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iRNAs - Daniel Salas
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iRNAs - Daniel Salas

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  • 1. TEMA 1INTERFERENCIA DE LA EXPRESIÓN GÉNICA CON RNAGenómica y Proteómica (BIO-341)Contenidos1. Silenciamiento con siRNA.2. Silenciamiento con shRNA.3. Silenciamiento adaptado con miRNA.4. Screening y técnicas de detección de iRNA.IntroducciónLa velocidad de desarrollo de la genómica condujo de alguna manera a una evoluciónpostgenómica, basada principalmente en el descubrimiento de técnicas genómicas en eltranscriptoma humano que derivan de las secuencias de RNA no mensajero, ni RNA detranscripción, denominados RNA de interferencia (iRNA).Los iRNAs son fragmentos de RNA (Ácido Ribonucleico) que se adhieren a regionesespecíficas de RNA mensajero (RNAm), interrumpiendo su traducción, cumpliendo así, unafunción de regulación de la expresión genética a un nivel postranscripcional(silenciamiento) y por tanto, en una regulación de la expresión génica.El silenciamiento postranscripcional fue descubierto en C. elegans y en plantas, en éstas,los iRNA cumplen roles de protección y resistencia a parásitos y virus. Convirtiéndoseentonces en una herramienta poderosa para la investigación, en campos medicinales,farmacéuticos, genéticos y moleculares.DesarrolloProceso de formación de iRNADos son los mecanismos importantes por los cuales los iRNA se forman y se activan:1. Generación del iRNA.2. Efector iRNA: Interrupción y degradación del RNAm target.
  • 2. Generación del iRNALa generación de un iRNA inicia con la formación de los fragmentos de iRNA a partir deuna doble cadena de RNA (dsRNA). Esta doble cadena es clivada (dividida) por la acción dela proteína DICER intermediado por una molécula de ATP. Al tener el fragmento de iRNAde interés por la intermediación de una quinasa y la acción de otro ATP, la proteína RISCen su dominio RdRP amplifica la secuencia de iRNA.La DICER es una enzima RNAasa III, procesa dsRNA en siRNA de 25 pares de bases (pb),con dominio helicasa, dominio catalítico y de unión a dsRNA.Efector iRNA: Interrupción y degradación del RNAm targetLos iRNAs se unen al RNAm target (blanco) por efecto de la RISC (endonucleasa que clivasecuencia target). Ésta separa la cadena sense del iRNA y la libera, mientras que laproteína RISC se une a la cadena de anti-sense del iRNA con la que se une al RNAm queposee la cadena “sense” correspondiente. Generalmente los iRNA tienen una longitudpromedio entre los 25 a 45 pb que se unen al RNAm target.RISC.- Dos proteínas de unión al RNA, RNA/DNA helicasa, Factor de iniciación detraducción RdRP (Proteína transmembránica).Funciones naturales de los iRNAsEn procariotas y plantas generan iRNA para protección y defensa contra genes ytranscriptos externos (virus y parásitos), en eucariotas no son muy útiles por el efecto delos Interferones (IFN).Tipos de iRNAsTres son los tipos más importantes de iRNAs caracterizados principalmente por sulongitud, forma de empaquetamiento y vector para efector:1. siRNA (RNA silenciador). Tienen una longitud de 19-22 pb. Se sintetizan por PCR,casetes de expresiones, transcripción in vitro. Transmisión por transfección (a).2. shRNA (RNA short hairpin “horquilla”). Se construyen en plásmidos que transfectan lascélulas receptoras que contienen el RNAm (b).
