinia uredovora, sau đó tiến hành cắt bằng enzim EcoRI và Kpnl để thu nhận đoạn gen ctrI Quá trình tách chiết gen ctrI được tiến hành như sau: Lấy 1 ml nước cho và một ít giống vi sinh vật (vi khuẩn Erwinia uredovora) trên ống thạch nghiêng cho vào ống eppendorf rồi đem cân. Lấy thêm một ống eppendorf khác, thêm nước vào sao cho có khối lượng bằng với khối lượng của ống thí nghiệm và đem hai ống đi ly tâm. Đưa hai ống vào máy ly tâm, đặt sao cho 2 ống ở vị trí đối xứng tâm với nhau qua trục quay của máy ly tâm. Đóng cửa của máy và đặt chế độ ly tâm cho máy như sau: - Tốc độ quay: 10000 vòng/phút - Thời gian ly tâm : 1 phút - Nhiệt độ ly tâm: 100 C Sau khi ly tâm, lấy ống thí nghiệm ra, thấy hỗn hợp phân thành 2 lớp. Ta loại bỏ lớp nước nổi ở phía trên đi, chỉ giữ lại phần lắng (Phần sinh khối vi sinh vật). Tiếp tục ta thêm vào ống thí nghiệm vừa loại bỏ phần nổi 200 microlit InstaGene (InstaGene là hỗn hợp các chất – là bộ kid để test nhanh), rồi đem ủ ở 560 C trong máy ổn nhiệt trong 30 phút để hoạt hóa enzim. Bấm đồng hồ để canh thời gian. Sau 30 phút lấy ống thí nghiệm ra khỏi máy ổn nhiệt và đem ống đi lắc mạnh trong 10 giây bằng máy vortex. Sau đó tiếp tục đưa ống vào đặt trong bể ổn nhiệt ở 95 0 C hoặc nước sôi trong 8 phút. Bấm đồng hồ để canh thời gian. Sau 8 phút, lại lấy ống ra đem lắc mạnh bằng vortex trong 10 giây. Rồi đem ly tâm với chế độ ly tâm được cài đặt là: - Tốc độ: 11000 vòng/phút - Thời gian ly tâm: 2-3 phút - Nhiệt độ ly tâm: 100 C Sau khi ly tâm, lấy ống nghiệm ra quan sát thấy hỗn hợp phân thành 3 lớp. Lớp trên cùng chính là ADN có khối lượng nhỏ nhất nên nổi lên trên sau khi ly tâm.
    • SVTH: Võ Khắc Phi GVHD: Tạ Ngọc Ly 19 Phần AND sau khi tách ra được tiến hành cắt đoạn gen cần (đoạn gen ctrI) bằng enzim EcoRI. Ta thu nhận được đoạn gen ctrI để sử dụng trong chuyển gen ở các bước sau. Bước 4: Hoa thủy tiên (hoặc ngô) được trồng trong nhà kính với các điều kiện môi trường tối ưu, đảm bảo sạch bệnh, được chọn lọc với điều kiện cây sinh trưởng phát triển tốt, cho hoa có màu vàng tươi. Người ta chọn những bông hoa (quả ngô) đang trong thời gian phát triển mạnh để chiết xuất gen. Gen psy và gen lyc của các bông hoa (quả) này được tiến hành theo các giai đoạn như sau: - Bỏ 10 g đá khô vào xay nhuyễn, sau đó cho 8 g hoa thủy tiên (hoặc hạt ngô), xay cho đến khi thành bột mịn. - Chuyển bột này vào cốc đã được làm lạnh trên nitơ lỏng trước rồi cho vào cốc 50 ml nitơ lỏng. Đặt ở -20 