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Factores ambientales y los procariotas
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Factores ambientales y los procariotas

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  • 1. Agentes BiológicosFactores ambientales y los procariotas By Renato Soares de Melo Santa Cruz de La Sierra 2012
  • 2. 1 INTRODUCCION: EFECTO DE LOSFACTORES AMBIENTALES SOBRELOS PROCARIOTAS Debido a su pequeño tamaño y a su estilo de vida individual, las célulasprocarióticas sufren los cambios ambientales de un modo mucho más directo einmediato que las células de los organismos pluricelulares. A lo largo de miles demillones de años, los procariotas han venido estando sometidas a diversas presionesambientales, y han respondido evolutivamente creando numerosos mecanismos deadaptación. Actualmente, las únicas formas de vida existentes en determinadosambientes extremos son exclusivamente procarióticas. Desafiando a nuestras ideaspreconcebidas de lo que es la vida “normal”, encontramos extraordinarios seres vivosunicelulares viviendo “cómodamente” a pHs muy ácidos o muy alcalinos, medrando ensalmueras y salinas, o reproduciéndose a temperaturas de más de 100ºC y a grandespresiones. Este tipo de microorganismos que habitan medios que los humanosconsideramos como “extremos” reciben el calificativo de extremófilos. En este capítuloveremos algunas de estas notables adaptaciones. Hasta ahora hemos venido considerando el crecimiento de las bacterias enfunción de su fondo genético, en relación con los nutrientes, y en unas hipotéticascondiciones ideales (óptimas). Sin embargo, el trabajo experimental conmicroorganismos ha de tener en cuenta los factores ambientales, es decir, una serie deagentes físicos y químicos que1) modifican la velocidad de crecimiento, provocando cambios que, a determinados valores de dichos factores pueden llegar a ocasionar la muerte de microorganismos;2) condicionan la distribuición de los microorganismos en sus ecosistemas y hábitats naturales;3) permiten a los humanos controlar el crecimiento microbiano, por medio de la fijación de parámetros para: a) la mutagénesis, b) la esterilización y desinfección, c) la quimioterapia. No todos los microorganismos toleran del mismo modo un determinado factorambiental. Así, unas determinadas condiciones pueden ser nocivas para una especiebacteriana, y en cambio ser neutras o beneficiosas para otra. Antes de abordar el estudio de distintos agentes ambientales, conviene distinguirentre los efectos que un determinado agente puede tener sobre la viabilidad y los efectosque pueden simplemente afectar al crecimiento, a la capacidad de diferenciación (si lahubiera) o de reproducción. 1
  • 3. Los principales tipos de factores a considerar se pueden desglosar de la siguientemanera: Agentes físicos (tema 13) Agentes químicos (tema 14) Temperatura Desinfectantes y antisépticos Desecación Quimioterápicos de síntesis Radiaciones Antibióticos Ondas sonoras Presión hidrostática Presión osmótica pH2 EFECTO DE LA TEMPERATURA2.1 EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE ELCRECIMIENTO La temperatura es uno de los parámetros ambientales más importantes quecondicionan el crecimiento y la supervivencia de los microorganismos. La temperatura afecta a la velocidad de crecimiento (y, por lo tanto al tiempo degeneración, g). Cada bacteria (y suponiendo que el resto de condiciones ambientales semantienten constantes) muestra una curva característica de tasa de crecimiento enfunción de la temperatura, donde podemos distinguir tres puntos característicosllamados temperaturas cardinales:El margen entre la temperatura mínima y la máxima se suele llamar margen decrecimiento, y en muchas bacterias suele comprender unos 40 grados. La temperatura mínima se puede explicar en función de un descenso de lafluidez de la membrana, de modo que se detienen los procesos de transporte denutrientes y el gradiente de protones. Por encima de la temperatura mínima la tasa de crecimiento va aumentandoproporcionalmente hasta alcanzar la temperatura óptima, debido a que las reaccionesmetabólicas catalizadas por enzimas se van aproximando a su óptimo. En dichatemperatura óptima las enzimas y reacciones se dan a su máxima tasa posible. A partir de la temperatura óptima, si seguimos subiendo la temperatura seproduce un descenso acusado de la tasa de crecimiento hasta alcanzar la temperaturamáxima. Dicha temperatura refleja desnaturalización e inactivación de proteínas 2
  • 4. enzimáticas esenciales, colapsamiento de la membrana citoplásmica y a veces lisistérmica de la bacteria.Obsérvese en el gráfico que la temperatura óptima está más cerca de la máxima que dela mínima. Temperatura mínima: por debajo de ella no hay crecimiento; Temperatura máxima: por encima de ella tampoco existe crecimiento; Temperatura óptima: permite la máxima tasa de crecimiento (o sea, g mínimo).2.2 CLASES DE MICROORGANISMOS SEGÚNLA TEMPERATURA: ADAPTACIONESEVOLUTIVAS Cada especie o cepa bacteriana tiene temperaturas cardinales distintas, de modoque una bacteria puede presentar una temperatura óptima superior a la temperaturamáxima de otra, o inferior a la temperatura mínima de una tercera. Según el rango detemperaturas al que pueden crecer las distintas bacterias, se pueden establecer tres tiposprincipales:2.2.1 MICROORGANISMOS PSICRÓFILOSLas psicrófilas o criófilas: crecen a partir de entre -5 a 5ºC. a) Las llamadas psicrófilas obligadas tienen temperatura óptima a 15-18ºC, como por ejemplo Flavobacterium. La bacteria Polaromonas vacuolata, recientemente aislada en aguas heladas de la Antártida es lo que pudiéramos llamar un 3
  • 5. psicrófilo extremo: tiene su óptimo de crecimiento en 4ºC, y es incapaz de crecer a 14ºC (¡se muere de calor!). b) Las psicrófilas facultativas o psicrotolerantes (también llamadas psicrotrofas) presentan temperatura óptima en torno a los 20-30ºC y máximas a los 35ºC. Las bacterias y hongos psicrotrofos son los responsables de que los alimentos guardados en nevera se estropeen al cabo del tiempo.Ejemplos de medios permanentemente fríos son la mayor parte de las aguas oceánicas(cuya temperatura media es de unos 5oC, pero que en las profundidades alcanzan sólo 1-2ºC por encima de cero) y las áreas permanentemente heladas del Ártico y de laAntártida. En los medios helados existen pequeñas bolsas o microcavidades de agualíquida, donde pueden medrar algunos microorganismos. Un ejemplo no bacteriano muycaracterístico es el alga de las nieves (Chlamydomonas nivalis), que llega a conferircolor rojo a la nieve en algunas zonas de montaña a mitad de la estación estival. Las principales adaptaciones bioquímicas a medios fríos exhibidas por estosmicroorganismos psicrófilos son: enzimas más resistentes al frío; sistemas de transporte adaptados a bajas temperaturas; los fosfolípidos de la membrana celular aumentan la proporción de ácidos grasos insaturados (y en algunas bacterias, poliinsaturados, con entre 4 y 9 dobles enlaces); ello supone que la membrana sigue en su estado semifluido, evitándose su congelación. Los psicrotrofos (psicrófilos facultativos) son más abundantes, ya que estánadaptados a soportar grandes oscilaciones térmicas, y en verano pueden