S. Anim. Módulo 3. MUESTRAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO.

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3.1 Requisitos de las muestras
3.2 Toma de muestras de sangre y leche para análisis serológico
3.3 Toma de muestras para estudio coproparasitológico
3.4 Toma de muestras para prueba de mastitis
3.5 Técnicas de diagnóstico más comunes en el laboratorio de salud animal

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S. Anim. Módulo 3. MUESTRAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO.

  1. 1. SALUD ANIMALSALUD ANIMAL ZOO 300ZOO 300 Módulo # 3Módulo # 3
  2. 2. Módulo 3. MUESTRAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO. 1. Requisitos de las muestras 2. Toma de muestras de sangre y leche para análisis serológico 3. Toma de muestras para estudio coproparasitológico 4. Toma de muestras para prueba de mastitis 5. Técnicas de diagnóstico más comunes en el laboratorio de salud animal
  3. 3.       Requisitos de una muestra para Laboratorio 1.Ante todo en la obtención de una muestra tenemos la higiene con la que se colecta la misma. 2.Cantidad, hora y lugar de su obtención. 3.La identificación correcta del tipo de material y del animal u otra fuente en cuestión. 4.Correcto almacenaje y transporte hasta el laboratorio. 5.Tipo de diagnóstico solicitado y diagnóstico presuntivo. Nota: El material donde se toma la muestra en muchas ocasiones se convierte en determinante para que esta se altere. Hoy en el mercado se consiguen todos los elementos necesarios que garantizan esterilidad, conservación de la muestra, además de su fácil manejo en el campo y comodidad para el transporte.
  4. 4. Tubos al vacío para toma de muestra de sangreTubos al vacío para toma de muestra de sangre con anticoagulantecon anticoagulante   Los colores de los tapones son de convención internacional que aplica en todas las marcas.   Tubos con EDTA, tapón lila, de capacidades 3.0 a 10.0 ml. Es el anticoagulante que mejor conserva las células y de mayor uso en todos los casos que se requieren exámenes de cuadro hemático y hemoparásitos. Tubos con Citrato de Sodio, tapón azul claro, de capacidades de 3.0 a 10.0 ml. Se usan cuando se requieren pruebas de coagulación y no se recomienda para cuadro hemático y hemoparásitos por la baja capacidad que tienen de conservar la morfología celular. Tubos con heparina, tapón verde. Se usan para realizar algunas pruebas inmunológicas que detectan antígenos. No se recomiendan para cuadro hemático por la baja capacidad conservadora. Alternativa: Cuando por fuerza mayor no se dispone del tubo nuevo al vacío adecuado, se puede recurrir a preparar tubos con EDTA, siempre y cuando el tubo sea de vidrio neutro, especial para laboratorio, perfectamente lavado con detergente neutro, enjuagado con agua destilada y seco al calor. Se puede usar con dos gotas de EDTA al 10 % para 5 ml de sangre y 3 para 10 ml.
  5. 5. Tubos al vacío para toma de muestras de sangreTubos al vacío para toma de muestras de sangre sin anticoagulantesin anticoagulante Por convención tienen tapón rojo, y vienen en capacidades de 3.0, 5.0, 7.0 y 10.0 ml Estos tubos son de vidrio o plástico neutros protegido con silicona para evitar la hemólisis y facilitar la retracción del coágulo. Adicionalmente se pueden utilizar como recipiente estéril para muestras de bacteriología. Tubos de estas mismas características pueden venir adicionados de un gel activador de coagulación o gel para separar el coágulo del suero sin necesidad de usar otro tubo. Alternativa: Cuando por fuerza mayor no se dispone de tubos al vacío nuevos, se puede usar tubos de laboratorio tratados (lavados con detergente neutro, enjuagados con agua destilada y secos al calor) No se debe usar esta alternativa cuando se requieres análisis de minerales.
  6. 6. AgujasAgujas Agujas para toma de muestras con tubos al vacío Normalmente de calibre 20 G, color amarillo, 21 G color verde, 22 G color negro con longitudes de 1 a 1 1/2 pulgada, para animales mayores (seleccionar de acuerdo con el vaso sanguíneo a puncionar). Tambien se pueden emplear agujas hipodérmicas estériles y desechables. En el mercado hay un amplio surtido (longitud de 1/2 a 1 1/2 pulgadas y calibres 18 a 30 G). Las mas usadas son 18, 19, 20 y 21 con longitudes de acuerdo con la práctica de inyectología que se quiera manejar. Escobillones o hisopos estériles Son irreemplazables cuando se quiere tomar muestras para cultivo bacteriológico de secreciones, abscesos, órganos afectados y frotis para citología exfoliativa. Escobillones con medio de transporte (Culturette). Hay para bacterias aerobias, anaerobias y uno modificado que permite el aislamiento de estos dos grupos de microorganismos. Son indicados cuando la muestra demora más de 12 horas para llegar al laboratorio, el transporte se puede hacer a temperatura ambiente, los microorganismos se mantienen viables sin proliferación de carga microbiana contaminante. Escobillones o hisopos secos. Preparados en tubos de vidrio o plástico estériles, pero por carecer de humedad y Medio de cultivo, tienen poca capacidad para conservar la viabilidad de los microorganismos a pesar de que se mantengan refrigerados. Cuando al tomar la muestra se observa que el algodón queda prácticamente seco, se recomienda humedecerlo con solución salina fisiológica estéril para evitar la muerte bacteriana por desecación.
  7. 7. Frascos de Boca Ancha y tapa herméticaFrascos de Boca Ancha y tapa hermética   Por seguridad se prefieren los de material plástico a los de vidrio. Son útiles para la toma y manejo de muestras de materia fecal, orina e histopatología. Algunas marcas ofrecen material estéril que los hace útiles para estudios bacteriológicos. Frascos de capacidad de 30 a 100 ml son suficientes para manejar cualquier muestra. Alternativa: Guantes o bolsas plásticas Bolsas plásticas estériles con selle alambrado Útiles para toma de muestras de leche, tejidos para bacteriología y muestras de agua. Se consiguen en diferentes capacidades de acuerdo con las necesidades, por ejemplo las de dos onzas es la que más se utiliza para muestras de leche.
  8. 8. Identificación de las muestrasIdentificación de las muestras    Siempre utilice un marcador resistente al agua o en su defecto un lápiz de cera. Cuando se humedecen las muestras y se ha usado un marcador soluble en aguase pierde la identificación y con ello el trabajo de haber tomado varias muestras. Cuando se usan los recipientes adecuados estos tienen espacios para identificar la muestra, normalmente muy bien adheridos. Cuando tenga necesidad de usar cinta o esparadrapo asegúrese que este rodee completamente el tubo o frasco. Transporte de muestras Por norma general lo ideal es que las muestras lleguen al laboratorio lo antes posible y para cada tipo de muestra y análisis solicitado, en el capítulo correspondiente se fijarán las condiciones de tiempo y temperatura requeridas. Transporte de muestras no refrigeradas Cuando la muestra puede llegar al laboratorio en menos de 4 horas o cuando la muestra enviada no requiere refrigeración, las muestras pueden ser transportadas a temperatura ambiente en un lugar fresco protegidos de los rayos directos de la luz y del sol, evitando las vibraciones.
  9. 9. Transporte de muestras refrigeradas Al empacar muestras que deben ser enviadas refrigeradas tenga en cuenta las siguientes recomendaciones: •Esté seguro que las muestras estén identificadas con marcador resistente al agua •Utilice una caja o termo proporcional al tamaño o número de muestras a enviar. •Evite que los envases entren en contacto directo con el hielo. Para esto cuando use bloques de hielo mézclelos con aserrín, o cascarilla o coloque los tubos dentro de una bolsa plástica. Cuando utilice bolsas refrigerantes envuelva los tubos en papel periódico, colóquelos en una bolsa plástica y así envíelos en la caja termo. •Prepare una historia clínica que incluya, nombre del propietario, ubicación de la finca, raza, nombre o número de los animales, análisis solicitados. Cuando se incluyen los síntomas clínicos se facilita la interpretación de los resultados obtenidos. Recuerde que el laboratorio trabaja de lunes a Viernes de 8 am a 4 pm, por esto las muestras deben ser enviadas entre lunes a miércoles y evitar problemas de almacenamiento y temperatura durante el fin de semana.