độ trong vòng 6 tiếng. - Cho 20 ml dung dịch đệm đã được đun sôi vào mẫu bột đã được xử lí trên rồi tiến hành lắc nhẹ. - Ngâm trong bể ổn nhiệt ở 56 độ trong vòng 20 phút. - Cho 20 ml Chloroform: isoamylalcohol (24:1) vào rồi lắc đều ở nhiệt độ phòng. Sau khi lắc chuyển dịch chiết tách trên qua ống dùng để quay li tâm và tiến hành quay li tâm ở nhiệt độ phòng (2800 rpm, 20 phút) - Chuyển lớp nước ở phía trên vào ống nghiệm mới sau đó cho 2 ml dung dịch CTAB 10 % đã được hâm nóng ở 700 . Sau đó trộn đều. - Cho 20 ml Chloroform: isoamylalcohol (24:1) vào rồi lắc đều ở nhiệt độ phòng. Sau đó quay li tâm ở nhiệt độ phòng (2800 rpm, 20 phút). - Cho 30 ml đệm kết tủa CTAB sau đó trộn đều cho tới khi có một màng ADN màu trắng đục nổi lên. - Quay li tâm ở nhiệt độ phòng (3000rpm, 20 phút). Loại bỏ phần dịch lỏng thu phần kết tủa. - Hòa tan kết tủa bằng 5ml dung dịch muối ở nhiệt độ 56o C NaCl 1M và cho vào dung dịch 5µl enzyme RNase 10mg/ml để phân hủy RNA . - Cho 10ml cồn lạnh nguyên chất và lắc đều để kết tủa ADN. - Quay li tâm, lấy phần tủa. - Cho 20ml cồn 70 %, quay li tâm, lấy phần tủa. - Cho 20 ml cồn nguyên chất, quay li tâm lấy phần tủa.
    • SVTH: Võ Khắc Phi GVHD: Tạ Ngọc Ly 20 - Quay phần tủa với nắp ống nghiệm được mở để làm khô ADN. Lúc này ADN sẽ chuyến sang trong suốt không màu - Phần AND sau khi tách ra được tiến hành cắt đoạn gen cần (đoạn gen psy và lcy) bằng enzim EcoRI và HindIII. Ta thu nhận được đoạn gen ctrI để sử dụng trong chuyển gen ở các bước sau. Bước 5: Các nhóm gen sau khi được chiết xuất, tinh sạch sẽ được cắt thành các đoạn nhỏ được chuyển vào 2 plasmid là pCaCar và pFun3. Trong đó hai gen psy, crt1 được chuyển vào plasmid pCaCar, gen còn lại là lcy được chuyển vào một plasmid pFun3. Hình 2.3.3b – Plasmid chuyển gen (Đã được minh họa thành đường thẳng) Bước 6: Các plasmid được chuyển vào hai đĩa petri khác nhau có nuôi vi khuẩn Agrobacterium tumefacien dòng mannopine type Ti plasmid. Plasmid tự động chuyển vào bên trong tế bào vi khuẩn, nhờ sự tăng sinh của vi khuẩn chúng được nhân bản với số lượng lớn và được sử dùng trong giai đoạn tiếp theo. Bước 7, 8: Nuôi cấy A. tumefactien trên môi trường có chứa mầm tái sinh cây lúa đã được chuẩn bị ở bước 2. Các đoạn gen ngoại lai từ A. tumefactien sẽ được chuyển vào mầm tái sinh từ phôi. Môi trường để nuôi cấy được pha chế thử nghiệm như bảng dưới đây, thực nghiệm sẽ lựa chọn ra môi trường tối ưu để sử dụng trong quá trình chuyển gen.