crecer a unos30ºC-40ºC. Algunas bacterias y hongos pueden crecer en alimentos (carne, leche, frutasy hortalizas) que se guardan en frigoríficos, alterando las cualidades organolépticas eincluso, echándolos a perder (una experiencia que casi todos hemos tenido).2.2.2 MICROORGANISMOS MESÓFILOS Los mesófilos presentan temperaturas óptimas a los 25-40ºC y máximas entre 35y 47ºC. La mayor parte de las eubacterias (incluyendo las patógenas) pertenecen a estacategoría. La mayor parte de los microorganismos que viven en ambientes templados ytropicales, incluyendo los simbiontes y parásitos, pertenecen a esta categoría.2.2.3 MICROORGANISMOS TERMÓFILOS Las únicas formas de vida capaces de vivir por encima de 65ºC son todasprocariotas. Los termófilos presentan óptimos a 50-75ºC y máximos entre 80 y 113ºC.Dentro de esta categoría se suele distinguir las termófilas extremas (=hipertermófilas),que pueden llegar a presentar óptimos cercanos a los 100ºC, y que taxonómicamentepertenecen al dominio de las Archaea. Los hábitats naturales con temperaturas permanentemente altas (por encimade 45-50ºC) están restringidos a unas pocas zonas de la biosfera, normalmenterelacionadas con fenómenos volcánicos: 4
  • 6. fuentes termales volcánicas terrestres (en zonas de EE. UU., Japón, Nueva Zelanda e Islandia); fuentes termales submarinas: los llamados “humeros” (fumarolas hidrotermales) asociados a las grandes dorsales oceánicas); fumarolas Los materiales en fermentación como acúmulos de abono (compost) y ensilados pueden alcanzar 65ºC. Como ejemplo “clásico”, muy conocido por documentales de divulgación, recordemos que en el famoso Parque Nacional de Yellowstone, en EE UU, existe la mayor concentración mundial de fuentes volcánicas, con géiseres que emiten a más de 100oC, siendo esta temperatura bastante constante, con oscilaciones de +/- 1 ó 2oC. Cuando esta agua sale, lo hace a punto de ebullición. El riachuelo que genera va bajando su temperatura en su recorrido, de modo que se genera un gradiente de temperatura en el que se pueden estudiar fascinantes comunidades microbianas adaptadas a esas diversas temperaturas. Allí fue donde T.D. Brock descubrió la eubacteria termófila Thermus aquaticus, de la que se extrae la ADN polimerasa termorresistente (Taq) empleada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) automatizada. Recientemente se está recurriendo a usar la polimerasa de una arquea hipertermófila, Pyrococcus furiosus, que funciona muy bien a 100ºC. Los hipertermófilos, con óptimos por encima de los 80ºC son de hecho incapaces de crecer a menos de 37 oC, como las citadas arqueas (ej., Thermoproteus, Pyrococcus, Pyrodictium). La arquea Pyrolobus fumarii, habitante de los humeros termales submarinos tiene su óptimo nada menos que a 105ºC y puede llegar a aguantar 113ºC, y parece que detiene su metabolismo (por “frío”) a la “agradable” temperatura de 90ºC (!). Las termófilas facultativas pueden crecer a menos de 37ºC, como p. ej. la eubacteria Thermus aquaticus. Se han aislado bacterias termófilas en medios artificiales, como calentadores deagua domésticos e industriales. Las principales adaptaciones bioquímicas a altas temperaturas en célulasvegetativas bacterianas son: enzimas termorresistentes. Algunas de ellas tienen un interior molecular muy hidrófobo; ribosomas termorresistentes; membranas ricas en ácidos grasos saturados, que permiten enlaces hidrofóbicos más fuertes. En Arqueas hipertermófilas los lípidos son muy especiales: en vez de basarse en ésteres de ácidos grasos con el glicerol, se trata de éteres de hidrocarburos unidos al glicerol (el enlace éter es más resistente). Algunas, además, en vez de la típica bicapa lípídica, exhiben una monocapa bioquímica de C40-bifitanil-tetraéteres (resultado de unirse “cola con cola” dos C20-fitanil-diéteres), que condicionan una extrema resistencia a agentes ambientales. (repasar tema 6). 5
  • 7. 2.3 EFECTO LETAL DEL CALOR Al subir la temperatura por encima de la temperatura máxima de crecimiento, sedejan sentir los efectos sobre la viabilidad: la pérdida de viabilidad significa que lasbacterias dejan de ser capaces de crecer y dividirse, aun cuando las transfiramos a unmedio idóneo. La muerte por calor es una función exponencial de primer orden:dN/dt = -KT·N O sea, y como se puede constatar en el gráfico adjunto, la acción del calorsupone la muerte de una fracción constante (KT) de la población sobreviviente en cadamomento. La cinética de primer orden sugiere que no existen efectos acumulativos, sino que lamuerte se debe a la destrucción o inactivación irreversible de una molécula o estructuraesencial (como p. ej. el ADN cromosómico o por creación de un daño irreparable en lamembrana). ¿Cómo podemos caracterizar o medir en la práctica la inactivación por calor deuna suspensión bacteriana? He aquí algunos parámetros utilizados: tiempo térmico mortal: es el tiempo mínimo requerido para que mueran todas las bacterias de una determinada suspensión a una determinada temperatura; tiempo de reducción decimal: es el tiempo requerido para reducir al 10% la densidad de la suspensión, a una determinada temperatura (también llamado valor D); punto térmico mortal: es la temperatura mínima que mata a todas las bacterias en un tiempo determinado (normalmente el tiempo de referencia empleado es de 10 min). 6
  • 8. Ejemplos punto térmico mortal Especies 55oC Escherichia coli 60oC Mycobacterium tuberculosis 120oC endosporas de especies muy resistentes de Bacillus. Estos tres parámetros se emplean frecuentemente en industrias alimentarias,como en las de fabricación de conservas, centrales lecheras, etc. Antes de seguir adelante, es importante tener claro que, dependiendo de latemperatura y el tiempo a que sometamos un material a tratamiento térmico, lograremosinactivación parcial de la población microbiana (es decir, queda una fracción decélulas viables) o bien esterilización (=inactivación total). En general, entendemos por esterilización todo tratamiento de un material conun agente físico (como el calor, que nos ocupa en este momento) o químico (comoveremos en el capítulo 14) que acarrea la eliminación de toda forma de vida en él. Unavez estéril, el material sigue estéril indefinidamente con tal de que esté encerrado en uncompartimento estanco, sellado y libre del contacto con microorganismos del ambienteexterior.Centrándonos de nuevo en el calor, la inactivación parcial o la esterilización se puedenlograr por calor húmedo o por calor seco. La inactivación (total o parcial) por calor se debe a la desnaturalización deproteínas y a la fusión de lípidos de membrana, debido a que se rompen muchos enlacesdébiles, sobre todo los puentes de hidrógeno entre grupos -C=O y H2-N-. Estos enlacesse rompen más fácilmente por calor húmedo (en atmósfera saturada de vapor de agua),debido a que las moléculas de agua pueden desplazar a los puentes de hidrógeno.2.3.1 CALOR HÚMEDO Por lo tanto, la inactivación por calor húmedo requiere menores temperaturasque la que se realiza en ausencia de agua. Veamos algunos ejemplos de condiciones deinactivación total por calor húmedo: Microorganismo condiciones La mayoría de células vegetativas, de bacterias, levaduras y 80oC , 5-10 min hongos Bacilo tuberculoso 58oC , 30 min Bacilo tuberculoso 59oC , 20 min Bacilo tuberculoso 65oC , 2 min Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis 60oC , 60 min La mayoría de esporas de bacterias patógenas 100oC , pocos min esporas del patógeno Clostridium botulinum 100oC , 5,5 horas esporas de Clostridium y Bacillus saprofitos 100oC , muchas horas esporas de Clostridium y Bacillus saprofitos 120oC , 15 minutos 7