  • 3. 3. miRNA (RNA micro short hairpin). ssRNA de 22 pb nucleótidos generados por enzimastipo RNAasa DROSHA y DICER a partir de transcripto endógeno que contiene unaestructura local de horquilla (hairpin). Importante en las células para regulación dedesarrollo y diferenciación. Los transcriptos de miRNA se empaquetan en plásmidos, queson empaquetados a su vez en una partícula viral se transfecta así en al RNAm target, laintegración con este tipo de iRNA es más estable (c).Generación de siRNAs, shRNA y miRNALa generación de siRNAs, shRNA y miRNA por síntesis química se produce por:→ Vectores de expresión de iRNAs.→ Plásmidos o vectores virales.Los vectores basados en plásmidos transitorios, dependen de la eficiencia de transfecciónque es variable y puede ser baja.Los vectores basados en virus, son más eficientes que los basados en plásmidostransitorios, pero son más peligrosos.El ingreso de siRNA, shRNA y miRNA in vitro hacia la célula que contiene el RNAm target seda por transfección química por lipofectamina u oligofectamina o por electroporación. Elingreso de siRNA in vivo se realiza por inyección intramuscular y transfección a células demamífero.Ventajas y desventajas de siRNAsVentajas:→ Método rápido.→ Síntesis escaladas.→ Capacidad de marcaje de siRNA.→ Fácil transfección.→ Control de cantidad de iRNA por factores.Desventajas:→ Poco efectivo, no específico.→ No buena transfección (a veces).
  • 4. → Expresión no inducible.→ Corto tiempo de vida siRNA.→ No útil en tiempo.→ Eficacia baja en proteínas muy expresadas.→ Costoso.Ventajas y desventajas de shRNAsVentajas:→ No se trabaja con RNA.→ Expresión estable y transitoria.→ Costo efectivo.→ Expresión inducible.→ Screenings en pools.Desventajas:→ Requiere clonación y verificación de inserto.→ Sitios de integración al genoma.Ventajas y desventajas de miRNAVentajas:→ No se trabaja con RNA.→ Expresión estable o transitoria.→ Costo-efectiva para experimentos largos.→ Vía de llegada directa para células difíciles de transfectar.→ Screening por pools.Desventajas:→ Requiere clonación y verificación de inserto.→ Sitios de integración al genoma inciertos en muchas ocasiones.shRNA adaptados a miRNA
  • 5. Se construyen librerías de constructos de shRNA dentro de precursores endógenos desecuencia de miRNA. En animales, los miRNAs se transcriben por RNA pol II generandolargos RNAs poliadenilados (pri-miRNAs).El pri-RNA es clivado en el núcleo para dar un miRNA precursor con horquilla (pre-miRNA)de 70 a 90 nucleótidos. Los pre-miRNAs se transportan al citoplasma y la DICER lo clivapara producir miRNA maduro. Los shRNAs artificiales se insertan en la secuenciaendógena mir-30 y luego de la maduración inhiben la expresión de miRNAs que contienenel sitio target.Aplicaciones.- La búsqueda de nuevos targets a drogas por screening del genoma conlibrerías de shRNA. Identificación de oncogenes. Librerías Hannon lentivirales yretrovirales: micro RNA -30 para humanos (61600 constructos para 28000 genes). 35000constructos de shRNAs para 5300 genes humanos.Estudio de función génica de iRNA (siRNA, shRNA y miRNA)Screening shRNA en plásmidos.- Se utilizan 7000 shRNAs clonados en plásmidos. Setransfecta por reporteros:1. Reportero GFP (Green Flourescent Protein Zs-Green) con dominio Pest de enzimaornitina descarboxilasa.2. Zs-green es degradada por proteosoma y cuando no hay mucha flourescencia lacoinfección ha sido bien hecha, si hay más fluorescencia verde hay menos probabilidad debuen diseño.Screen de miRNA.- Casi lo mismo descrito en el párrafo anterior, pero con resultados másclaros.Screen de virus – shRNA.- Transducción de células con virus con casete de shRNA.También shRNA se pueden empaquetarse en cápsulas virales. Si el RNA ya estádiferenciado se usan pools de retrovirus para la infección de distintos shRNA con direccióna genes de humano.Screen alternativo iRNA.- Utiliza iRNA con enzimas que expresan casetes de iRNA.1. Señalización2. Validación del target. Bioinformática.