  10. 10. Tipos de muestrasTipos de muestras
  11. 11. Sangre sin anticoagulante Sirve para obtener suero sanguíneo Aplicaciones Para realizar todos los ensayos inmunológicos como Brucelosis, Leptospirosis, Diarrea Viral entre otros, determinaciones de Química sanguínea como Minerales, enzimas etc., Se utilizan tubos al vacío tapa roja, para obtener suero se requieren mínimo 5 ml de sangre sin anticoagulante. Se deja el tubo a temperatura ambiente en un ángulo de 30° por unos treinta minutos. Precauciones La alteración es la hemólisis que se produce por la ruptura de los glóbulos rojos. Las causas más frecuentes para esto son el uso de tubos o agujas húmedas, envases de vidrio que no sea neutro, como frascos de alimentos y medicamentos, presencia de residuos de detergente, exposición directa a los rayos solares, almacenamiento a temperaturas no adecuadas. Cuando se ha utilizado jeringa y aguja, el exceso de presión en el émbolo a la toma o al transvasar al tubo pueden producir hemólisis por esto retire la aguja y permita que la sangre fluya por las paredes del tubo suavemente. Transporte Si la muestra llega al laboratorio antes de 4 horas, se puede transportar a temperatura ambiente de lo contrario envíelas refrigeradas.
  12. 12. Sangre con anticoagulante Aplicaciones Para Cuadro Hemático, Investigación de Hemoparásitos, Investigación de factores de Coagulación, Determinación de algunos Antígenos. Se utilizan tubos al vacío de tapón LILA (EDTA) para Cuadro Hemático y Hemoparásitos, tubos tapón AZUL (Citrato de sodio) para determinación de factores de coagulación y tubos tapón VERDE (Heparina) para determinación de Antígenos. Precauciones No use agujas húmedas porque que se produce hemólisis. Permita que el tubo se llene hasta las 2/3 partes. Una vez tomada la muestra homogenizar invirtiendo el tubo suavemente 5-10 veces, esto con el fin de mezclar el anticoagulante con la sangre para evitar la formación de coágulos los cuales afectan el procesamiento de la muestra. Si hay coágulos se debe tomar la muestra nuevamente. Esta muestra debe llegar a laboratorio el mismo día de tomada para que no haya alteración de la morfología celular. Envíe la muestra refrigerada si se va a tardar más de dos horas antes de llegar al laboratorio. Para diagnóstico de Filaria debe traerse la muestra en tubo con heparina.
  13. 13. Investigación de Hemoparásitos Es necesario tener en cuenta que los glóbulos rojos infestados con Babesia o Anaplasma son más pesados y tienen tendencia a permanecer adherido a los pequeños vasos. Por esto las muestras de sangre tomadas por punción capilar periférica tienen mas y mejores posibilidades de diagnóstico. De igual manera los glóbulos rojos parasitados se lisan mas rápidamente y por esto una muestra con mas de tres horas de tomada, a pesar de haber sido refrigerada puede dar falsos negativos. No se justifica enviar sangre para investigación de hemoparásitos cuando esta va a durar mas de 6 horas en llegar al laboratorio, empaque y envíe refrigerado.
  14. 14. Preparación del frotis Para mejorar la posibilidad de diagnóstico de Hemoparásitos se debe practicar un frotis de sangre en el mismo momento de la toma de la muestra preferiblemente utilizando sangre obtenida por punción capilar, (oreja en bovinos, labio o pulpejos en caninos o al menos a partir de la que se ha tomado en el tubo. Un frotis delgado y fijado al aire garantiza la permanencia casi indefinida de los glóbulos rojos parasitados. Identifique la lámina portaobjetos con el número de la muestra. Coloque una pequeña gota en un extremo de la lámina. Coloque otra lámina portaobjetos delante de la gota, manteniéndola en un ángulo de 25 a 35° y deslícela suavemente hacia la gota hasta que se esparza la sangre hacia los lados, llevar la lámina hacia delante con un movimiento sostenido en el mismo ángulo para que el frotis quede delgado y largo, dejarlo secar al aire. Prepare dos frotis por muestra. Empaque las láminas en papel Bond separadas por palillos. Cuando tenga que enviar las muestras refrigeradas no incluya las láminas de los frotis dentro de la caja ya que la humedad los desprende. Hágalo dentro del sobre remisorio protegidas entre dos cartones.
  15. 15. Estudio parasitológico en equinos, bovinos, ovinos y caprinos La materia fecal debe ser tomada directamente del recto usando un guante de palpación nuevo. Coloque 20 a 30 gramos en un recipiente de boca ancha limpio y seco, que permita su fácil transporte y manipulación en el laboratorio. Identifique correctamente. Con esta cantidad es suficiente para parásitos gastrointestinales y coccidias, así como para fasciola hepática y parásitos broncopulmonares. En caso de no disponer del frasco plástico de boca ancha, al sacar la mano enguantada, invierta el guante, desplace la materia fecal hacia los dedos, anúdelo e identifíquelo correctamente. Transporte Si las muestras llegan el mismo día al laboratorio pueden ser transportadas a temperatura ambiente, protegidas de la luz, en el sitio más fresco posible. Si la muestra llega al laboratorio antes de 24 -36 horas, empaque y envíe en forma refrigerada. Cuando el transporte demora mas de 36 horas, o no tenga forma de enviar la muestra refrigerada, agregue formol puro a la dosis de 1 cc. por cada 10 gramos de materia fecal con el fin de preservar la muestra. Homogenice e identifique la muestra. Estas muestras NO sirven para bacteriología, parásitos broncopulmonares o protozoarios flagelados. Precauciones Las muestras no preservadas pueden durar hasta 24 - 36 horas antes de llevar al laboratorio, siempre y cuando sean mantenidas en refrigeración. No las congele.
  16. 16. Muestras para Coprocultivo (todas las especies) Las enterobacterias cuando se comportan como patógenas causando enteritis se encuentran adheridas a la mucosa del intestino. Por esto el éxito de un coprocultivo depende fundamentalmente de la calidad de la muestra durante la toma, envase y transporte. Procedimiento La forma mas adecuada, es utilizando un escobillón con medio de transporte (Culturette). Siguiendo las instrucciones de manejo del Culturette, introduzca el hisopo en el recto, rótelo haciendo un frotis sobre la mucosa rectal, retírelo e introdúzcalo nuevamente en el tubo del sistema. Cierre, identifique, y envíe al laboratorio a temperatura ambiente. Si la muestra no viene en medio de transporte, y se ha utilizado un escobillón de algodón común, asegúrese de mantener la humedad del escobillón ya sea con la adición de una pequeña cantidad de materia fecal del animal muestreado o en su defecto con 1 o 2 mL. de solución salina fisiológica estéril. En estos casos si va a demorar mas de 12 horas en llegar al laboratorio, envíela en refrigeración. Otras alternativas: En grandes animales se puede tomar una muestra del recto con un guante de inseminación, nuevo, e introducir en un recipiente estéril 5 a 10 gramos de heces. Envíe en refrigeración. Para tener seguridad de aislamiento de enterobacterias patógenas se requieren tres coprocultivos (seriado) con mínimo 24 horas de diferencia.
  17. 17. Tejidos Las muestras de tejido se obtienen durante la necropsia ya sea para estudio microbiológico o histopatológico. Para los dos tipos de estudio, el éxito de los análisis dependerá de la prontitud con que se haga la necropsia después de la muerte del animal. No es posible fijar un tiempo máximo dentro del cual se practique la necropsia, ya que los tiempos para que se presente la descomposición varían mucho de acuerdo con la temperatura ambiente y más aún con la enfermedad que haya afectado el animal. Es importante recordar que una vez se inician los procesos autolíticos las lesiones histopatológicas, de una parte, se hacen de difícil determinación y bacteriológicamente el tejido autolisado es invadido por microorganismos contaminantes. En este caso el envío de la muestra será una perdida de tiempo y no se podrá realizar un diagnóstico exitoso en el laboratorio.
  18. 18. Para Histopatología Procedimiento Haga cortes delgados de máximo 1 cm de grueso desde la superficie hasta la mitad del espesor del órgano a examinar. Seleccione fragmentos de tejidos en las zonas de interfase es decir, que tengan tejido lesionado y tejido normal. Coloque los tejidos seleccionados en una solución de formol al 10 %. La relación debe ser 1 parte de tejido por 10 de formol. Los tejidos huecos como intestino, vejiga, útero, deben ser abiertos para que se produzca una buena fijación. Los cortes de vísceras sólidas deben hacerse perpendicularmente a la superficie para demostrar su estructura anatómica e incluir el borde natural de la víscera. Si hay lesiones focales o pequeñas remítalas, incluyendo en el corte parte de tejido sano. Empaque y Transporte Utilice frascos de boca ancha preferiblemente de plástico para evitar accidentes. Identifique correctamente, las muestras pueden ser conservadas y enviadas a temperatura ambiente sin existir restricciones de tiempo para llegar al laboratorio, debido a que el material una vez fijado, no sufre alteraciones. Adjunte un listado de los órganos remitidos, la historia clínica y todos los hallazgos de necropsia incluyendo extensión, color, consistencia de los tejidos etc. Enuncie un diagnóstico presuntivo de acuerdo con los hallazgos clínicos y de necropsia. Esta información es muy útil para que el patólogo pueda hacer una correlación clínica con los hallazgos histopatológicos.