  • 9. Veamos los métodos principales de lograr esterilización de materiales por calorhúmedo:Autoclave (introducido por Chamberland en 1884): Es un aparato que permite calentarmuestras por calor húmedo a temperaturas superiores a las de ebullición del agua (sinque ésta hierva), debido a que el tratamiento se efectúa en un compartimento estancosaturado con vapor de agua y a presiones superiores a la atmosférica. (Elfuncionamiento del autoclave será oportunamente explicado en clases prácticas). Losparámetros de esterilización suelen ser: temperatura 121ºC y 10-15 min. Como se puedededucir, estos parámetros vienen fijados por la resistencia de las esporas de especiessaprofitas (ver última línea de la tabla anterior), que son las formas de vida que másaguantan el calor sin perder viabilidad.(Hay que tener en cuenta que, en la práctica, a veces hay que emplearcondiciones diferentes; por ejemplo: si queremos esterilizar grandes volúmenesde líquido, habrá que prolongar el tratamiento, 30 o 40 min, ya que el centro delrecipiente donde va el líquido tarda más en alcanzar la temperatura deesterilización. Los medios de cultivo que incluyen glucosa deben esterilizarse a115oC, ya que a temperaturas superiores la glucosa "carameliza"; por lo tanto,en estas ocasiones, el tiempo también es mayor: 30 min). La acción rápida del calor húmedo depende en buena parte del alto valor decalor latente del agua (540 cal·g -1); ello hace que los objetos más fríos (como lasmuestras a esterilizar) se calienten rápidamente por condensación de agua en susuperficie.Tindalización (nombre en honor de John Tyndall): Es un método de esterilizaciónfraccionada para materiales que se inactivan o estropean a más de 100ºC. Consiste ensometer el material a varios ciclos (normalmente 3 ó 4) de dos fases sucesivas cada uno: a) en la primera fase el material se calienta a una temperatura entre 50 y 100ºC, durante 1 ó 2 horas; b) en la segunda fase el material se incuba en una estufa, a 30-37ºC durante 24 horas. Durante las fases de tipo a) mueren todas las células vegetativas de la muestra,pero permanecen viables las esporas, que quedan activadas para germinar. Durante lasfases de tipo b) se produce la germinación de las esporas activadas en la respectiva faseanterior. En la siguiente fase de tipo a) morirán las células vegetativas procedentes de lagerminación en la fase anterior; y así sucesivamente, hasta que al cabo de unos cuantosciclos no queda ningun microrganismo en la muestra. Como se puede ver, este método es bastante engorroso y consumidor de tiempo,por lo que en los últimos años ha sido reemplazado por otro método de esterilización,aunque ya no dependiente del calor: se trata de la esterilización por filtración. Consistede hacer pasar una solución a través de una membrana o filtro de un tipo de material(normalmente nitrato de celulosa) que presenta poros de un tamaño inferior al decualquier célula bacteriana (diámetro de poro =0,22 m). 8
  • 10. Aplicaciones principales del calor húmedo:1. En la práctica cotidiana del laboratorio de microbiología, en la esterilización de medios de cultivo y soluciones.2. En la esterilización de material quirúrgico.3. En la esterilización o inactivación parcial, en las industrias alimentarias (conservas, leche y derivados). a) En la industria láctea se emplean como métodos de esterilización la llamada uperización. La uperización o tratamiento UHT consiste en un tratamiento de calor húmedo donde se emplean temperaturas muy altas durante unos pocos segundos (p. ej.: 135-150ºC durante 1-2 seg). b) Pero no siempre es imprescindible esterilizar la leche, sino que puede bastar eliminar los posibles microorganismos patógenos que pueden contaminarla, y que son más sensibles al calor que los saprófitos inofensivos. Con esta inactivación parcial de la población microbiana de la leche logramos que ésta se conserve durante unos días, sin alterar apenas sus cualidades organolépticas y nutricionales. He aquí los procedimientos más habituales para conseguir esto: i. La pasteurización (en honor a Pasteur, que la introdujo en los años 1860) consiste en tratar la leche a 63oC durante 30 min, tras los cuales se enfría y envasa rápidamente. ii. La pasteurización instantánea (también conocida por sus siglas en inglés HTST, de high temperature-short time) se logra calentando a 72ºC durante sólo 15 segundos, tras de lo cual la muestra se enfría rápidamente. Esta técnica es la más usada actualmente, ya que: mata más rápidamente; mata mejor organismos más resistentes; altera menos el sabor; actúa en flujos continuos (y permite procesar grandes volúmenes de leche). Tras la pasteurización, el número de bacterias viables desciende un 97-99%. Los potenciales patógenos que pueda llevar la leche (Brucella, Salmonella, bacilo tuberculoso, Streptococcus, etc) son eliminados fácilmente. La pasteurización también se emplea para la preparación de vacunas a base de microorganismos inactivados por el calor.2.3.2 CALOR SECO Como ya dijimos, la esterilización por calor seco necesita recurrir a mayorestemperaturas que la efectuada por el calor húmedo, ya que al no existir agua, la roturade puentes de hidrógeno y la desnaturalización de proteínas, así como la fusión demembranas, se efectúan a mayores energías. Otros efectos del calor seco son los dañospor oxidación y el provocar un aumento de la concentración de electrolitos. 9
  • 11. Aplicaciones del calor seco:1. El llamado horno de Pasteur, mediante calentamiento a 160-170ºC durante 2-3 horas permite esterilizar materiales inertes de laboratorio resistentes al calor: material de vidrio y metálico, aceites y jaleas, etc.2. Flameado a la llama (hasta el rojo) de asas metálicas de siembra, con las que se inoculan las bacterias.3. Incineración de materiales de desecho.2.4 EFECTO DE LAS BAJAS TEMPERATURASSOBRE LAS BACTERIAS Las bajas temperaturas (por debajo de la temperatura mínima) no son útiles parala esterilización, ya que, aunque existen algunas bacterias que mueren por congelación(p. ej., especies patógenas de Neisseria), el efecto de este tratamiento sobre otrasmuchas es, sobre todo, bacteriostático, sin contar aquellos organismos psicrófilos opsicrotrofos. Los efectos de someter una suspensión bacteriana a temperaturas menores de0ºC dependen de: el medio donde están suspendidas las bacterias; el modo en que se realice la congelación y una ulterior descongelación. Cuando la temperatura es ligeramente inferior al punto de congelación delmedio, el citoplasma queda en sobrefusión (sin congelar) entre -1 y -10ºC. Pero comola tensión de vapor de agua en el interior es mayor que en el exterior, existe unatendencia a restablecer el equilibrio, que puede ser: por pérdida de agua de la célula (cuando la congelación se efectúa lentamente), o bien por cristalización de agua en el interior (cuando la congelación se realiza rápidamente).En ambos casos la consecuencia es que las sales intracelulares se concentran, lo quesupone que la solución del citoplasma puede llegar a saturarse, con precipitación desales. Ello conlleva varias consecuencias: los cristales de sales y la alta concentración deelectrolitos provocan la desnaturalización de proteínas y daños a la membrana; otroefecto de menor importancia es el daño mecánico a la pared celular y a la membranaprovocado por los cristales de hielo. En general, el enfriamiento rápido es más lesivo que el lento, existiendo unavelocidad óptima. Cuando una bacteria se enfría rápidamente a -35ºC se producencristales de hielo que provocan daños cuando la muestra se descongela. Por lo tanto, otro factor a tener en cuenta es la manera de realizarse ladescongelación, y el número de ciclos de congelación-descongelación. La 10