  • 6. 3. Hipótesis y epistasis a nivel de sistema de genes.AplicacionesScreen en pools.- Marcaje de secuencias únicas Bar Code de gen perturbado,recuperación por PCR. Hibridación por Arrays de librerías: Arrays celulares y encima iRNAo Arrays con iRNA y encima las células.Screening en placas multipozos.- Cada pozo contiene un diferente reactivo al iRNA(shRNA, miRNA, siRNA) dirigido a un target específico (RNAm). Posteriormente se realizala transfección o infección celular. Se identifica posteriormente los elementos pro o antisobrevivencia de genes que fueron sensibilizados por iRNAs.Microarrays de células.- Un Microarray es un slide de vidrio pequeño cubierto con célulaspor puntos que han tomado al iRNA (siRNA, shRNA y miRNA), estos iRNA se imprimen alvidrio como un Microarray y posterior a ello, las células son cultivadas sobre éstos arraysque contienen a los iRNA. La detección se realiza por fluorescencia específica, un color(generalmente verde) para verificar efecto positivo (en este caso unión iRNA-target), uncolor (generalmente rojo) para verificar efecto negativo (iRNA-target no se adhirieron) yun color (generalmente amarillo) para verificar errores o múltiples resultados en elproceso.Detección de redes genéticas.- Los iRNA son una buena herramienta para el análisis deinteracciones genéticas binarias para establecer redes génicas. Estas redes permitenobservar o determinar la asociación positiva, negativa o intransigente de genes queparticipan en un determinado fenotipo (epistasis, redundancias, etc.).Validación.- Es costoso, pero importante. Se debe validar el control (blanco). Presencia yefecto de iRNA. Respuesta al interferón. Perfil transcripcional del iRNA/target.→ Controles con DNAc para ver gen perturbado.→ Complementación en hairpin→ Blanco de UTR y no proteica.→ La biología celular promueve marcadores de rutas y vías celulares de cada caso.→ Reporteros importantes para ver estudios múltiples de vías de afección de shRNAs.Aplicaciones de iRNA
  • 7. Desarrollo del cerebro (miR-430). Patrones de sistema nervioso (miR-273). Diferenciaciónde Adipocitos (miR-143). Desarrollo del corazón (miR-1). Apoptosis (miR-14). Algunos virusllevan su propio miRNA, CMV).Kaucsár et al. (2010). Se utilizó miRNAs para verificar su relación con diferentesenfermedades, como la diabetes y la isquemia relacionada con la nefropatía. Los miRNApueden estar asociados en la inhibición de la “antisense” de oligonucleótidos, silenciadosin vivo. La modificación de los mismos puede representar una alternativa para terapiagénica para una influencia de regulación postranscripcional de múltiples genes. Latransfección fue realizada por plásmidos contenidos en partículas virales y la detección delos mismos por microarrays de tejido vivo con validaciones previas, durante y posterioresa los análisis.Izquierdo (2005). Utilizó los iRNAs para la interferencia de genes de sobreexpresión deoncogenes, bloqueo de la división celular interfiriendo la Ciclina E y promoviendo genes deapoptosis suprimiendo los genes antiapoptóticos.Rossi (2006). iRNA logró interferir el VIH-1 primate usando siRNAs, shRNAs. Los iRNAinterfirieron los RNAm target codificadores los receptores requeridos para la entrada virala la célula. Los experimentos se llevaron a cabo in vitro, si bien los otros mutantes viralesde VIH lograron proliferar, la técnica de iRNA puede ser aplicada para muchos RNAmtarget del VIH.Futuros EnsayosiRNA in vivo a través del estudio de inactivación génica en animales modelo. Inyecciónlocal iRNA a órganos blanco.Ratones transgénicos con knockdown por iRNA por inyección de plásmidos de shRNAslinearizados al pronúcleo del huevo fertilizado. Electroporación en células madre. shRNAslentivirales transducidos en células madre embrionicas. Sistemas inducibles, sistemas deiRNA inducibles y condicionales.BibliografíaIzquierdo, M., 2005. Review: Short interfering RNAs as a tool for cancer gene therapy.Cancer Gene Therapy - Nature. 12: 217-227.
  • 8. Kaucsár, T., Z. Rácz y P. Hamar, 2010. Post-transcripcional gene-expression regulation bymicro RNA (miRNA) network in renal disease. Advanced Drug Delivery Reviews 62: 1390-1401.Paddison, P., A. Caudy, E. Bernstein, G. Hannon y D. Conklin, 2002. Short hairpin RNAs(shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes & Development16: 948-958.Pardridge, W., 2007. shRNA and siRNA delivery to the brain. Advanced Drug DeliveryReviews 59: 141-152.Rossi, J., 2006. Review: RNAi as a treatment for HIV-1 infection. BioTechniques. 40: S25-S29.