    • SVTH: Võ Khắc Phi GVHD: Tạ Ngọc Ly 21 (Số liệu thu thập từ kết quả công bố của Viện lúa Đồng bằng sông Cửu Long) Kết quả thực nghiệm của Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long cho biết trong số các môi trường được nghiên cứu nói trên thì môi trường MSReg3 là môi trường tối ưu nhất cho quá trình chuyển gen bằng A. tumefactien. + Trong giai đoạn tiếp theo vi khuẩn mang gen chuyển được đưa vào nuôi cấy trong môi trường có chứa phôi của hạt lúa Indica đã được chuẩn bị ở trên. Vi khuẩn
    • SVTH: Võ Khắc Phi GVHD: Tạ Ngọc Ly 22 chuyển đoạn gen cần chuyển vào phôi. Các phôi sau chuyển gen được đưa đi nuôi cấy trong phòng thí nghiệm để chuẩn bị cho giai đoạn chuyển ra môi trường tự nhiên. Hình 2.3.3c – Quá trình chuyển gen từ A. tumefactien vào tế bào thực vật Bước 9: Nuôi cấy mô tái sinh tạo cây con từ mầm tái sinh đã chuyển gen Hình 2.3.3 d – Tế bào callus tái sinh từ phôi chuyển gen và cây lúa đang phát triển tốt Bước 10: Cây lúa chuyển gen sau tái sinh được nuôi tăng sinh, rồi chuyển ra môi trường đất và được cho tập thích nghi dần với các điều kiện môi trường ngoài phòng thí nghiệm n sau đó cho lai với giống lúa địa phương để tăng khả năng thích nghi với điều kiện tự nhiên tại vùng sản xuất và được trồng với số lượng lớn ngoài tự nhiên để thu sản phẩm. Các hạt lúa thu được sẽ được đưa đi kiểm tra kết quả chuyển gen và kiểm tra tính an toàn trước khi trở thành sản phẩm cho con người sử dụng.
    • SVTH: Võ Khắc Phi GVHD: Tạ Ngọc Ly 23 2.5. Kiểm tra kết quả chuyển gen β-caroten Để kiểm tra kết quả chuyển gen β-caroten người ta dùng hai phương pháp sau: 2.5.1. Kiểm tra bằng cảm quan Quan sát và so sánh nội nhủ của hạt gạo thường và hạt gạo chuyển gen β-caroten. Quan sát sẽ thấy hạt gạo thường có màu trắng trong, còn hạt gạo chuyển gen β-caroten có màu vàng ngà. Hạt gạo nhận gen chuyển từ cây ngô có màu vàng sẫm hơn so với hạt gạo nhận gen chuyển từ hoa thủy tiên, cho thấy lượng β-caroten có trong hạt gạo nhận gen chuyển từ cây ngô cao hơn so với hạt gạo nhận gen chuyển từ hoa thủy tiên. Hình 10 – Kiểm tra kết quả chuyển gen bằng cảm quang 2.5.1. Kiểm tra bằng kỹ thuật phân tích phân tử 2.5.1.1. Sử dụng kỹ thuật PCR phát hiện sự có mặt của các gen psy, crt, lcy. Hình 2.5 .1.1 – Kết quả chụp UV Hỗn hợp dùng trong phản ứng PCR và một sô dụng cụ cần thiết - Tag polymerase 0,025 U/µl (1,25U/50µl) - Tris-HCl (pH 8.8 ) 75mM - (NH4)2SO4 20mM - Tween 20 0,01%
    • SVTH: Võ Khắc Phi GVHD: Tạ Ngọc Ly 24 - dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 200µM mỗi loại - MgCl2 1,5mM - Các hóa chất dùng cho điện di ADN - Máy li tâm, Eppendorf 1.5ml, 0.2ml, 0.5ml, Micropipette 20, 200, 1000µl, Máy PCR, Máy điện di ngang80 -150V, Bộ nguồn điện di điện thế từ, Bộ chụp ảnh trên đèn UV, Tủ ấm, Máy lắc Vortex. Tiến hành PCR - Dùng đầu tăm chấm và lấy coloni được nuôi cấy trong thạch nuôi rắn. Chú ý không để thạch nuôi dính theo tăm vì trong gel có chứa các chất gây ảnh hưởng đến phản ứng PCR. - Cho coloni lấy được ở trên vào Eppendorf có chứa 100µl nước cất tuyệt trùng. - Đun sôi trong vòng 5 phút - Tiến hành quay li tâm ở tốc độ10000rpm, trong vòng 5 phút, sau đó lấy phần nước dịch lỏng có chứa ADN đem đi nhân dòng. Thiết lập chương trình cho máy PCR B1. 940 C 1-1,5’ (Biến tính ADN) B2. 95 0 C 20 s (Tách ADN sợi đôi thành sợi đơn) B3. 65 0 C 20 s (Mồi bắt cặp với sợi khuôn) B4. 720 C 1’ (Phản ứng kéo dài) B5. lặp lại B2 đến B4 29 lần B6. 720 C 10’ ( Tổng hợp nốt các đoạn chưa được hoàn chỉnh) B7 4 độ ∞ 2.5.1.2. Trích DNA và phân tích Southern DNA được trích từ lá theo phương pháp của McCouch và ctv. (1988). Mười micrograms DNA được cắt đoạn với EcoRI (hai điểm cắt) để xác định sự hiện diện của gen psy hoặc crtI đối với dòng lúa chuyển nạp bằng vắc-tơ pCaCar và cắt đoạn với KpnI (một điểm cắt) để xác định số bản (copy). Đối với DNA của các dòng lúa chuyển nạp bằng véctơ pFun3 được cắt đoạn với EcoRI và HindIII (hai điểm cắt) để xác định sự hiện diện của gen psy hoặc crtI và cắt với KpnI (một điểm cắt) để xác định số bản. DNA cắt đoạn được chạy điện di qua 0,8% agarose gel trước khi chuyển bằng mao dẫn và cố định trên màng nylông (Hybond-N+, Amersham). Gen psy và crtI được