  19. 19. Para cultivo bacteriológico o aislamiento viral El éxito de un aislamiento bacteriano o viral a partir de una muestra de tejido depende fundamentalmente de lo oportuno que haya sido la toma de la muestra, las condiciones de asepsia de la toma y de la conservación durante el transporte. Para aislamiento de algunos virus se requieren muestras y medios especiales de manejo por esto, es importante que se consulte con el laboratorio adonde se enviarán y sobre la forma adecuada de hacerlo. Procedimiento Tome las muestras de la manera más aséptica posible. Haga cortes de los órganos con lesiones en trozos de mas o menos 5 cm de espesor y deposítelos en un recipiente estéril. La primera opción es una bolsa de polietileno estéril o en su defecto un frasco de vidrio estéril. Es posible higienizar frascos o tubos de ensayo sometiéndolos a ebullición por 30 minutos y secado en aire caliente. Las muestras de intestino deben enviarse con los extremos atados y en recipiente separado. Transporte Es indispensable el envío en refrigeración, independientemente del tiempo que transcurra para llegar al laboratorio. Deben ser remitidas con historia clínica y datos de necropsia.
  20. 20. Orina En las muestras de orina se pueden realizar diferentes análisis como son, parcial de orina, urocultivo, determinación de residuos de medicamentos Doping y Leptospira. El éxito de cualquiera de estos exámenes dependerá de la técnica con que se tome la muestra y muy especialmente del tiempo transcurrido entre la toma y el análisis, puesto que el proceso de descomposición que se sucede en la orina por acción de las bacterias allí presentes, modifica los parámetros de los componentes y muy especialmente altera la carga microbiana. Una muestra de 5 a 10 mL es suficiente para los análisis. Urocultivo La muestra de orina debe tomarse preferiblemente por cistocentesis o durante la micción a mitad de chorro. Colóquela en un recipiente estéril de cierre hermético. Refrigere pero no congele. Envíe refrigerada al laboratorio lo más pronto posible. Parcial de orina Utilice un recipiente químicamente limpio, seco y provisto de tapa. La muestra se toma durante la micción, con sonda o por punción vesical. Reporte al laboratorio el método de toma. Enviar antes de 3 horas en forma refrigerada. Observación en campo oscuro (para diagnóstico de Leptospira) La muestra debe ser tomada como para urocultivo preferiblemente por cistocentesis y no debe transcurrir más de una hora de tomada, para llegar al laboratorio. Especifique el método de recolección (sonda, cistocentesis, directa, etc.). Enviar refrigerada.
  21. 21. Exudados Bajo esta denominación se incluyen muestras tomadas de distintos órganos o cavidades como abdominocentesis, artrocentesis, líquido cefaloraquídeo, abscesos, y secreciones uterinas que se remiten para cultivo bacteriológico, citología exfoliativa o determinación de algunos metabolitos como proteínas y glucosa. Por la especialidad y experiencia que demandan los procedimientos para tomar estas muestras, en este manual no se hace referencia a ellos y únicamente nos limitaremos a hacer observaciones sobre las condiciones del material de toma y de transporte que se deben aplicar para garantizar un resultado confiable.
  22. 22. Para cultivo bacteriológico Puestas en práctica todas las medidas de asepsia que se requieren y usando material estéril apropiado, haga la correspondiente punción del órgano afectado y extraiga la cantidad de exudado posible (mayor de 0.5 mL). Transporte Dependiendo del tiempo que se demore en llegar la muestra al laboratorio, puede aplicar los siguientes procedimientos: Jeringa de toma: Cuando la muestra va a llegar al laboratorio en menos de una hora, y transportada a temperatura ambiente, simplemente identifique la muestra y envíela al laboratorio en la jeringa asegurándose que la punta de la aguja esté introducida en un tapón de caucho. Esto evita que la muestra se salga o se contamine.
  23. 23. Tubo estéril: Cuando la muestra va a demorar mas de una hora pero menos de 12 horas en llegar al laboratorio esta debe ser enviada en forma refrigerada, para esto es necesario transferir las muestras de la jeringa a un tubo estéril, puede usar un tubo al vacío, nuevo, de tapa roja. Identifique la muestra y empáquela para enviar en refrigeración . Sistema Culturette: Cuando la muestra va a demorar mas de 12 horas en llegar al laboratorio, para poder mantener la viabilidad de los microorganismos, es necesario enviarla usando el sistema Culturette, que se maneja de acuerdo con las instrucciones del producto y en el caso de líquidos simplemente humedezca el hisopo con el líquido obtenido o permita que 0.5 ml del exudado vaya al fondo del tubo del sistema. Seleccione el Culturette de acuerdo con las necesidades de aislar bacteria aerobias o anaerobias y para el manejo siga las instrucciones la manipulación de escobillones con medio de transporte. En nuestro laboratorio se proveen estos materiales.
  24. 24. Secreciones uterinas Por la frecuencia con que estas muestras se envían al laboratorio y la carencia en el mercado de sistemas tipos Culturette con longitud apropiada para la toma de estas muestras, se sugiere el uso de catéteres nuevos de inseminación obtenido de un paquete nuevo, aunque no se garantizan esterilidad, son productos de muy baja contaminación siempre y cuando el paquete no se haya abierto. Procedimiento Previa limpieza, desinfección y secado de la vulva, introduzca el catéter a través del cuello uterino hasta el cuerpo del útero en la misma forma que un proceso de inseminación artificial, y con la ayuda de un pequeño tubo de caucho conecte el catéter a una jeringa nueva de 10cc y practique succión para que la secreción uterina ingrese al catéter. Con la mano que está fijando el cuello se puede hacer un masaje para facilitar el ingreso del líquido al catéter. Retírelo, límpielo externamente con una gasa y selle los extremos con cinta adhesiva o esparadrapo. Transporte Si la muestra puede llegar al laboratorio antes de 12 horas, se puede transportar a temperatura ambiente, protegida de la luz y en sitio fresco. De lo contrario debe ser manejada en refrigeración.
  25. 25. Semen Los análisis de laboratorio sobre muestras de semen se limitan a la evaluación de semen fresco o congelado para determinar porcentaje de motilidad, patologías, recuento de espermatozoides vivos por dosis y/o estudio microbiológico. Los análisis de semen fresco, son aconsejables de realizarse en campo, a no ser los microbiológicos y en estos casos, la forma de colecta, la higiene y conservación son de particular importancia. Transporte Por las características propias del semen congelado las muestras deben venir en el termo con nitrógeno líquido para tomar las pajillas directamente en el laboratorio. Cuando se requiere estudio microbiológico como prueba única, la muestra puede ser enviada ya descongelada pero mantenida en refrigeración.
  26. 26. Lavado prepucial Sobre las muestras de lavado prepucial se pueden investigar Campylobacteriosis, Trichomoniasis y microorganismos piógenos que pueden comportarse como enfermedades de transmisión venérea. Procedimiento Tomando las medidas de seguridad apropiadas, lavar el orificio prepucial con agua y jabón exhaustivamente, estimule la micción par que el toro orine completamente y seque muy bien el orificio prepucial. Con la ayuda de una banda elástica selle el orificio prepucial después de introducir un tubo de caucho en una extensión aproximadamente de 15 a 20 cm en la cavidad prepucial. Introduzca 100-150 mililitros de solución salina fisiológica o Ringer lactato, selle el extremo con una pinza hemostática. Masajear fuertemente de abajo hacia arriba para que haya el mayor desprendimiento posible del epitelio. Terminado el masaje permita que el líquido regrese al recipiente original. Transporte Las condiciones de transporte varían de acuerdo con el tiempo que demore la muestra en llegar al laboratorio y los exámenes a realizar. Menos de cuatro horas al laboratorio (a temperatura ambiente, protegida de la luz solar y de altas temperaturas). Cuando demora de 4 y 12 horas, para Trichomonas y de Campylobacter deben ser transportados en un medio de Cultivo. Para esto coloque 2 o 3 mL de la muestra obtenida en un tubo de Medio tioglicolato y el resto del recuperado, en el frasco donde viene la solución salina. No refrigere la muestra si se desea un diagnóstico de Trichomonas, de lo contrario si se puede refrigerar. Muestras que se demoren más de 12 horas en llegar al laboratorio, necesariamente tienen que ser manejadas en Medio de transporte.