  • 12. descongelación lenta es más letal que la rápida, ya que aumenta el volumen de cristalesde hielo.Aplicaciones de la congelación: La congelación se aplica, en laboratorio, para preservar muestras bacterianasdurante largos periodos de tiempo. Como acabamos de ver, y con objeto demaximizar la viabilidad bacteriana el mayor tiempo posible, es importante cómo seefectúa tanto la congelación como la descongelación. Una vez congeladas, las bacteriassupervivientes conservan su viabilidad durante mucho tiempo, siempre que latemperatura se mantenga por debajo del punto eutéctico: en nieve carbónica (CO2 sólido), a -78ºC; en nitrógeno líquido, a -180ºC. Por ello, este método es usado en el laboratorio para guardar cultivos durantelargas temporadas. El inconveniente de emplear nieve carbónica o nitrógeno líquido esque hay que reponerlos con relativa frecuencia. Como veremos enseguida, hay métodosmenos engorrosos y caros de mantener viables muestras microbianas durante largosperiodos de tiempo. Para preservar aún mejor las bacterias a bajas temperaturas, se recurre a añadir ala suspensión ciertas sustancias, como por ejemplo: Sustancias no ionizables de bajo peso molecular que provocan la solidificación amorfa y vítrea, en lugar de la cristalización, evitando así la formación de zonas intracelulares con alta concentración de sales: glicerina, sacarosa, lactosa, dimetilsulfóxido (DMSO). Materiales ricos en proteína: leche, suero, extracto de carne. Proteínas purificadas (p. ej., la albúmina). Determinadas macromoléculas: polivinilpirrolidona (PVP), dextranos. La suspensión bacteriana puede aguantar varios meses congelada con estassustancia entre -25 a -30ºC, en congelador. Si se hace con nitrógeno líquido, laconservación puede ser de varios años.3 LIOFILIZACION La liofilización es la desecación al vacío de una muestra previamente congelada.Aplicada a bacterias, es uno de los métodos que mantiene por más tiempo la viabilidadbacteriana (varios años). Para obtenerla, el cultivo bacteriano se adiciona de leche osuero (véase epígrafe anterior), se congela sobre nieve carbónica (-78ºC), y se conecta auna bomba de vacío, que provoca la desecación. La eliminación de toda el agua sobre lamuestra congelada aumenta la viabilidad de ésta, que se guarda en ampollas cerradas devidrio a temperatura ambiente, hasta su uso, que como vemos, puede ser inclusomuchos años después. 11
  • 13. 4 EFECTO DE LA DESECACIONSOBRE LAS BACTERIAS La desecación al aire (sin vacío) mata a las células vegetativas bacterianas, perono a las endosporas. La sensibilidad a la desecación varía de una especie a otra.Ejemplos: Mycobacterium tuberculosis (el bacilo tuberculoso) es muy resistente al aire (en ausencia de luz), de ahí que pueda aguantar varios meses a partir de los esputos de enfermos. En cambio, el vibrión colérico (Vibrio cholerae) muere expuesto al aire al cabo de sólo dos horas.Las causas de la muerte son, principalmente: el aumento de concentración intracelular de sales, lo que conlleva efectos tóxicos y desnaturalizantes de proteínas; daños por oxidación.La mayor eficacia de la desecación al aire se logra con 50% de humedad relativa.5 EFECTO DE LAS RADIACIONESSOBRE LAS BACTERIAS5.1 CONCEPTOS GENERALES SOBRERADIACIONES Y BIOMOLÉCULAS Se puede definir la radiación como la propagación de energía por el espacio. Losprincipales tipos de radiaciones que pueden tener efectos sobre los seres vivos son: radiación electromagnética (longitudes de onda, en nm) radiación infrarroja (IR) 800-106 radiación visible 380-800 ultravioleta (UV) 13,6-380 rayos X 0.14-13.6 rayos 0.001-0.14 rayos cósmicos < 0.001Los efectos derivados de la absorción de radiación dependen de: la energía de la radiación absorbida; la naturaleza del material. 12
  • 14. 1) Si la energía es E>10 eV, hablamos de radiaciones ionizantes: son los rayos X y losrayos (estos últimos se emiten como resultado de la desintegración de radioisótopos).Un fotón de gran energía incide sobre un átomo, provocando la expulsión de un electrónde gran energía (fotoelectrón), y quedando el átomo en forma ionizada (cargadopositivamente). El electrón expulsado suele tener energía suficiente para originar unanueva ionización, de la cual surge otro electrón de alta energía, etc... produciéndose unacadena de ionizaciones, con transferencia linear de energía, hasta que ésta se disipaen el material: el último electrón de la cadena es captado por otro átomo o molécula,que queda cargado negativamente. El resultado final es que se forman pares de iones(uno positivo y otro negativo). A su vez, esos iones originados tienden a experimentarreorganizaciones electrónicas ulteriores, que dan pie a cambios químicos en el sistemaque se había sometido a la irradiación.2) Si la energía es E<10 eV, no se producen ionizaciones: los electrones del átomo omolécula pasan transitoriamente (de 10-8 a 10-10 segundos) a un nivel energéticosuperior (entonces se habla de que el átomo o molécula están excitados), peroenseguida dicho electrón vuelve al estado energético inicial. En su regreso a su nivelenergético previo, el electrón puede dar origen a una variedad de fenómenos: fluorescencia: emisión de energía a una longitud de onda mayor que la del fotón incidente; fotosensibilización: la energía se transfiere a otra molécula; reacciones fotoquímicas: se origina un cambio químico; emisión de calor: la energía simplemente se disipa en colisiones entre moléculas. La luz visible y UV pueden dar origen a reacciones fotoquímicas, aparte decalor. Pero la radiación infrarroja sólo conduce a disipación de calor, si bien ciertasbacterias fotosintéticas anoxigénicas pueden aprovechar el infrarrojo para lafotosíntesis.5.2 EFECTOS DE LAS RADIACIONESIONIZANTES Y SUS APLICACIONES Aunque la unidad de radiación emitida es el roentgen (R), a efectos biológicos seusan parámetros que miden la energía absorbida por el sistema: las unidades son el rad(100 erg/g) y el gigaray (1Gy = 100 rads). En general, los microorganismos son más resistentes a las radiaciones ionizantesque los seres superiores. Por ejemplo, la dosis de reducción decimal (D10) para lasendosporas de ciertas especies de Clostridium es de 2000-3000 Gy. Las célulasvegetativas de la bacteria Deinococcus radiodurans (observe el nombre específico) esde 2.200 Gy. Otras especies más “normales” poseen una dosis de reducción decimal entorno a 200-600 Gy. Compara estos datos con el valor de sólo 10 Gy como dosis letalpara humanos. Las fuentes de radiaciones ionizantes son los aparatos de rayos X, los rayos ylos radioisótopos, como el Co 60 o el Cs137. 13
