Uso Practico De La Carga Viral

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Uso Practico De La Carga Viral

  1. 1. USO PRACTICO DE LA CARGA VIRAL Dr. Hector Marrufo Ortega Patologia Clinica Facultad de Medicina de Leon Analisis Clinicos de Leon 2003
  2. 2. CARGA VIRAL •Medición de la cantidad de virus a través de la cuantificación de copias de su material genético. •Puede hacerse en sangre (plasma), LCR, orina, semen, aspirados etc. •La muestra ideal depende de la técnica empleada para la cuantificación. •Reporte en copias/ml de plasma o en log correspondiente.
  3. 3. CARGA VIRAL Utilidad: •“Diagnostica” • Seguimiento “La carga viral representa la aparente correlacion entre la cantidad de virus en la sangre y la severidad de la enfermedad“. •Monitoreo terapeutico •Infecciones causadas por: VIH VSR. CMV Otros Hepatitis B y C VPH ? Herpes (encefalitis viral)
  4. 4. CARGA VIRAL Metodos: PCR (convencional): • Reacción en cadena de la polimerasa. • Mas utilizada • “aprobación FDA” • El DNA o RNA (RT-PCR) es amplificado • Cuantificación por ELISA. • Uso de estandar de cuantificación
  5. 5. Sistema COBAS Amplicor automatizado
  6. 6. Zona reacción Termociclador ELISA Muestreador Zona reactivos
  7. 7. CARGA VIRAL PCR en tiempo real: •Amplificacion del ADN o RNA con monitoreo continuo de dicho evento •Basada en deteccion y cuantificación de moleculas fluorescentes (“reporteros”) •La señal emitida por el reportero aumenta directamente proporcional a la cantidad de producto de PCR en la reacción MONITOREO DE EMISION PCR EN FASE FLUORESCENCIA EXPONENCIAL
  8. 8. PCR TIEMPO REAL •Monitoreo continuo •Tiempo de ramping mas cortos (mas específica) •Fluorescencia (reportero) •Bromuro de etidio: se une a la cadena de ADN en surco menor y emite una señal •Formatos: –Agentes intercalantes •Sybr Green o bromuro de etidio –Sondas de hibridación: •Sondas de hidrolisis, molecular beacons •Tm :temperatura fusion de fragmentos amplificados CINETICA DE LA REACCION
  9. 9. PCR TIEMPO REAL Curvas melting: • Permite distinguir los productos específicos de los inespecíficos en la PCR ej. “dimeros de primers”
  10. 10. Monitoreo continuo de la reaccion
  11. 11. CARGA VIRAL bDNA (branched chain DNA o DNA arborizado) •Hibridación de sondas al DNA o RNA viral •No existe una aplificacion de la cadena (templado) base •Acidos nucleicos se adhieren a una placa a la cual se le adhiere una sonda •Uso de sonda específica en el DNA. •Esta sonda y no los ácidos nucleicos la que realiza la amplificación.
  12. 12. CARGA VIRAL bDNA (branched chain DNA o DNA arborizado) •Se basa en la hibridación y acoplamiento de sondas moleculares a un amplificador (bDNA). La técnica se realiza en tres pasos : •Primera: hibridación y captura del ácido nucleico viral. –Uso de enzima proteolítica: proteinasa K. –Detergente para la lisis de viriones y liberación de ácido nucleico viral. RNA blanco –Uso de buffer con dos tipos de sondas específicas, una facilita Lisis viral, degradación y liberacion la captura y otra amplifica la de RNA señal.