  27. 27. Raspado de piel En estas muestras se investiga comúnmente presencia de Ectoparásitos, hongos y bacterias, con fines de identificación y Antibiograma. Procedimiento básico: Limpie muy bien el área afectada y área periférica sana con solución salina fisiológica estéril, no use ningún antiséptico. Retire las costras y escamas que estén sobre la lesión y seque con un paño de gasa estéril. Ectoparásitos Con una cuchilla de bisturí raspe la piel hasta lograr sangrado de la zona. Coloque una pequeña cantidad de muestra en un recipiente pequeño o en un recipiente de coprológico y asegúrese que se mantenga húmedo. Puede agregar 2 o 3 gotas de solución salina fisiológica estéril. Transporte inmediatamente al laboratorio a temperatura ambiente.
  28. 28. Hongos Con la ayuda de un bisturí raspe en la interfase de las zonas afectada y sana levantando escamas y pelos. Asegúrese de que la muestra incluye material sano y afectado. Coloque el material en un tubo seco y estéril y envíe al laboratorio. Cuando se solicita los dos análisis en el mismo animal, este seguro que ha raspado piel lesionada y sana y que no tenga incluido pelo en la muestra. Cultivo bacteriológico Si la lesión es en forma aerata y plana, proceda en la misma forma que con ectoparásitos y cuando tenga una superficie sangrante, impregne un hisopo estéril con movimientos de rotación sobre la zona raspada. Si la muestra va a demorar más de 6 horas en llegar al laboratorio utilice el sistema Culturette para la toma y el envío. Si la lesión es en forma de absceso, foliculitis por ejemplo, una vez limpia la zona, puncione el absceso con una aguja o la punta del bisturí y tome el material purulento con la ayuda del hisopo. Tenga en cuenta las recomendaciones para envío y transporte de cultivo bacteriológico.
  29. 29. Leche Sobre muestras de leche se pueden efectuar diagnóstico de mastitis, calidad higiénica y exámenes fisicoquímicos. Diagnóstico de mastitis, Cultivo y Antibiograma Materiales Tubo estéril o tubo al vacío con tapa porque garantiza la esterilidad., algodón, alcohol, papel para secar el pezón. Procedimiento Lave y seque muy bien el pezón haciendo especial énfasis en la punta. Con la ayuda de algodón y alcohol desinfecte la punta del pezón. Elimine los dos o tres primeros chorros y luego coloque entre 5 y 8 ml de leche en el tubo estéril evitando que partículas extrañas entren a él. Idenfíquelo según las instrucciones del numeral 2 señalando el nombre de la vaca y el pezón muestreado: AD, PD, AI , PI . No mezcle leche de diferentes cuartos y mucho menos de diferentes vacas para este análisis. Las muestras de leche para bacteriología deben tomarse antes de instaurar tratamientos con antibióticos. De los contrario por lo menos 5 días después de haber suministrado el último tratamiento. Transporte Si la muestra llega antes de 6 horas al laboratorio se puede transportar a temperatura ambiente, de lo contrario empaque y envíe refrigerado.
  30. 30. Análisis para evaluar calidad higiénica De una muestra representativa de la leche de la finca se puede evaluar microbiológicamente para ubicar donde está la fuente de contaminación o para conocer el número de Bacterias Aerobias o el Tiempo de Reducción de Azul de Metileno. Materiales El sistema mas recomendado es usando una bolsa plástica estéril tipo que permita selle hermético. En su defecto se puede usar un frasco de vidrio estéril con tapa de rosca. Se requiere un frasco de acero inoxidable lavado y desinfectado por ebullición durante 5 minutos. Opcional, jeringa desechable Nueva, de 10 ml. Toma de la muestra del tanque de leche Para que la muestra sea representativa es necesario que esté el tanque esté en agitación por lo menos durante 10 minutos. Con la ayuda del jarro desinfectado o la jeringa estéril tome la muestra por la tapa de arriba del tanque, no utilice la llave de salida, en una cantidad de 25 a 30 ml. Colóquela en la bolsa plástica, ciérrela asegurándose que quede hermética, identifíquela según numeral 2 y empáquela en un termo con agua con hielo, en la relación 1:1. Remítala al laboratorio en forma inmediata para que se mantenga siempre a 3 C. Cuando la temperatura de almacenamiento o de transporte supera los 3 C se produce multiplicación bacteriana, que altera el resultado final.
  31. 31. Toma de muestras de cantinas Para tomar muestras representativas la leche se puede obtener de la cantina, se debe agitar cada cantina con un agitador previamente desinfectado por ebullición, con un mínimo de 15 movimientos desde la superficie al fondo. Con una jeringa y de acuerdo con el número de cantinas, tome cantidades iguales de cada cantina colóquelas en un jarro desinfectado, cuando haya terminado de muestrear todas las cantinas agite bien la leche del jarro, tome la muestra y colóquela en la bolsa. Transportar en un medio de Cultivo; para esto coloque 2 o 3 ml de la muestra obtenida en un tubo de Medio tioglicolato y el resto del recuperado, en el frasco donde viene la solución salina. No refrigere la muestra si se desea un diagnóstico de Trichomonas, de lo contrario si se puede refrigerar. Muestra para recuento de células somáticas La determinación de células es un análisis que permite evaluar el grado de mastitis existente en el hato y estimar las perdidas por disminución de producción. Procedimiento Las muestras se colocan 5 ml en un tubo que contiene 3 gotas de fijador.. Cuando se ha enviado una muestra para evaluación bacteriológica. en el laboratorio se puede tomar la muestra para recuento de células somáticas. El transporte se hace en forma refrigerada.
  32. 32. Tiempo de Reducción de Azul de metileno - TRAM Tome y transporte la muestra de la misma manera que para análisis bacteriológico. Residuos de Antibióticos Tome y transporte la muestra de la misma manera que para análisis bacteriológico. Nota: El volumen de muestra tomado es suficiente para realizar Examen de Cultivo Microbiológico, Recuento de Células Somáticas y Tiempo de Reducción de Azul de Metileno. Muestra de leche para examen físico químico Cuando se quiere evaluar las características físico químicas de la leche como proteínas, grasa, sólido totales etc. se requiere una muestra tomada igual que en 12.2 utilizando un recipiente de vidrio o plástico con capacidad de 250 mL. Coloque en el frasco aproximadamente 4/5 partes, tápelo y envíelo refrigerado.
  33. 33. Fetos El feto y la placenta son las muestras más importantes para llegar al diagnóstico de las enfermedades infecciosas que afectan la reproducción, porque en estos tejidos se encuentran lesiones histológicas o de ellos se pueden aislar los agentes etiológicos.Con frecuencia su utilidad diagnóstica se pierde por cambios autolíticos que se suceden por la muerte del feto intrauterinamente varios días antes del aborto o por una recolección y conservación no adecuada. Recolección en el campo Los fetos y placentas recogidos lo antes posible, se deben lavar con agua limpia para retirar los residuos de pasto o tierra. Estado de los fetos Los fetos según su estado se pueden clasificar: •Feto no autolisado: De color rosado pálido, olor a tejidos frescos, ojos llenos y el líquido que recubre la piel es viscoso y sin mal olor. •Fetos autolisados o descompuestos: Color rojo oscuro hasta casi negro, exudación de color oscuro, deshidratación del globo ocular y olor de tejido putrefacto. Con estos fetos es muy poco lo que se puede hacer. •Fetos no descompuestos pero destrozados por animales: Se descarta su uso para aislamientos pero son adecuados para estudio histopatológico. •Momificados: Son de color oscuro casi negro, hay deshidratación, los ojos prácticamente han desaparecido, no hay olor putrefacto y la placenta aparece como una membrana seca adherida fuertemente al cuerpo. Es tan poco lo que se puede hacer con estos fetos que no se justifica su envío al laboratorio.