    • SVTH: Võ Khắc Phi GVHD: Tạ Ngọc Ly 25 đánh dấu bằng DIG (Boeheringer, Rotkreuz, Switzerl), được dùng làm mẫu dò (probe). Lai, rửa và phát hiện gen được thực hiện theo phương pháp của Wiinn và ctv. (1996).
    • SVTH: Võ Khắc Phi GVHD: Tạ Ngọc Ly 26 Phần 3 KẾT LUẬN Cây trồng chuyển gen đã mang lại nhiều lời ích cho con người và đặc biệt là sản phẩm gạo vàng, một lựa chọn mới cho các quốc gia nghèo. Đây là một thành cồng lớn của nên công nghệ sinh học của thế giới. Giá trị của các sản phẩm chuyển gen cần nhiều thời gian để thẩm định, nhưng những gì chúng đã mang lại cho chúng ta hiện nay đã không thể phủ nhận rằng thực vật chuyển gen có ý nghĩa tích cực và to lớn trong đời sống con người. Gạo vàng sẽ là một niềm hy vọng rất lớn cho trẻ em phụ nữ và nhiều thành phần khác trong xã hội. Việt Nam cũng đã thành công trong nghiên cứu về loài GM mới này. Chúng ta hy vọng một ngày không xa gạo vàng sẽ là nguồn lương thực cho cả thế giới và đó sẽ là một tương lai mà chúng ta không còn phải lo lắng về khủng hoảng lương thực.
    • SVTH: Võ Khắc Phi GVHD: Tạ Ngọc Ly 27 I. Tài liệu sách: TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Trần Quốc Dung, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần thị Lệ, Công nghệ chuyển gen động, thực vật. Giáo trình ĐH Huế. 2 . Nguyễn Đình Huyên, Sinh học phân tử AND, NXB KHKT, Hà Nội, 1998 3. Nguyễn Hoàng Lộc, Lê viết Dũng, Trần Quốc Dung, Công nghệ AND tái tổ hợp, NXB Đại học Quốc gia TPHCM. 4. Công nghệ gen trong nông nghiệp. Giáo trình ĐH Huế. 5. Phạm Hồng Sơn, Kỹ thuật cơ bản trong sinh học phân tử, Giáo trình ĐH Huế. 6. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, Chọn giống cây trồng – phương pháp truyền thống và phân tử, NXB Nông nghiệp. II. Tài liệu internet: 1. AgBioView on line. 14-10-2008. http://www.agbioworld.org. 2. FAO-BioDec, 2003; http://www.fao.org/biotech/inventory_admin/dep/default.asp 3. James, C. 2007. Global status of commercialized Biotech/GM crops: 2007. ISAAA Briefs 37-2007: Excecutive Summary, ISAAA: Ithaca, N.Y. (http://www.isaaa.org/Resources/Publications/briefs/37/executivesummary/default.htm l) 4.http://vinhphucdost.gov.vn/Default.asp?id_DB=262008162445&strContent=26& strShow=&page=3 5. http://www.agbiotech.com.vn/vn/2print.php?key=205 6. http://rausach.com.vn/printer_friendly_posts.asp?TID=649 7. http://www.goldenrice.org/ 8. http://www.goldenrice.org/Content2-How/how1_sci.html 9. http://www.goldenrice.org/Content2-How/how8_tests.html 10. http://www.goldenrice.org/Content1-Who/who1_humbo.html 11. http://www.goldenrice.org/Content1-Who/who2_history.html 12. http://www.timsanpham.com/product_detail.php?product_id=63378 13.http://vietbao.vn/Suc-khoe/Gao-vang-phien-ban-moi-Nhieu-vitamin-A- hon/20440049/248/ 14.http://www.sinhhocvietnam.com/vn/modules.php?name=News&file=article&si d=469 15. http://www.ebook.edu.vn/?page=1.18&view=1501
    • SVTH: Võ Khắc Phi GVHD: Tạ Ngọc Ly 28 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. 1 ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................................................. 2 Phần 1:.........................................................................................................................3 TỔNG QUAN ............................................................................................................. 