  13. 13. Hibridación y captura RNA blanco por sondas Sondas de hibridación de DNA Hibridación de Amplificación amplificadores a pre amplificadores de ADN Sondas de Pared captura Hibridación de pre amplificadores a zondas de ADN Pre Amplificacion
  14. 14. CARGA VIRAL •Segunda: Acoplamiento de las secuencias virales al amplificador bDNA. •Tercera: union de fosfatasa alcalina a la molécula de bDNA unida al ácido nucleico viral blanco. •Dioxetano = señal luminosa amplificada por micelas de fluoresceina en el substrato. •El resultado final leído en un luminómetro. •La señal absoluta de cada muestra es proporcional a la cantidad de virus presente en la muestra
  15. 15. Sondas de marcaje (FA) Union sondas de marcaje a amplificadores de Generación de señal ADN Adicion de dioxetano y generación de señal
  16. 16. CARGA VIRAL
  17. 17. CARGA VIRAL NASBA (Ampliación secuencial de Ac Nucleicos ) •Amplificación basada en la transcripción. •Accion de 3 enzimas: –Transcriptasa inversa: sintesis de DNA en RNA o DNA plantilla –RNasa H : Degradacion de RNA en DNA (RNA hibrido) – RNA polimerasa: sintesis de RNA a partir del DNA plantilla •Aislamiento del RNA o DNA problema del plasma. •RNA se convierte en DNA (transcriptasa reversa) •DNA se convierte nuevamente a múltiples copias de RNA
  18. 18. Transcriptasa Primer 2 Extension del Primer Transcriptasa RNAsa RNAsa Transcriptasa Primer 2
  19. 19. RNAsa Transcriptasa Primer 2 Primer 1 Transcriptasa: sintesis de DNA antisentido Transcriptasa P2 DNA 3’ 3’ P1
  20. 20. Transcripción y sintesis de RNA Transcriptasa DNA RNA polimerasa P2 P1 Transcripción y sintesis de RNA Transcriptasa RNA polimerasa P2 RNA P1
  21. 21. Transcripción y sintesis de RNA RNA P2 RNA polimerasa P1 Transcriptasa •Producción de RNA de cada copia de DNA (proceso de amplificación isotermica) •Detección basada en un método de electroquimioluminiscencia. –Emisión de luz por parte de átomos de rutenio unidos al RNA amplificado. –Se cuantifica y extrapola sobre una recta obtenida a partir de la emisión de los calibradores.
  22. 22. USOS CARGA VIRAL •Uso masivo en VIH, hepatitis B, C y CMV •“Diagnostica” •Monitoreo terapeutico –Inicio. –Respuesta –Cambio o falla •Pronóstico –Progresion de la enfermedad –Sobrevida •Transmisión vertical. •Identificación de pacientes con riesgo de infección
  23. 23. CARGA VIRAL Para el monitoreo de la infección virales se requiere de metodologías que tengan : 1. Alta sensibilidad: permite detectar individuos tempranamente con riesgo de enfermedad 2. Potencial para detectar los casos positivos y medir la carga viral durante tratamiento. 3. Rapidez para permitir inicio y/o cambio de Tx. 4. Reproducibilidad. CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, July 1998, p. 533–554
  24. 24. CARGA VIRAL EN INFECCION POR VIH •Indicador directo del total de virus producidos en la células de los pacientes infectados. Science 1996;271:1582-5 •Viremia en infección por VIH: 0.4 a 3.2 x 10 10 viriones por dia. Nature 1995;373:117-126 “Pacientes con carga viral alta desarrollan SIDA en un corto tiempo por la gran producción de virus y destrucción células que sobrepasa la capacidad de produción y sustitucion de células CD4.”
  25. 25. INFECCION MUERTE seroconversion asintomatico sintomático SIDA 1000 Linfocitos CD4 500 cel/mm3 0 109 107 105 CARGA VIRAL (copias/ml) 103 101 4-8 sem mas de 12 años . 2-3 años
  26. 26. Indicación Clínica Información Uso Establece Dx cuando Síndrome HIV prueba de Ac es Diagnostico agudo indeterminada Evaluación inicial “Línea Base” Inicio o no terapia Cada 3-4 meses Cambios en carga en pacientes sin Inicio de Tx viral Tx 4-8 sem. post. a Continuar o Eficacia terapéutica inicio de Tx cambiar Tx Máximo efecto Continuar o 3-4 meses post. terapéutico cambiar Tx Cuadro clínico o Asociación con Continuar, iniciar o disminución CD4 cambios en CV cambio de Tx
  27. 27. Correlación entre la cantidad de Sasksela y col. RNAm HIV en células mononucleres Ann Intern. Med. periféricas y progresión a SIDA con CD4 1995;123:641-644 >600 mm3. Carga Viral fue el mejor indicador de Mellor JW y cols. progresión a SIDA. “El peso de la Science1996;272: cuenta de CD4 como indicador para 1167-1170 progresión de la enfermedad depende de la carga viral del paciente”. Dickover RE y col En mujeres embarazadas, el JAMA 1996; 275:599-605 conocimiento de carga viral ayuda a Volberding PA. predecir el riesgo de transmisión Lancet 1996;347:71-3 transplacentaria del VIH.