  34. 34. Clasificación por tiempo de gestación Los abortos con menos de 100 días de gestación se encuentran envueltos en su placenta y de acuerdo con su estado se pueden manejar y enviar al laboratorio como una muestra ya que se facilita su manejo refrigerado. Los abortos de mayor edad generalmente no son expulsados con su placenta, la cual puede permanecer como retenida o se encuentra en otro sitio y el manejo estará de acuerdo con su estado y las condiciones de transporte. Empaque y Transporte de fetos frescos: Si el feto es menor de tres (3) meses lávelo con agua limpia, colóquelo en una bolsa plástica y empaque en una caja con hielo, ya sea en bloques o bolsas refrigerantes (ver 3.1.). Si es posible incluya un trozo de placenta que contenga 2 o 3 cotiledones. Recuerde que el hielo o las bolsas garantizan una adecuada refrigeración por unas 12 horas como máximo. Fetos mayores de tres (3) meses: No es fácil dar una adecuada refrigeración debido al gran tamaño de la muestra. Si usted puede hacerlo y llega en menos de 4 horas al laboratorio, lave muy bien el feto con agua y empáquelo en bolsa de polietileno a prueba de fugas y reempaque en una caja con hielo. De lo contrario proceda a tomar muestras para bacteriología e histopatología.
  35. 35. Toma de muestras para bacteriología Coloque el feto boca arriba. Lave y seque muy bien toda el área, abra las cavidades abdominal y torácica teniendo cuidado de no romper vísceras internas, con la ayuda de una jeringa estéril pique el cuajar (en esta fase del desarrollo fetal representa más del 70% de los 4 estómagos) y succione de 3 a 5 ml de líquido (también puede colectar líquido pericardico en la misma forma). Coloque el protector de la aguja, regrese la jeringa al empaque original cierre con una cinta y maneje la muestra en condiciones de refrigeración. Fragmento de hígado, pulmón y riñón de más o menos 25g, cada uno pueden ser tomados y empacados en bolsas individuales estériles para estudios microbiológicos. Empaque y transporte al laboratorio en refrigeración. Toma de muestra para histopatología Abra el feto como en el numeral anterior y tome muestras de hígado, riñón, pulmón, corazón, bazo y cotiledón placentario del taño de cubos de azúcar. Colóquelos en un frasco con formol al 10% en la relación de una parte de tejido por 10 de formol (ver tejidos). El cerebro es muy importante para diagnóstico de varias enfermedades reproductivas, por esto es importante que un trozo de este órgano sea incluido como muestra y manejar como se describió anteriormente. Fetos frescos pero destrozados: No sirven para aislamientos. Se pueden tomar muestras para histopatología como el paso anterior. No olvide que la placenta puede ser usada para el diagnóstico (ver tejidos).
  36. 36. Suero de vaca abortada El diagnóstico por aislamiento o histopatología que se realiza en fetos es totalmente específico pero de baja sensibilidad (alrededor del 50% de los estudios en fetos no llegan a un diagnóstico), por esto el estudio Serológico con sueros pareados de la madre pueden ser de gran ayuda. Con las muestras del feto tome y envíe una muestra de sangre sin anticoagulante para determinar anticuerpos contra las enfermedades a sospechar. Repita la muestra 4 semanas después y el hecho de encontrar seroconversión (aumento de títulos) para una enfermedad se convierte en un diagnóstico bastante confiable.
  37. 37. Enfermedades enfisematosas producidas por bacterias del genero Clostridium En este grupo se encuentran carbón sintomático o pierna negra, edema maligno y enfisema gaseosos, producidos por bacterias anaerobias, por lo que requieren un manejo especial de toma y transporte para sostener la viabilidad. Tomadas lo antes posible después de la muerte porque una vez iniciado el proceso de putrefacción muchas otras especies del genero Clostridium invaden los tejidos dificultando el aislamiento e identificación del verdadero patógeno. Procedimiento Previo lavado y desinfección de la zona afectada y con ayuda de un bisturí estéril haga una incisión de la piel y el músculo. Bajo las mayores medidas para evitar contaminación introduzca el hisopo del sistema y con movimientos de rotación recoja el exudado sanguinolento. Introduzca el hisopo en el contenedor. Se recomienda leer previamente las instrucciones de manejo del sistema culturette para evitar perdida de los elementos inhibidores del oxígeno. La muestra puede ser mantenida a temperatura ambiente por 48 horas o de lo contrario refrigere y transporte. Es recomendable tomar tambien una muestra de músculo para histopatología.
  38. 38. Toma de muestra con jeringa Como alternativa se puede usar jeringa y aguja calibre 18 estériles para hacer una punción en la zona afectada. Previa limpieza y desinfección introduzca la aguja en el músculo y con movimiento en distintas direcciones succione líquido exudativo hasta obtener algo mas de 3cc. Retire la jeringa y tomando todas las medidas de precaución para no contaminarse con el líquido desplace todo el aire existente en la jeringa e introduzca la punta en un tapón para evitar entrada de oxígeno. Marque y transporte refrigerado. Carbón Bacteridiano, Anthrax o Peste Rayo Esta enfermedad es sospechada en los casos de muerte súbita con presencia de sangre oscura por los orificios naturales y para la cual tradicionalmente se envían muestras poco practicas como extremidades completas, orejas u órganos internos. Como para esta enfermedad no es recomendable abrir los cadáveres en el campo por el riesgo de difusión y persistencia de la bacteria productora y como el animal muere en un estado de bacteremia una muestra de sangre tomada lo más rápido posible después del deceso del animal es de gran utilidad para el diagnóstico. Para tomar la muestra puede utilizar un tubo al vacío (numeral 1.2) como la opción más adecuada y de menor riesgo o una jeringa estéril para tomar 1 o 2 centimetros de sangre de la vena yugular. Este microorganismo es letal para los humanaos pues causa el anthrax. Si eligió la segunda opción, introduzca la punta de la aguja en un tapón de caucho para evitar la pérdida de la muestra con los consecuentes riesgos de contaminación para propios y extraños. Marque, empaque y envíe refrigerado.
  39. 39. Examen COPROLÓGICO El análisis de materia fecal suele darnos muchos datos para elaborar un diagnóstico. Es un procedimiento sencillo, económico y rápido de realizar. Existen variadas metodologías, como la sedimentación de huevos, flotación, cultivo de larvas, cuantificación de las mismas, etc. El método de flotación consiste en homogeneizar materia fecal en una solución sobresaturada de cloruro de sodio. Debido al alto peso específico de la solución, los huevos flotan y se pegan a un cubreobjetos previamente dispuesto en el extremo de un tubo de ensayo (la solución de cloruro de sodio+materia fecal debe llenar completamente el tubo y producir en su extremo libre una convexidad llamada menisco pero sin llegar a rebasar, de tal forma que el cubreobjetos tome contacto con el líquido). Esperamos unos 20 minutos para que lleguen los huevos a la superficie del cubreobjetos y se adhieran a él. Extraemos el cubreobjetos, lo depositamos sobre un porta y procedemos a su inspección microscópica intentando asociar las formas más características que ilustramos a continuación.
  40. 40. La simple presencia de huevos no es diagnóstico de enfermedad parasitaria. Solo confirma la presencia del parásito. Para hablar de patología parasitaria debemos asociar una carga parasitaria importante a una presencia de signos clínicos (vómitos, diarreas, caquexia, pelo sin brillo, diarrea, tenesmo, meteorismo, etc) Ancilostoma spp Tenias Dipilidium caninum Toxocara canis
  41. 41. Los análisis de sangre se usan como rutina para ayudar al diagnóstico de enfermedades o como control de salud. Mediante los análisis se puede detectar la presencia de muchas enfermedades habituales y frecuentes como pueden ser la anemia, la diabetes, infecciones, pero también pueden dar a conocer otras menos frecuentes y más graves como la leucemia o otros tipos de cáncer.
  42. 42. ¿CUÁLES SON LOS MÁS FRECUENTES? Los análisis de sangre más empleados, son los estudios hematológicos (hematimetría ó hemograma) con VSG (Velocidad de Sedimentación Globular), y un estudio de bioquímica en el que se miden la glucemia (azúcar en la sangre), el ácido úrico, la urea las transaminasas, la bilirrubina, electrolitos, etc, ... La fórmula leucocitaria El recuento de leucocitos se realiza habitualmente en un estudio de hematimetría y recuento leucocitario completo. Los leucocitos o glóbulos blancos son células que están principalmente en la sangre y circulan por ella con la función de combatir las infecciones o cuerpos extraños; pero en ocasiones pueden atacar los tejidos normales del propio cuerpo. Es una parte de las defensas inmunitarias del cuerpo. Se llaman glóbulos blancos ya que éste color es el de su aspecto al microscopio. Hay diferentes grupos de glóbulos blancos: los llamados polimorfonucleares (neutrófilos, eosinófilos y los basófilos) y los mononucleares (los linfocitos y los monocitos).