3 A. CHUYỂN GEN THỰC VẬT.................................................................................. 3 1.1. Khái niệm chuyển gen thực vật............................................................................. 3 1.2. Các phương pháp chuyển gen thực vật.................................................................. 3 1.2.1. Vi tiêm............................................................................................................... 3 1.2.2. Súng bắn gen...................................................................................................... 5 1.2.3. Xung điện .......................................................................................................... 6 1.2.4. Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium .......................................................... 7 1.3. Mục đích, ý nghĩa, và một số thành tựu của chuyển gen thực vật ..........................8 1.3.1. Mục đích của chuyển gen thực vật...................................................................... 8 1.3.2. Ý nghĩa của chuyển gen thực vật........................................................................ 8 1.3.3. Một số thành tựu của chuyển gen thực vật.......................................................... 9 1.4. Những nguy cơ từ chuyển gen thực vật................................................................. 9 B. GẠO ..................................................................................................................... 10 1.5. Gạo (Rice) .......................................................................................................... 10 1.5.1. Nguồn gốc ....................................................................................................... 10 1.5.2. Sản xuất lúa gạo ở Việt Nam............................................................................ 10 1.6. Gạo vàng (Golden Rice)...................................................................................... 11 1.6.1. Tình hình phát triển của gạo vàng trên thế giới................................................. 11 1.6.2. Ý nghĩa của việc tạo ra Gạo vàng (Golden Rice).............................................. 12 Phần 2:.......................................................................................................................13 CHUYỂN GEN GẠO VÀNG.................................................................................... 13 2.1. Đối tượng nghiên cứu: ........................................................................................ 13 2.2. Phương pháp nghiên cứu..................................................................................... 13 2.3. Quy trình kỹ thuật chuyển gen Gạo vàng (Golden Rice) ..................................... 14 2.3.1. Cơ chế tạo Gạo vàng (Golden Rice)................................................................. 14 2.3.2. Quy trình kỹ thuật ........................................................................................... 15 2.3.3. Thuyết minh quy trình...................................................................................... 16 2.5. Kiểm tra kết quả chuyển gen β-caroten ............................................................... 23 2.5.1. Kiểm tra bằng cảm quan................................................................................... 23 2.5.1. Kiểm tra bằng kỹ thuật phân tích phân tử......................................................... 23 2.5.1.1. Sử dụng kỹ thuật PCR phát hiện sự có mặt của các gen psy, crt, lcy..............23 2.5.1.2. Trích DNA và phân tích Southern ................................................................. 24 Phần 3........................................................................................................................26 KẾT LUẬN ............................................................................................................... 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................... 27