  28. 28. Cuenta de CD4 y niveles de RNA HIV como O’Brien WA y cols. indicadores de progresión a SIDA y muerte. Ambos N Engl J Med pueden usarse para clasificación clínica y decidir 1996;334:426-431 tratamiento. CV fue el mejor indicador de progresión de la Mellors JW y cols. Ann enfermedad seguido (en orden de valor predictivo) Intern Med 1997;126:946- de cuenta de CD4, niveles de neopterina, beta 2 54 microglobulina, fiebre etc. Hughes MD. Y cols. Ann Intern Med Concluyeron que la combinación de medición de 1997;126:929-38 carga viral y CD4 proveen mejor información para O’Brien WA y cols el pronostico que cualquier factor solo. Ann Intern Med 1997;126:939-45 Cada disminución de 0.5 log en CV se asocia con un 30% de reducción en el riesgo o progresión clínica. Un incremento en el 10% en CD4 se asocia en 15% de reducción en el riesgo.
  29. 29. CARGA VIRAL EN VIH INICIO DE TRATAMIENTO: Sociedad Internacional de SIDA (2000) CV>30,000 copias/ml o CD4 < 350 por mm3 (0.35 x 109 /L). Carpenter et al JAMA 2000;283:381-90 Asociacion VIH Britanica (BHIVA): CV>30,000 copias/ml y una cantidad de CD4 < 350/ul. Guidelines for the treatment of HIV infected adults with antiretroviral therapy of British HIV association.Junio 2000 Www.adismap.com/bhiv, Departamento de Salud EU/Fundación Henry Kaiser. CV>10,000-20,000 copias/ml mas CD4 <500 por mm3 (0.50 x 109 /L). Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV infected adults and adolescents (August 13,2001) www.hivatis.org/guidelines
  30. 30. CARGA VIRAL EN VIH MONITOREO: CV al tiempo del diagnostico y cada 3-4 meses en pacientes no tratados. CV debe medirse antes y 2-8 sem de inicio de tratamiento Objetivo del Tratamiento: Menor cantidad de copias de RNA viral por el mayor tiempo posible. Reducción inicial a 2- 8 sem. Por debajo de los niveles detectables (<50 copias/ml) 16-20 sem.
  31. 31. CARGA VIRAL VIH PRONOSTICO: La CV se relación a con progresion de la infección y supervivencia. CV>40,000 copias/ml : 62% de pog. a SIDA en 5 años y una supervivencia a 5 años del 51%. CV<5,000 copias/ml : 8% de prog. a SIDA en 5 años y supervivencia de 95% a 5 años SIDA/ETS 1997;1:27-30
  32. 32. CARGA VIRAL EN VIH Cambios en la carga viral: Cambio significativo entre una y otra : 0.5 log10 Existen variaciones relacionadas al procedimiento (menos de 0.3 log) Puede haber discordancia entre los niveles de carga viral y la cuenta de CD4
  33. 33. CARGA VIRAL EN VIH • “Debido a la dinámica de la replicación viral in vivo, pacientes que han suspendido algunas dosis del Tx previas a la medición de la CV, experimentan un incremento transitorio que puede ser considerado como falla al tratamiento”. Ann Intern Med 1997;126:983-85 • Ninguna decisión deberá tomarse solamente con un solo resultado de CV.
  34. 34. CARGA VIRAL EN VIH Factores que afectan la medición de la carga viral: Tipo de anticoagulante (depende del método utilizado). Para PCR- EDTA o ACD. Tiempo de proceso Presencia de eventos agudos e inmunizaciones aumentan la carga viral.
  35. 35. CARGA VIRAL EN CMV Citomegalovirus: • Causa infeccionsa importante de morbi/mortalidad post transplante – Primaria: receptor seronegativo – Secundaria: receptor seropositivo (reactivación endogena o exogena (injerto) • Enfermedad por CMV (ECMV) post transplate: inespecifica, neumonitis, encefalitis, enterocolitis, rinitis etc. • RECHAZO • Capacidad inmunodepresora: infeccion por oportunistas “PROFILAXIS”
  36. 36. TABLA 1. Enfermedad por CMV en receptores de órganos Frecuencia de Organo Organo enfermedad por predispuesto a la transplantado CMV(%) infección Riñón 8–32 Hígado Hígado 22–29 Corazón 9–35 Riñón - Pancreas 50 Pancreas Intestino delgado 22 Intestino corazón-pulmón 39–41 Pulmones
  37. 37. CARGA VIRAL EN CMV El estudio virológico tiene como objetivos: a) Conocer el estado inmune frente al CMV del donante y receptor, previo al trasplante, para valorar el riesgo de infección o de ECMV, b) Diagnosticar precozmente la infección o la ECMV, c) Guiar el inicio del tratamiento específico, d) Monitorizar la respuesta a dicho tratamiento. e) Detectar la aparición de cepas resistentes.