  43. 43. El origen de todas las formas de leucocitos es a partir de células madres de la médula ósea. La fórmula de leucocitos o leucocitaria mide el porcentaje presente de cada tipo de leucocitos en el total de glóbulos blancos. Al ser un porcentaje al aumentar un grupo de leucocitos disminuye otro, aunque en ocasiones solo existe un aumento o disminución de un tipo concreto y por ello solo el porcentaje ofrece una valoración orientativa pero se debe contar el número total de cada grupo para saber cuál es la variable a tomar en cuenta y estudiar.
  44. 44. GRUPOS DE LEUCOCITOS Hay diferentes grupos de glóbulos blancos, los llamados polimorfonucleares (neutrófilos, eosinófilos y basófilos) y los mononucleares (linfocitos y monocitos). Los neutrófilos son los más numerosos y porcentualmente los más significativos que se encuentran. Su función es la fagocitosis que se entiende como si fuera una absorción y digestión de sustancias extrañas (bacterias, cuerpos extraños, tejidos etc,). Las formas inmaduras que aparecen cuando hay un estímulo intenso medular para su producción se llaman cayados (por la forma del núcleo); suele indicar la existencia de actividad intensa de las defensas contra infecciones por bacterias. Los eosinófilos se llaman así por el color rojo en el que aparecen al microscopio por una tinción con eosina. Suelen estar elevados en ciertas enfermedades causadas por alergia o por infecciones parasitarias. Los basófilos suelen tener un comportamiento similar. Los mononucleados son los linfocitos y los monocitos. Tienen un núcleo celular único y pequeño. Sus funciones son las combatir infecciones virales y bacterianas crónicas.
  45. 45. Conteo de Hematies Los glóbulos rojos son las células sanguíneas que contienen en su interior la hemoglobina. Los glóbulos rojos son los principales portadores de oxígeno a las células y tejidos del cuerpo. Tienen una forma bicóncava para adaptarse a una mayor superficie de intercambio de oxígeno por dióxido de carbono en los tejidos. Además su membrana es flexible lo que permite a los glóbulos rojos atravesar los más estrechos capilares. La hemoglobina es una proteína que contiene hierro lo que le da el color rojo a la sangre, por ello el nombre de glóbulos rojos o Eritrocitos: eritro (rojo) + citos (células). PRODUCCIÓN DE LOS GLÓBULOS ROJOS Los glóbulos rojos se producen en la médula ósea, a partir de células madre que se multiplican a gran velocidad. La producción de glóbulos rojos esta regulada por la eritropoyetina, que es una hormona producida por el riñón. Una disminución de la oxígenación de los tejidos aumenta la producción de eritropoyetina, que actúa en la médula ósea estimulando la producción de glóbulos rojos.
  46. 46. FUNCIÓN DE LOS GLÓBULOS ROJOS El oxígeno que es necesario para producir energía en los diferentes tejidos entra en el cuerpo humano a través de los pulmones. Atraviesa las membranas de los alvéolos pulmonares y es captado por los glóbulos rojos unido a la hemoglobina. Luego es transportado por el sistema circulatorio a los tejidos. El oxígeno se difunde a través de la pared de los capilares para llegar a las células. Al mismo tiempo, el CO2 que producen las células es recogido por la hemoglobina de los glóbulos rojos y es transportado a los pulmones, en donde es expulsado.
  47. 47. ¿Qué es el hematocrito?¿Qué es el hematocrito?
  48. 48. Hemoglobina Hematocrito La hemoglobina es una proteína que contiene hierro y que le otorga el color rojo a la sangre. Se encuentra en los glóbulos rojos y es la encargada del transporte de oxígeno por la sangre desde los pulmones a los tejidos. La hemoglobina también transporta el dióxido de carbono, que es el producto de desecho del proceso de producción de energía, lo lleva a los pulmones desde donde es exhalado al aire. El análisis de la hemoglobina se realiza normalmente en un estudio completo de hematimetría, con el recuento de glóbulos rojos o hematíes. Tras una centrifugación de la sangre total se pueden apreciar dos niveles, uno con el depósito de los glóbulos rojos, principalmente, y otro nivel del plasma total. La relación porcentual entre ambos es lo que describe el hematocrito y describe el porcentaje de células transportadoras de oxígeno con respecto al volumen total de sangre. El análisis del hematocrito se realiza normalmente en un estudio completo de hematimetría, con el recuento de glóbulos rojos o hematíes.
  49. 49. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS DEL HEMATOCRITO En general, se deben de interpretar con otros parámetros de la forma, aspectos y con los índices hemáticos (hemoglobina, hematocrito, VCM, HCM, VMHC). •El VCM (volumen corpuscular medio) es una forma de expresar el tamaño de los eritrocitos .El valor normal es de 80-100 fl (femtolitros por hematíe). • La HCM (hemoglobina corpuscular media) corresponde al contenido de la hemoglobina en cada eritrocito (Hemoglobina/número de hematíes). Su valor normal es de 26 a 32 picogramos. • La CHCM es la concentración de hemoglobina comparado con el hematocrito . En los adultos sus valores normales son de 32 a 36 %.
  50. 50. ¿QUÉ INDICAN LOS RESULTADOS ANORMALES EN EL HEMATOCRITO? Un índice bajo de Hematocrito puede deberse a: •Anemia •Fallos en la médula ósea (Radiaciones, toxinas, fibrosis, tumores, etc...) •Embarazo •Hemorragias •Hipertirodismo •Hemolisis (destrucción de glóbulos rojos), por una transfusión •Leucemia •Problemas de alimentación •Artritis reumatoide Un índice alto de Hematocrito puede deberse a: •Cardiopatías •Deshidratación •Eclampsia (en el embarazo) •Enfermedades pulmonares crónicas •Exceso de formación de hematíes (Eritrocitosis) •Policitemia vera •Choque (shock)
  51. 51. Parámetros hemáticos Unidades Valores normales Hematocrito % 30.0 – 40.0 Hemoglobina g/dl 8.0 – 14.5 Eritrocitos 10^6/μl 5.40 – 9.00 MVC fl 40 - 60 MCH pg 11.0 -17.0 MCHC g/dl 30.0 – 36.0 Leucocitos 10^3μl 2.50 – 7.50 Neutrófilos % 15 - 45 Eosinófilos % 1 - 12 Linfocitos % 45 - 75 Monocitos % 3 - 15 Plaquetas 10^3/μl 300 - 800 Fibrinógeno g/dl 0.1 – 0.6 proteinas g/dl 6.7 - 8 Valores hemo-hematimétricos normales en el bovino
  52. 52. Proteínas totales: Los aumentos y disminuciones se deben a las concentraciones de albúminas y globulinas. El valor de las proteínas totales esta aumentado (hiperproteinemia) en la deshidratación, inflamación, mieloma múltiple y en el cólico grave; y está disminuido (hipoproteinemia) en trastornos digestivos, inanición, falla renal o hepática, parasitosis, infecciones crónicas, paperas y tumores. Albúminas: La hiperalbuminemia es indicativa de deshidratación. Por otro lado, si tanto la albúmina como la globulina están disminuidas, las principales consideraciones son hemorragias, exudación por lesiones cutáneas graves y enteropatías. En casos de hipoalbuminemia y globulinemia normal o alta sugiere una reducción en la producción de albúmina debida a insuficiencia hepática crónica. Otro motivo puede ser el aumento de pérdidas corporales debido de glomerulopatía. Globulinas: La hiperglobulinemia es indicativa de enfermedades inflamatorias crónicas, por ejemplo, bacteriosis crónica, virosis, micosis, parasitosis, neoplasias o lesiones inmunomediadas. La hipoglobulinemia indica hemorragias y enteropatías perdedoras de proteínas. Con menor regularidad, las nefropatías perdedoras de proteínas y la insuficiencia hepática. QUÍMICA SANGUÍNEA
  53. 53. Bilirrubina: Es formada a partir del catabolismo de la hemoglobina. Su aumento es indicativo de enfermedades hemolíticas o hepáticas,incluyendola obstrucción extrahepática. Creatinina: La principal causa de su aumento son las glomerulopatías. Otras causas como la miositis aguda y el traumatismo muscular pueden aumentar la creatinina pero su trascendencia es incierta. Su determinación es más útil que la uremia para la vigilancia seriada de las patologías renales porque experimenta menos influencias extrarrenales. Glucemia: Se ve aumentada en casos de iatrogenia por glucocorticoides, en la diabetes mellitus, en el hiperadrenocorticismo y hiperpituitarismo. Disminuye en el hipoadrenocorticismo, en la insuficiencia hepática, en la septicemia grave y en la inanición. Fibrinógeno: Aumenta su concentración en el plasma con procesos inflamatorios y disminuye en coagulación intravascular diseminada, fallo hepático o cirugías importantes.