  • 15. Los efectos de las radiaciones ionizantes son letales, tanto directos comoindirectos, así como mutagénicos. Los efectos letales directos se logran a altas dosis deradiación, mientras que los letales indirectos y mutagénicos se consiguen a menoresdosis. 1. Efecto letal directo: por impacto de cuantos de radiación ionizante sobre algunamolécula esencial para la vida, que es el ADN (ya que obviamente es absolutamenteesencial y suministra una sola copia de la mayoría de los genes bacterianos). Los dañosal ADN son, principalmente: roturas en ambas cadenas, y entrecruzamiento entre dichascadenas, que no puedan repararse. 2. Efecto mutagénico: deriva de la producción de daños menores al ADN que puedenrepararse por mecanismos propensos a error.3. Efecto letal indirecto: este tipo de efecto es el más importante, y deriva de la radiolisis del agua, que genera hidrógeno naciente (H·) y radical hidroxilo (OH·). El radical hidroxilo reacciona fácilmente con macromoléculas, sobre todo con ADN, provocando roturas en ambas cadenas, lo cual se traduce en efectos de letalidad. Si, además, la bacteria está expuesta al oxígeno mientras se la está irradiando, el efecto es aún más intenso, debido a que el O2 reacciona con los radicales libres, originando cadenas de reacciones de autooxidación, muy destructivas, y promoviendo la formación de peróxidos y epóxidos, asimismo letales. H· + O2 ·HO22 ·HO2  H2O2 + O2Las principales aplicaciones de las radiaciones ionizantes son la esterilización de: material farmacéutico (antibióticos, hormonas, etc); material médico-quirúrgico (guantes de cirujano, suturas de nylon, jeringas desechables, agujas, bisturíes, catéteres, prótesis, etc); alimentos envasados (aunque en algunos países aún sigue abierta la polémica por parte de ciertos grupos sobre la seguridad de este tratamiento).5.3 EFECTOS DE LAS RADIACIONESULTRAVIOLETA La radiación UV tiene un efecto letal y mutagénico, que depende de su longitudde onda. Ello se debe a la absorción selectiva de longitudes de onda por parte de ciertasmoléculas biológicas: Las proteínas tienen dos picos (es decir, máximos) de absorción: uno a 280 nm, debido a los aminoácidos aromáticos (Trp, Tyr, Phe), y otro a 230 nm, debido a los enlaces peptídicos. El ADN y el ARN absorben a 260 nm, debido al enlace doble entre las posiciones 4 y 5 de las bases púricas y pirimidínicas. 14
  • 16. Los rayos UV no tienen actividad ionizante, pero provocan cambios químicos enlas moléculas absorbentes, de modo que aparecen moléculas alteradas denominadasgenéricamente fotoproductos. Los fotoproductos originan la inactivación demacromoléculas, aunque, como veremos enseguida, el ADN dispone de mecanismospara paliar o eliminar estas modificaciones potencialmente lesivas. Las consecuencias de inactivar proteínas o ARN no se dejan sentir a efectos deletalidad, ya que existen muchas copias de cada uno de estos tipos de macromoléculas, yse pueden volver a sintetizar. En cambio, la inactivación del único cromosoma de labacteria tiene efectos letales primarios y efectos mutagénicos secundarios. Por lo tanto,el espectro de acción biológica de la luz UV equivale al de absorción del UV por elADN (260 nm).5.3.1 FOTOPRODUCTOS DEL ADN OCASIONADOS POR LA LUZUV Los fotoproductos generados por la luz UV en el ADN derivan principalmentede alteraciones en las bases pirimidínicas (citosina, timina): a) dímeros de pirimidina (anillo ciclobutano) b) fotoproducto de la endospora (5-timinil-5,6-dihidrotimina) c) hidratos de pirimidinaLos dímeros de pirimidina son los fotoproductos más importantes en las célulasvegetativas bacterianas. El principal es el dímero de timina (T-T), aunque también seproducen T-C y C-C. Como se puede observar, se trata de aductos (uniones) entre dospirimidinas adyacentes en la misma hebra de ADN, mediante la creación de un anillo deciclobutano. Su efecto principal es la distorsión local de la configuración de la doblehélice, que interfiere en el normal emparejamiento de bases complementarias; ello, a suvez, provoca una interferencia en los procesos de replicación y transcripción, ysecundariamente en el crecimiento y la respiración. A dosis muy altas de rayos UV se forman también dímeros entre pirimidinas delas dos cadenas, es decir, se provocan entrecruzamientos de las dos hebras queigualmente afectan a la replicación y a la transcripción, aunque este tipo de dañosreviste menos significación biológica.El fotoproducto de la espora es la 5-timinil-5,6-dihidrotimina. Como vimos en elcapítulo 9, se forma en la endospora bacteriana debido al alto grado de deshidratación,pudiendo ejercer igualmente efectos inactivantes.Los hidratos de pirimidina (como la 6-hidroxi-5,6-dihidrotimina) se forman a altasdosis de luz UV. Tienen efecto mutagénico (no letal), favoreciendo la aparición detransiciones T=A a C G. 15
  • 17. 5.3.2 MECANISMOS DE REPARACION DE LOSFOTOPRODUCTOS Debido al carácter esencial del ADN como molécula central informativa de losseres vivos, la evolución ha desarrollado una serie de mecanismos capacitados paraenfrentarse con los posibles daños ocasionados por la luz ultravioleta. Los principalesmecanismos hallados en bacterias se pueden agrupar así:1) Mecanismos prerreplicativos: a) reparación fotoenzimática o fotorreactivación, que permite la reparación directa del daño en sí b) reparación por escisión y resíntesis2) Mecanismos posreplicativos: a) reparación por recombinación b) reparación inducible de emergencia (SOS)A) Reparación fotoenzimática Se debe a la actuación de una enzima denominada fotoliasa o enzimafotorreactivante, que muchas bacterias sintetizan de manera constitutiva. Las fotoliasasreparan directamente los dímeros de pirimidina, en una reacción que requiere luzvisible de 300-500 nm de longitud de onda (luz azul). Estas enzimas poseen dos gruposprostéticos coloreados (cromóforos): flavina reducida (FADH2) una pterina.Mecanismo1) La primera fase del mecanismo es independiente de la luz. La fotoliasa reconoce el dímero de pirimidina, y se une a él, formando un complejo enzima-sustrato [E-S].2) La flavina reducida (FADH2) de la fotoliasa, en presencia de luz ( =300-500), se excita, y dona electrones al anillo de ciclobutano del dímero de pirimidina, rompiéndolo, y regenerando las dos pirimidinas sin alterar. Aunque se sabe que el segundo cromóforo (la pterina) favorece la reparación, noestá claro cuál es su papel exacto.No todas las bacterias tienen enzimas fotorreactivantes, pero en cambio lafotorreparación está muy extendida entre eucariotas.B) Reparación por escisión-resíntesis 16