  38. 38. CARGA VIRAL EN CMV ¿Porque hacer carga?: • Variedad de presentación de ECMV. • Diferenciarlo de infecciones por oportunistas, efecto tóxico de drogas o rechazo de transplante. • Viremia asintomatica puede alterar curso post transplante • Asociación con rechazo (renal) o disfunción organica (corazón) • Dsiminución de la sobrevida • Recurrencia de infección por CMV (25-36% higado,6-31% riñon, 12% corazón) • D+/R-, D-/R+ Clin. Microbio. Rev. Jan 2000:83-121
  39. 39. CARGA VIRAL EN CMV “Diseminación de CMV en la sangre es un factor de riesgo para progresión a la enfermedad por CMV”. • Pacientes tranplantados MO N. Engl. J. Med 1995. 324:1005–1111. J. Infect. Dis 1990. 162:373–380. • Transplantes organos solidos y pacientes con HIV (menor valor predictivo) Clin. Infect. dis 1997. 24:824-829 J. Infect. Dis. 1997. 176:1146–1155. • Identificación de pacientes para profilaxis (gangciclovir, valaciclovir etc) J .Clin Microbil. 2000,38: 563-569,
  40. 40. Probabilidad de adquirir enf por CMV con carga viral aumentada (Transpl. renal) [Aitken, et al.; 1999. JCM. 37: 2804]
  41. 41. CARGA VIRAL EN CMV • Altos niveles de DNA viral se asocian con el desarrollo de sintomatologia en receptores • Carga elevada = desarrollo de infección por CMV en 2 meses • Inicio de Tx = disminución carga “Predice ECMV” • Carga viral plasmática de 1,000-5,000 copias/ml en receptores de órgano sólido • Carga de 400 copias/ml en receptores de médula
  42. 42. Tabla: PCR cuantitativo: limites y presentaciones en diferentes pacientes Transplante Referencia No Pac. Limites Presentación Renal Fox et al 103 >106 copias/ml Alta orina asociacion con ECMV Kuhn et al 58 >1,000 copias por Valo cada 106 copias de predictivo DNA cel. alto para ECMV Cope et al 196 Por cada 0.25 log 2.8% de aumento carga incremento CMV de riesgo de ECMV Toyoda et al 25 >500 copias por Aumenta 1ug del total de riesgo de DNA ECMV Hígado Cope et al 162 Por cada aumento 2.87% de 0.25 log incremento de riesgo de ECMV
  43. 43. Tabla: PCR cuantitativo: limites y presentaciones en diferentes pacientes Transplante Referencia No Pac. Limites Presentación Corazón Toyoda et al 95 > 500 copias de Aumenta DNA riesgo de ECMV Medula Zaia et al 117 >104 copias/ml Aumenta Osea plasma riesgo de ECMV 100 dias post Gor et al 110 >104 copias/ml Aumnento de plasma riesgo 6-10% VIH Shinkai et al 94 >100 copias/ml Valor plasma predictivo alto para ECMV Rasmussen 75 >320 copias por ug Asociacion et al de DNA con retinitis Bowen et al 97 Cada 0.254 los de 1.37% aumento aumento reisgo
  44. 44. CARGA VIRAL EN CMV Recomendaciones (WORKSHOP) • Serologia (serostatus) • CV en plasma, leucocitos u organos. • CV una sem antes de Tx • CV durante Tx para documentar resistencia • Post Tx, continuarlo 1 semana con CV negativa
  45. 45. CARGA VIRAL EN HEPATITIS C Virus hepatitis C: •Virus RNA , flavovirus, existen 6 genotipos con casi 100 quasiespecies •Genotipo 1menor respuesta a interferon. •Genotipo 2 y 3 mejor respuesta a interferon. •50-80% evolucionan a cronicidad •En méxico 60% genotipo 1b •Regiones para genotipificación: NS5B o E1
  46. 46. CARGA VIRAL EN HEPATITIS C •Cantidad de virus específicos en un volumen dado de sangre (1ml=1cc) •Incidencia en el curso clínico= carga viral y genotipo •Estandarización para reporte (OMS) •Uso de UI = cantidad de RNA •Carga viral: –Establece pronóstico –Indica y valora eficacia al tratamiento •Genotipo: –Marcador de predicción de respuesta a Tx –Duración de Tx –Seguimiento epidemiológico.