  54. 54. LAS DIFERENTES PRUEBAS SEROLÓGICAS En el momento de realizar pruebas diagnósticas de enfermedades infectocontagiosas hay dos posibles vías principales: pruebas directas encaminadas a la detección del agente etiológico o de parte de su ADN en el animal afectado, o pruebas indirectas que demuestran que el sistema inmune del individuo afectado ha estado en contacto con el agente en cuestión. Cualquiera de los tipos de prueba aporta una información diferente y las pruebas aplicables varían en específidad y sensibilidad. En lo presente nos centramos principalmente en las pruebas que permiten la detección de anticuerpos aunque algunas técnicas son parecidas para la detección de anticuerpos y antígeno. Precipitación ELISA Inmuno difusión RIA Inmunoelectroforesis Inmunofluorescencia Aglutinación Inmunoperoxidasa Fijación de complemento Test de neutralización Hemoaglutinación o inhibición de la misma Test de protección
  55. 55. 1- Precipitación: La adición de un antígeno soluble a una solución con anticuerpos homólogos resulta en la formación de complejos inmunes que precipitan de la solución. Cuando se aumenta la cantidad de antígeno que se añade se forman cantidades variables de complejos y con esto de precipitado, obteniendo la mayor cantidad de complejos cuando la proporción de antígeno y anticuerpo en la solución es equivalente o óptimo. Esto se aprovecha en los test serológicos de inmunoprecipitación como por ejemplo para la identificación de diferentes estreptococos.
  56. 56. 2- Inmunodifusión: Se utiliza en un medio semi solido como los geles de agar, en los cuales los dos componentes el antígeno y el anticuerpo migran a través del agar hasta que se encuentren y precipitan en el lugar donde su proporción es óptima, se trata de inmunodifusión. Este método permite identificar anticuerpos y antígenos desconocidos y comparar antígenos parecidos entre si (método de Ouchterloney).También permite cuantificar el antígeno presente en una solución determinada. Para ello se pueden obtener resultados mas exactos mediante inmunodifusión radial (el antígeno se encuentra en pequeñas indentaciones y difunde por un gel que contiene una concentración conocida de antisuero, de modo que diámetro del anillo de precipitación que se forma es proporcional a la cantidad de antígeno), estas pruebas son las empleadas en la investigación de brucelosis.
  57. 57. 4- Aglutinación: Anticuerpos pueden reaccionar con un antígeno determinado y luego interconectar entre ellos o diferentes componentes antígenos presentes por ejemplo en la superficie de una bacteria. Este proceso resulta en la aglutinación que es visible macroscópicamente y es un instrumento útil en la identificación de bacterias, hongos e incluso protozoos mediante antisueros específicos. Ejemplos son la aglutinación en porta para la detección rápida de anticuerpos frente a diferentes Mycoplasma spp. o Salmonella spp. así como el test de rosa bengala para la detección de anticuerpos frente a Brucella abortus. Para determinar anticuerpos frente a Leptospira spp. se utilizan cultivos vivos de Leptospira en una aglutinación en porta bajo el microscopio en campo obscuro. 3- Inmunoelectroforesis: En líquidos que contienen mezclas de antígeno se puede aplicar primero una electroforesis para separar los antígenos presentes y luego la inmunodifusión para su identificación.
  58. 58. 5- Fijación de complemento (CFT): El test de fijación de complemente utiliza el hecho de que complejos de anticuerpo y antígeno activan el sistema de complemento que, entre otras actuaciones, causa la lisis de eritrocitos que muestran antígeno. la prueba se desarrolla en dos pasos. Tras la inactivación de los sueros (para eliminar la actuación del complemento propio del suero), en una placa de microtitulación (pozos en V) se añade antígeno y una cantidad conocida de complemento (de cobaya). Tras 30 minutos de incubación se añaden eritrocitos de oveja (sensibilizados mediante suero de conejo con hemolysina) y se incuba otra media hora. En los sueros que contenían anticuerpos, se han formado complejos que se han ligado al complemento y han evitado la destrucción de los eritrocitos mientras que en las muestras en las que no hay anticuerpos se lisan los glóbulos rojos. Por ejemplo para detección de anticuerpos frente a Chlamydia psittaci (mamíferos).
  59. 59. 6- Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): El descubrimiento de que una serie de encimas como por ejemplo la fosfatasa alcalina se podían ligar a anticuerpos sin perder su actividad ni interferir con la acción de los anticuerpos llevo al desarrollo de un gran grupo creciente de pruebas diagnósticas que aprovechan la posibilidad de detectar los anticuerpos mediante la actividad de la encima ligada. Los llamados Enzyme-linkedimmunosorbent assays (ELISA) son seguros y faciles de utilizar y permiten tanto la determinación y cuantificación de anticuerpos (ELISA indirecto, competitivo, o blocking) como de antígeno (ELISA directo o Sandwich) y por eso tienen una amplia aplicación en el diagnóstico tanto de enfermedades víricas y bacterianas como las causadas por hongos o parásitos.
  60. 60. El ELISA indirecto para la detección de anticuerpos utiliza antígeno adherido a membranas o recipientes de poliestireno, al que se adiciona el suero a analizar y sueros de control. Tras una incubación y el lavado para eliminar los anticuerpos sobrantes se añade un suero anti- inmunoglobulina conyugado con una encima y se incuba y lava de nuevo. Añadiendo ahora un substrato para la encima que esta transforma causando una reacción de color que se puede determinar visualmente o mediante un espectrofotómetro.
  61. 61. 7- Radioinmunoassay (RIA): Este sistema utiliza una metodología similar a la del ELISA o de la inmunofluorescencia, pero aplicando moleculas marcados con radioisótopos. Esto hace el test extremadamente sensitivo y permite detectar cantidades mínimas de antígeno o anticuerpos. 8- Inmunofluorescencia: En la inmunofluorescencia se utilizan inmunoglobulinas marcadas con sustancias fluorescentes como isotiosyanato de fluorescina o rhodamina, parecido a las encimas empleados en los ELISA. Se trata de un método muy sensible pero que requiere el uso de un microscopio de fluorescencia con lámpara de mercurio y experiencia en la interpretación para evitar errores. Tiene un campo muy amplio de aplicación y se utiliza con frecuencia para la detección de antígeno en tejidos.
  62. 62. 9- Inmunoperoxidasa: Este método permite la detección de entígeno en tejidos mediante el uso de inmunoglobulinas marcadas con una encima (peroxidasa o fosfatasa alcalina) que generan una coloración desde un substrato sin color. La ventaja ante las técnicas de fluorescencia son el equipo necesario y que se puede aplicar en material incluido en parafina. Hace falta mucha experiencia.
  63. 63. 10- Test de neutralización de virus: Este método utiliza la habilidad de los anticuerpos de anular la acción biológica de un virus o de una toxina. Esto se aplica en algunas pruebas para la neutralización de toxinas bacterianas (prueba de Nagler para Clostridium perfringens) y para un gran número de virus. El método consiste en la infección de un cultivo celular receptivo con un virus que causa lesiones visibles en este cultivo. La concentración del virus es conocido mientras que los sueros a analizarse diluyen en pasos de dos en dos. Si el suero contiene anticuerpos estos inhiben la infección de las celulas por el virus en cuestión y con ello la aparición de lesiones en el cultivo celular. Para muchos virus de importancia para los animales domésticos el test de neutralización de virus constituye el "gold standard" por su especifidad y sensibilidad. Sin embargo también es el análisis mas costoso y que más tiempo requiere debido a la necesidad de trabajar con cultivos celulares o huevos embrionados.
  64. 64. Pruebas para la determinación de mastitis: Pruebas de Campo Prueba de Mastitis California (CMT). Toma de muestras para cultivo microbiológico. Pruebas de Laboratorio Recuento de células somáticas (RCS) Cultivos microbiológicos Caracterización del microorganismo Pruebas de sensibilidad antimicrobiana Monitoreo Recuento de Células Somáticas del tanque ( RCS-T)
  65. 65. El CMT mide en forma indirecta el número de células somáticas / mL. Normalmente la leche de una glándula mamaria sana tiene menos de 100.000 cel/mL donde el 80% de las células son macrófagos y el 20% ó menos corresponden a Neutrófilos. Cuando hay inflamación originada en un proceso infeccioso el número de células somáticas aumenta por incremento de los Neutrófilos que acuden a cumplir su acción fagocítica en el sitio de la infección llegando a representar hasta el 90% del recuento de células somáticas. En la literatura no hay coincidencia sobre el número de células a partir del cual se considera que una glándula mamaria esta afectada de mastitis, pero en términos generales recuentos superiores a 500.000 cel/mL con más del 50% de Neutrofilos se deben considerar como cuadros de mastitis. Número que se verá incrementado hasta varios millones según la intensidad y extensión de la lesión. El CMT es una prueba que tiene una alta sensibilidad pero presenta algunas deficiencias en especificidad, dando falsos positivos durante la primera semana después del parto pero muy especialmente en vacas que tienen más de 7 meses de producción y varios partos. En estos casos el grado de viscosidad es similar en los 4 pezones.