  • 18. La distorsión en la doble hélice provocada por el dímero es reconocida por uncomplejo proteico con actividad de endonucleasa correctora, conocido comocorrendonucleasa o escinucleasa. El daño se repara indirectamente (es decir, no seactúa sobre el propio fotoproducto), sino que las bases dañadas se eliminan (seescinden) formando parte de un oligonucleótido, y el hueco resultante se rellena porresíntesis reparadora de ADN.Mecanismo:1) Un complejo formado por dos subunidades de la proteína UvrA y una de la UvrB (Uvr[A2B]) se une cerca del dímero de pirimidina, usando la energía de la hidrólisis del ATP, y merced a su actividad helicasa, desenrolla localmente la doble hélice.2) Se une la proteína UvrC, con lo que se completa el complejo Uvr[A2BC], es decir, la correndonucleasa, unido a la cadena dañada del ADN, cerca del dímero.3) La correndonucleasa realiza dos cortes en la cadena afectada por el dímero: corta el 8º enlace fosfodiéster “a la izquierda” del dímero (o sea, hacia el lado 5) respecto de la localización del dímero y corta el 4º o 5º enlace fosfodiéster “a la derecha” (en dirección 3 del dímero). Por lo tanto, se produce y libera un fragmento de unos 12 nucleótidos de longitud, que incluye al dímero de pirimidina, al mismo tiempo que se retira la escinucleasa, que se separa en sus polipéptidos constituyentes.4) Queda, pues, un hueco de cadena sencilla en el ADN. Este hueco es ocupado ahora por la ADN-polimerasa-I y por la ADN-helicasa-II (codificada por el gen uvrD), que llevan a la síntesis de nuevo ADN para rellenar el hueco (por supuesto, en sentido 5  3), tomando como molde la cadena intacta, y usando como cebador (“primer”) el extremo 3-OH que se había generado en la fase anterior.5) Finalmente, la actuación de la ADN-ligasa sella la cadena (regeneración del enlace fosfodiéster del lado 5).C) Reparación por recombinación Cuando la ADN-polimerasa-III bacteriana (que es la enzima que normalmentereplica el cromosoma) se encuentra, en la cadena que está usando como molde, con undímero de pirimidina, deja de replicar esa zona, y “salta” unos 1000 nucleótidos másadelante para seguir la replicación. Por lo tanto, deja un gran hueco o mella de unos1000 nucleótidos. Esta discontinuidad (llamada mella post-replicativa) se puede rellenarpor el mecanismo de reparación por recombinación general, recurriendo a la proteínaRecA, que verifica una recombinación con la hebra parental homóloga intacta.Mecanismo:1) Numerosas unidades de proteína RecA recubren la zona de cadena sencilla de la mella posreplicativa, formando estructuras helicoidales.2) La proteína RecA promueve emparejamiento homólogo de la cadena sencilla a la que recubre con la doble cadena “hermana” intacta. 17
  • 19. 3) Se produce un intercambio recíproco de cadenas.4) El extremo 3-OH libre de la cadena dañada (que merced al intercambio recíproco está ahora emparejada con la cadena complementaria procedente de la doble hélice “hermana”) sirve de cebador a la ADN-polimerasa-I, que sintetiza ADN nuevo usando como molde la cadena complementaria intacta del dúplex.5) Ligación e isomerización espontáneas, que produce la llamada “estructura de Holliday”, una figura en “X” donde hay dos sobrecruzamientos (“crossing-over”) que mantienen unidos entre sí a los dos duplex.6) Resolución de los dos sobrecruzamientos por sendas roturas y religaciones, lo cual genera dos dobles hélices ininterrumpidas. Como se ve en la figura, uno de estos dúplex lleva el dímero de pirimidina, y el otro es una doble cadena intacta, aunque parte de ella contien ADN de nueva síntesis. Como se puede ver, el mecanismo de reparación por recombinación no reparapor sí mismo la lesión en el ADN, pero logra reparar la mella postreplicativa, evitandoque se detenga la replicación del cromosoma. Al final del proceso el dímero como talsigue sin reparar, pero ahora tendrá una oportunidad de ser reparado por algún otromecanismo, como el de escisión-resíntesis.D) Reparación de emergencia (SOS) propensa a error Cuando la bacteria se somete a dosis elevadas de luz UV o a determinadosagentes químicos que dañan severamente el ADN, o que interfieren seriamente con lareplicación, puede ocurrir que los sistemas de reparación que hemos visto hasta ahorano sean suficientes para reparar todos los daños; en estas circunstancias se pone enmarcha un nuevo mecanismo, que es inducible y que calificamos como de emergencia,ya que tiende a salvaguardar la viabilidad de la célula, a costa de acumular mutacionescon frecuencia elevada (y por eso lo llamamos también propenso a error).Descripción del sistema en una célula normal (no sometida a daños al ADN): El gen lexA posee un nivel basal de expresión, de modo que codifica la proteínaLexA, que actúa como represor sobre su propio gen (represión autógena), así comosobre los genes recA, uvrA, B, C, umuDC. La represión no es total, sino que se da unnivel basal de producción de los polipéptidos correspondientes a estos genes. Así, porejemplo, el nivel de proteína RecA es suficiente para efectuar los procesos normales derecombinación, y los niveles de UvrABC son suficientes para reparar pequeños dañosen el ADN.Descripción del sistema en una célula severamente dañada: Una célula seriamente afectada por un agente que daña el ADN o interfiere consu replicación poseerá zonas de cromosoma con ADN de cadena sencilla (c.s.) sinreparar. Pues bien, este ADN de c.s. constituye una señal de situación de emergenciapara la proteína RecA: dicha proteína se une a esas regiones de c.s., de modo queadquiere una actividad proteasa muy específica (para distinguir esta actividad, usamosla nomenclatura RecA*). La proteína RecA* (activada como proteasa) induce la 18
  • 20. proteolisis del represor LexA (rompiéndolo entre dos aminoácidos concretos hacia lamitad de la molécula). Por lo tanto, ya no hay suficiente proteína LexA intacta comopara seguir reprimiendo a los genes citados (recA, uvrABC, umuDC). Dichos genes(llamados genéricamente genes SOS) se pueden expresar ahora a altos niveles, de modoque: Aumentan los niveles de RecA, lo que conlleva un aumento de la eficiencia de la reparación por recombinación; Aumentan los niveles de la escinucleasa (Uvr[A2BC]), lo que supone mejorar la reparación por escisión-resíntesis; Se expresan los genes umuDC, lo que se traduce en un aumento de la mutagénesis. Pero ¿por qué aumenta la mutagénesis? El mecanismo exacto no está claro. Se sabe que en esta situación de emergencia algunos dímeros de pirimidina son procesados con la intervención de los productos de recA y de umuD y umuC, de modo que hay una síntesis de emergencia de ADN que acarrea la frecuente introducción de bases incorrectas (es decir, es un proceso de reparación propenso a error). De esta manera, la célula salvaría su integridad en esta situación “límite”, pero acosta de adquirir frecuentes mutaciones. (¡Es mejor sobrevivir aunque sea con unascuantas mutaciones a morirse!).5.3.3 APLICACIONES PRACTICAS DE LA LUZ UV La luz UV se puede producir artificialmente en lámparas de vapor de mercuriode baja presión, que emiten el 90% de su radiación a 254 nm. La unidad de energía deradiación se mide en watts/(seg·cm2). - -1Por ejemplo, una lámpara de 15 watios emite una energía de 38 watts·cm 2·seg , a unamuestra situada a 1 metro de la lámpara. La luz UV es efectiva sobre bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. Ladosis letal para células vegetativas suele estar entre 1800 y 6500 watt·cm-2, pero lasendosporas requieren 10 veces más dosis. El uso práctico de la luz UV como agente esterilizante está limitado, ya quetiene poco poder penetrante: no entra en objetos sólidos, y además se ve apantalladapor el cristal y penetra poco en los líquidos. Su aplicación concreta más frecuente es enel control de infecciones por vía aérea: lámparas de desinfección en salas de hospitales yde laboratorios de investigación. En Microbiología se emplea la luz UV como agentemutagénico en bacterias (en muchos estudios que requieran obtener mutantescorrespondientes a cualquier tipo de fenotipos, para conocer las correspondientes basesgenéticas).5.4 EFECTOS DE LA LUZ VISIBLE A diferencia de la UV, la luz visible es de baja energía, y además, sus cuantos notienen efectos selectivos sobre el ADN, por lo que no sería de esperar, en principio, queeste tipo de radiación tuviera efectos negativos sobre las bacterias. Sin embargo, la luz 19