  47. 47. CARGA VIRAL EN HEPATITIS C •Carga viral de base •Pacientes genotipo 1 CV a las 12 sem de Tx = valora respuesta virologica temprana (disminucion 2 logaritmos de carga o idetectable) •Genotipo 2 y 3 no requiere (buena respuesta) •CVa los 6 meses post a Tx valora respuesta virologica sostenida: –24 sem al genotipo 2 y 3 –48 sem al genotipo 1
  48. 48. CARGA VIRAL EN HEPATITIS C •Objetivos Tx: –Erradicar la infección viral, –Evitar la progresión –Eliminar el riesgo de contagio •Indicación Tx: – Menores de 60-65 años. – Elevación persistente de ALT. – Virémicos (necesaria carga viral) – Datos de hepatitis crónica y fibrosis en la biopsia hepática. Tx para todos = Idealmente SI
  49. 49. Razones a favor Razones en contra Prevalencia del 1-3 % en la población En algunos pacientes, la progresión es general. lenta. Causa frecuente de hepatitis. Tasas variables de progresión a fibrosis Indicación frecuente de trasplante Se trata de un tratamiento caro, y sólo hepático (50% en nuestro medio). eficaz en el 50%. Evolución progresiva con aparición Los efectos colaterales de la de complicaciones. medicación, son importantes y limitantes de la dosis. Beneficios del tratamiento en un plazo Administración parenteral (interferón) corto. Beneficios del tratamiento a largo Tratamiento prolongado (hasta 12 plazo meses). Mejoría de la calidad de vida en los que responden el tratamiento Tratamiento con una buena relación coste-beneficio
  50. 50. CARGA VIRAL EN HEPATITIS C Conclusiones Grupos de trabajo (Criterios): •Niveles de ALT elevados, al menos desde los seis meses anteriores. •Detección de RNA del VHC en suero. •Enfermedad hepática compensada •Paciente capaz de seguir el tratamiento y los controles. •Seguridad de una abstinencia en el consumo de alcohol y drogas. •Biopsia hepática con fibrosis. •Ausencia de contraindicaciones.
  51. 51. CARGA VIRAL EN HEPATITIS C Factores pronósticos de una buena respuesta al Tx •Edad menor de 40 años. •Sexo femenino. •Estadío de fibrosis grados 0-1, frente a grados 3-4. •Viremia <2 x 106 copias/ml. (Carga Viral necesaria) •Genotipos diferentes del 1, 4 y 5. Duracion del Tx: •Genotipo 2 y 3 seis meses. •Genotipos 1, 4 ó 5: 12 meses, “Excepto si la carga víral basal es <800.000 UI/ml”. Carga viral necesaria
  52. 52. CARGA VIRAL EN HEPATITIS C Carga viral: valoracion de respuesta terapeutica •Post al Tx curación = respuesta •Respuesta bioquímica, virológica e histológica, – ALT normal. – Negativización del RNA – Disminución del índice de actividad histológica. •Final del tratamiento respuesta primaria. •Respuesta mantenida: RNA viral negativo 6 meses post a fin del tx •Carga negativizada a los 3 meses de TX = buen pronóstico
  53. 53. "NO ES POBRE EL QUE TIENE MENOS, SINO EL QUE DESEA MÁS. NI RICO EL QUE MÁS TIENE, SINO EL QUE MENOS AMBICIONA. EL QUE VIVE CONFORME A LA NATURALEZA, NUNCA SERÁ POBRE; EL QUE VIVE ATENTO AL QUE DIRÁN, JAMÁS SERÁ RICO. LA NATURALEZA EXIGE MUY POCO, LA OPINIÓN DEL MUNDO MUCHÍSIMO" Lucio Anneo SÉNECA (c. 5-65) Epistolae, 16

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