  66. 66. Prueba de Mastitis California (CMT): Esta es una prueba de campo de fácil manejo y buena sensibilidad que se fundamenta en la capacidad que tiene el reactivo Lauril Sulfato de Sodio para reaccionar con el DNA celular produciendo viscosidad directamente proporcional al número de células somáticas presentes en la muestra de leche. Una vez la vaca está lista para ser ordeñada con pezones limpios y secos, se escurren los 3 ó 4 primeros chorros de leche de cada pezón en los compartimentos de la bandeja apropiada. Se inclina la bandeja en un ángulo de 60º para igualar la cantidad de leche en cada uno (deben quedar entre 2 y 4 mL de leche). Se agrega una cantidad igual de reactivo y se inicia un proceso suave de agitación por rotación durante 15 a 20 segundos. Leer e interpretar la prueba. Los criterios básicos de la interpretación se resumen en la tabla siguiente: GradoTipo de RelaciónCelularidad / ml NegativoMezcla se mantiene líquida< 200.000 TrazasLigera viscosidad200.000 - 500.000 1Mezcla viscosa no adherida al fondo400.000 -1.500.000 2Mezcla viscosa que se adhiere al fondo 800.000 - 5.000.000 3Mezcla muy viscosa fuertemente adherida que forma un solo grumo.>5.000.000
  67. 67. Toma de Muestra de Leche Las condiciones de toma de muestra de leche son determinantes para el éxito del diagnóstico especialmente para el aislamiento e identificación del agente infeccioso. Previo a la toma se debe lavar, secar y desinfectar muy bien el pezón, escurrir 3 ó 4 chorros y en un recipiente estéril, descargar +/- 5 ml de leche.Las muestras deben ser transportadas al laboratorio en refrigeración teniendo cuidado que la humedad no altere la identificación de cada tubo. Para un estudio completo se recomienda tomar muestra a todos y cada uno de los pezones que tengan una reacción de 1 ó más a CMT. A criterio del profesional, dependiendo de la prevalencia de la enfermedad y del conocimiento que se tenga del hato, se puede reducir el número de muestras hasta en un 50% de los pezones positivos a CMT. Recuento de Células Somáticas Diferentes metodologías se aplican para el recuento de células somáticas (RCS); las más utilizadas son el recuento microscópico directo (RMD), el recuento electrónico como contadores de partículas y el recuento automatizado soportado en epifluorescencia. Por disponibilidad de equipos y posibilidades de aplicación se analizan los pasos fundamentales del recuento microscópico directo:
  68. 68. Análisis Bacteriológicos El objetivo del análisis microbiológico es hacer el aislamiento y caracterización de los microorganismos causantes de la mastitis del hato que permita su agrupación en causantes de: Mastitis contagiosa: Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureus, Corynebacterium bovis, Mycoplasma spp. Mastitis originada en la piel de los pezones: Staphylococus no aureus S. hyicus, S. chromogenes y otros, Streptococcus no agalactiae S. dysgalactiae, S. bovis, S. uberis, entre otros. Mastitis ambiental. Escherichia coli, Enterobacter spp, seudomonas aeruginosa, Klebsiella spp, Serratia spp, Citrobacter freundii. Mastitis iatrogénica. Asociada al uso inadecuado de cánulas intramamarias con la etiología de Mohos ó Levaduras de los géneros: Candida, Cryptococcus y Trichosporum. El aspecto remoso de la secreción láctea, el largo periodo de evolución de la enfermedad, la no respuesta clínica a antibióticos y el uso repetido de los mismos por vía intramamaria son factores que se deben tener en cuenta para sospechar de estos microorganismos.
  69. 69. Todas las bacterias causantes de mastitis se multiplican bien en Agar Sangre convirtiéndose en el medio básico para el proceso de aislamiento del agente etiológico. Con el fin de aumentar las posibilidades de éxito del aislamiento y aprovechando las propiedades de la leche como medio de cultivo, las muestras pueden ser preincubadas a 37º C durante 6 a 8 horas y posteriormente sembrar en Agar Sangre. Cuando se toma esta alternativa se debe estar seguro que la muestra ha sido tomada en condiciones asépticas, de lo contrario microorganismos contaminantes van a enmascarar el diagnóstico. Pruebas de Sensibilidad Antimicrobiana Por facilidad de manejo y disponibilidad de reactivos la prueba de sensibilidad antimicrobiana más usada es el método de difusión con discos sobre Agar Mueller Hinton. La selección de principios activos a probar dependerá de: la disponibilidad de productos comerciales en el mercado local, la legislación del país sobre uso de antibióticos, el tipo de microorganismo aislado, si es para vaca en lactancia o en el periodo seco y si se va a usar vía parentenal o vía intramamaria. En una placa de Agar de 100 mm de diámetro se pueden colocar 8 sensidiscos como máximo.
  70. 70. El recuento de células somáticas de la leche del tanque RCS - T ó una muestra representativa de todos las cantinas que se producen en la finca es el mejor indicador para monitorear la situación de mastitis en el hato y estimar las pérdidas por producción. Hay una alta coincidencia en el literatura mundial que un RCS - T de 200.000 células/ml es una cifra apropiada para un hato que tiene una prevalencia inferior al 6% de cuartos afectados de mastitis subclínica y que su producción no se ve afectada por esta enfermedad. Relación entre el RCS-T, el porcentaje de cuartos infectados y el porcentaje de merma de producción (RCS - T)/ ml. Porcentaje cuartos infectados = Porcentajes merma Cantidad de células somáticas: 200.00060 Aceptable 500.000166 Problemas 1.000.0003218 Rechazo 1.500.0004829 Inaceptable
  71. 71. Otras pruebas:Otras pruebas: Hemoparásitos (Hemoparásitos (babesia, anaplasma y otros)) Pruebas alérgicas (Pruebas alérgicas (tuberculina))
  72. 72. AUTOEVALUACIÓN:AUTOEVALUACIÓN: 1. ¿Cuales son los requisitos que debe tener una muestra para ser enviada al laboratorio? 2. ¿Para que tipo de muestras se utilizan los tubos con y sin anticoagulante? 3. ¿Como pueden de conservarse las muestras de sangre? 4. ¿Que procedimientos hay que seguir para obtener mayor cantidad de suero sanguíneo y cuales para obtener plasma? 5. ¿Que importancia tiene el uso de una aguja adecuada (grosor G y longitud en pulgadas 1, 1 ½, 2, etc.) y por que es necesario cambiar de aguja de animal en animal? 6. ¿Para que tipo de muestra se utilizan los escobillones?
  73. 73. 7. ¿Que otros tipos de envases pueden utilizarse para toma de muestras y para cuales casos? 8. ¿Que tipos de muestras usted puede enviar al laboratorio de salud animal y en que envase la enviaría? 9. ¿Que muestras pueden ser conservadas y hasta por cuanto tiempo? 10. ¿Cuales son las muestras que con más frecuencia son enviadas al laboratorio de salud y para que objetivo se procesan? 11. ¿Cuales son las pruebas de laboratorio que usted conoce? 12. ¿En los análisis de sangre, la formula leucocitaria es de gran importancia ya que nos diferencia el cuadro patológico queenfrentamos. Explique esto? 13. ¿Otro análisis importante es el hematocrito. Como se interpreta el mismo?
  74. 74. 14. ¿En que se basan las pruebas serológicas. Cite ejemplos de enfermedades que se determinan con estas pruebas? 15. ¿Que pruebas pueden ser empleadas para la determinación de mastitis y en que se basan las mismas? 16. ¿Que requerimientos deben tener las pruebas de hemoparásitos? 17. ¿Para que se emplean las pruebas alérgicas? . Describa una. 18. ¿Que es un antibiograma y para que nos sirve? 19. ¿Cuantos tipos de análisis de parásitos conoce y en que se basan los mismos? 20. ¿En caso de determinaciones hormonales cual debe ser la muestra enviada al laboratorio?

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