  • 21. visible puede ejercer un efecto negativo indirecto, en el fenómeno de sensibilizaciónfotodinámica. La luz visible de fuerte intensidad (p. ej., exposición a pleno sol) es capaz dematar las bacterias, debido a que ciertas moléculas de éstas (riboflavinas, porfirinas,citocromos) absorben la energía de los cuantos y se excitan durante 10 -6-10-8 seg, tras locual reemiten la energía a otras moléculas, originando fotooxidaciones en residuos Hisy Trp de las proteínas y en las bases de los ácidos nucleicos. También se puede generaroxígeno singlete (1O2), que es un radical muy reactivo, oxidante, que puede destruir lacélula con rapidez. Así pues, la moraleja práctica es: no dejarse los cultivos bacterianos expuestos ala luz solar, sino que habrán de cultivarse en oscuridad (salvo el cultivo de las bacteriasfototrofas). Ciertas bacterias (entre ellas las fotosintéticas, y las que se propagan vía aérea)poseen abundantes pigmentos de tipo carotenoide que las protegen de estos efectosfotosensibilizadores. (Los carotenoides captan la energía del oxígeno singlete y lareenvían al estado basal, no excitado).6 EFECTOS DE LAS ONDASSONORAS Las ondas sonoras audibles para los humanos poseen un rango de frecuenciasentre los 9 kilociclos y los 20 kilociclos/segundo. Por encima de 20 Kc se sitúan lasondas supersónicas (hasta los 200 Kc/seg) y las ultrasónicas (desde 200 hasta 2000Kc/seg). Estos tipos de ondas de frecuencias superiores a las audibles (sobre todo lasultrasónicas) tienen el efecto de desintegrar las células. El fundamento de esta acción es el siguiente: el paso del sonido a través de unlíquido produce cambios de presión alternantes (por los sucesivos frentes de ondas), quea grandes frecuencias originan cavidades (burbujas de gases disueltos) de unos 10 mde diámetro (fenómeno de cavitación). Dichas cavidades van aumentando de tamaño yterminan colapsando violentamente, dando lugar a enormes presiones locales (de hasta1000 atmósferas o 10 Tm/cm2). Las consecuencias del colapso son: la célula se desintegra; si existe oxígeno en el líquido de suspensión, se forman peróxidos (como el H2O2); despolimerización de macromoléculas; cortes en ambas hebras del ADN. Las bacterias son variables en cuanto a su susceptibilidad a las vibracionessonoras. En general, son más sensibles las Gram-negativas y más resistentes las Gram-positivas. Sin embargo, ante un tratamiento por ultrasonidos siempre cabe la posibilidadde que sobrevivan algunos individuos, por lo que este método no tiene utilidad para laesterilización. 20
  • 22. El uso habitual de los supra- y ultrasonidos en laboratorio es para la llamada“sonicación” o disrupción ultrasónica de células para obtener extractos celulares, eninvestigaciones bioquímicas. El tratamiento se realiza en un aparato llamado generadorde ultrasonidos o “sonicador”, que opera en un rango de frecuencias desde 9 hasta 100Kc/seg.7 EFECTO DE LA PRESIONHIDROSTATICA La mayor parte de las especies bacterianas de hábitats continentales no puedencrecer (e incluso mueren) cuando son sometidas a altas presiones (unos 600 Kg/cm2).Ello se debe a los siguientes efectos adversos: aumento de la viscosidad del citoplasma; disminución de la capacidad de las enzimas de unirse a sus respectivos sustratos; interferencia en la división celular: las bacterias se alargan, se filamentan, pero sin producción de tabique transversal (crecimiento sin división celular).Sin embargo, existen bacterias (sobre todo marinas) que toleran o requieren altaspresiones (barotolerantes y barófilas, respectivamente): Bacterias barotolerantes: Crecen a la presión atmosférica, pero aguantan hasta unas 500 atmósferas. Su hábitat son las aguas oceánicas, entre los 2000 y los 4000 metros de profundidad. Bacterias barófilas: Crecen óptimamente a más de 400 atmósferas. Podemos distinguir entre barófilas moderadas (facultativas) y barófilas extremas (obligadas): Las barófilas moderadas son aquellas bacterias que pueden crecer a presión atmosférica, aunque su óptimo está a unas 400 atmósferas. Habitan profundidades entre los 5000 y 7000 metros. Las barófilas extremas presentan óptimos de crecimiento a muy altas presiones (por encima de 600-700 atmósferas), y son incapaces de crecer a presión atmosférica. Se han llegado a aislar a más de 10000 metros de profundidad. Debido a que a esas profundidades la temperatura del agua es de sólo 2-3oC, suelen ser simultáneamente criófilas. Este tipo de bacterias está empezando a ser investigado actualmente, y su manejo es engorroso, ya que hay que cultivarlas en cámaras especiales presurizadas que suministran las altas presiones que requieren.Aplicación práctica de las altas presiones a bacterias barosensibles: La llamada prensa de French (que frecuentemente se denomina incorrectamentecomo “prensa francesa”) es un aparato de laboratorio que permite aplicar grandespresiones y brusca descompresiones, lo que logra la rotura mecánica de las bacterias,con objeto (al igual que la sonicación) de obtener extractos libres de células. 21
  • 23. 8 EFECTOS DE LA PRESIÓNOSMÓTICA(Repasa en el capítulo 11 el concepto de potencial de agua o actividad de agua, aw) Exceptuando los micoplasmas, que carecen de pared celular, las bacteriaspueden vivir en medios tanto hipotónicos como hipertónicos, debido a la protección deuna pared celular rígida y a la membrana citoplásmica semipermeable.Normalmente el citoplasma de las bacterias poseen una osmolaridadligeramente superior a la del entorno, lo que garantiza el paso de agua alinterior. La presión de turgor es relativamente constante porque la membranacitoplásmica se topa con la rigidez de la pared celular. Esta presión de turgorpermite que la bacteria aguante cambios bruscos de concentración de solutosen su entorno (dentro de ciertos límites). Pero esto plantea una pregunta (queintentaremos responder a continuación): ¿cómo logra la bacteria ajustar suosmolaridad interna a esos cambios exteriores?A) En medios hipotónicos (con una aw>aw del citoplasma) es la pared celular la queejerce todo el papel: su rigidez se opone a la entrada de agua, y por lo tanto, evita que lamembrana citoplásmica tienda a sufrir una presión de turgor excesiva.B) En medios hipertónicos (cuando la aw del exterior es menor que la del citoplasma).Las bacterias poseen mecanismos compensatorios por los que tienden a aumentar laosmolaridad interior por encima de la del medio (para garantizar la entrada de agua delambiente y mantener su metabolismo). Ello se logra esencialmente aumentando laconcentración de un soluto muy soluble en agua en el interior celular, soluto llamadogenéricamente soluto compatible, lo cual se puede lograr por varios posiblesmecanismos: bombeando iones al interior; sintetizando una molécula orgánica osmóticamente activa; bombeando sustancias osmoprotectoras.1) En el caso de los iones, el ión bombeado suele ser el potasio (K+), por un sistema de antiporte K+/H+.2) Como ejemplos de síntesis de solutos orgánicos compatibles y osmóticamente activos tenemos el glutamato, la glutamina y la trehalosa. En levaduras es frecuente que el soluto compatible sea un poliol (sorbitol, manitol, etc.). Ahora bien, si el medio es muy hipertónico, estos mecanismos ya son incapaces de evitar la salida de agua desde el citosol, lo cual conlleva una retracción de la membrana citoplásmica. La pérdida de agua puede suponer la deshidratación del citoplasma, lo que conlleva la detención del crecimiento. En Gram-positivas se produce una plasmolisis auténtica (retracción de la membrana citoplásmica respecto de la pared rígida suprayacente) 22
  • 24. En Gram-negativas no existe auténtica plasmolisis, ya que la pared celular y la membrana citoplásmica se retraen al mismo tiempo. Las bacteria entéricas crecen lentamente por encima de 0.65M de NaCl.3) Sin embargo, las bacterias pueden crecer a osmolaridades superiores a la máxima teórica, si en el medio existen determinados compuestos llamados osmoprotectores. La bacteria bombea esos compuestos a su interior, usándolos como solutos compatibles. Ejemplos de osmoprotectores exógenos que pueden ser bombeados al interior celular: Prolina (p. ej., en Salmonella typhimurium y Staphylococcus aureus) Betaína (glicínbetaína), un derivado trimetilado de la glicocola (en cianobacterias y en algunas Gram-positivas). Colina (en Escherichia coli). Ectoína en enterobacterias.Por ejemplo, S. typhimurium crece muy lentamente en 1M de ClNa, peromejora si al medio se añade 1mM de prolina. Un método normal de aislarS.aureus es comprobar el crecimiento en medio con 7.5% de ClNa enpresencia de prolina.Existen ciertos microorganismos especializados que viven en medios hipertónicos, y engeneral se llaman osmófilos. Entre los osmófilos podemos distinguir los sacarófilos ylos halófilos. Uno de los mejores ejemplos de microorganismos sacarófilos no es una bacteria, sino las levaduras, que viven en jugos vegetales, néctares, zumos, etc. Utilizan como solutos compatibles polioles como el sorbitol, el ribitol, etc. Entre los organismos halófilos, podemos distinguir los halófilos moderados y los halófilos extremos o hiperhalófilos. Halófilos moderados: suelen ser bacterias marinas (ej.: Vibrio fischeri) que viven en 3.5% de NaCl, y que ven inhibido su crecimiento a concentraciones mayores o menores de sales. Los halófilos moderados tienen requerimientos concretos de una a w equivalente a la de agua de mar, así como concentraciones determinadas de iones Na +. El papel jugado por este Na+ es: mantenimiento de los sistemas de membrana citoplásmica y transporte; estabilización de la pared celular; requerimiento por parte de muchas enzimas. Halófilos extremos (hiperhalófilos), representados paradigmáticamente por las arqueas del género Halobacterium, que viven en (y de hecho requieren) concentraciones saturantes de sales (salitrales, lagunas salinas). Usan como soluto compatible el K+, concentrándolo a partir del medio donde viven, hasta que el citoplasma queda prácticamente saturado con él (4 a 7 M). Esta gran concentración de potasio es esencial para mantener la estabilidad y actividad de sus ribosomas, enzimas y sistemas de transporte. Pero las estructuras superficiales de estas arqueas requieren altas concentraciones de cloruro sódico. 23
  • 25. Dejando aparte las bacterias halófilas, hay algunas bacterias halotolerantes(como por ejemplo, Staphylococcus aureus), pero la inmensa mayoría de los procariotasviven a valores de actividad de agua de 0.98. Por ello, un método que ya se conocíaempíricamente en la antigüedad para conservar ciertos alimentos era el desecarlos osalarlos, o añadirles grandes cantidades de azúcar (como en las mermeladas).9 EFECTO DEL pHLa mayoría de las bacterias pueden crecer dentro de un margen de pH de su medio,manteniendo al mismo tiempo su pH interno óptimo prácticamente constante.Por ejemplo, Escherichia coli puede crecer bien entre pH 6 y pH 8, pero su pHinterno es siempre 7.6 o muy cercano a ese valor.Respecto del margen normal de pH a los que crecen las bacterias, éstas se puedenclasificar en: Neutrófilas, si crecen de modo óptimo en torno a la neutralidad (entre pH 5.5 y 8). Acidófilas, si crecen normalmente entre pH 0 y pH 5. Alcalófilas, si crecen entre pH 8.5 y pH 11.5. La mayor parte de las bacterias son neutrófilas. Muchas bacterias neutrófilasmodifican el pH del medio, y resisten entornos relativamente ácidos o alcalinos. Porejemplo, algunas bacterias fermentativas excretan ácidos, mientras otras alcalinizan elmedio, p. ej., produciendo amonio a partir de desaminación de aminoácidos. Por otrolado, la mayor parte de los hongos y levaduras requieren pHs ligeramente ácidos (entorno a 4-5). Aunque los microorganismos pueden crecer en un margen más o menos ampliode pH (alrededor de un óptimo), los cambios bruscos pueden ser lesivos (afectando a lamembrana y al transporte de solutos, e inhibiendo enzimas). Si el pH citoplásmico caerápidamente hasta 5 o menos, la bacteria puede morir. Uno de los mecanismos que, al menos en neutrófilos parece controlar el pHinterior es un sistema de antiporte H+/K+: a pH ácidos, el interior celular puede quedaren principio más alcalino que el exterior. Este sistema introduce protones en el interior ysaca iones potasio. De esta manera neutralizan el pH interior y siguen teniendo unpotencial de membrana para establecer una fuerza protón motriz que les suministreenergía. Si el pH interior cae en torno a 6 o 5.5, bacterias como E. coli o S. typhimuriuminducen una respuesta de tolerancia a ácidos, consistente en ATPasas translocadoras deprotones (expulsan protones al exterior) y chaperonas (proteínas celadoras) para corregirlas proteínas desnaturalizadas. Existen algunos notables procariotas cuyo pH óptimo es muy bajo (acidófilosextremos u obligados): Algunas eubacterias del género Thiobacillus (T. thiooxidans, T.ferrooxidans) y las arqueas de los géneros Sulfolobus, Thermoplasma y Ferroplasma 24
  • 26. tienen su óptimo a pH 2, y generan ellas mismas estos bajos pH al oxidar sulfuros hastaácido sulfúrico. (Sulfolobus es un Secciones un termoacidófilo). De hecho, estasbacterias necesitan esas altas concentraciones de H + para mantener la integridad de susmembranas y envueltas: a pH neutro esas envueltas se desintegran. Una arqueasorprendentemente acidófila es Picrophilus oshimae, cuyo pH óptimo es nada menosque 0.7 (aparte de que es una termófila que necesita temperaturas de más de 60ºC). Las especies alcalófilas obligadas tienen óptimos de pH en torno a 10-11. Porejemplo, Bacillus alcalophilus , cuyo pH interno es de 9. Sus hábitats típicos son sueloscarbonatados y lagunas alcalinas (algunos son también halófilos, comoNatronobacterim gregoryi). Estos organsimos tienen gran interés industrial, porque deellos se obtienen enzimas hidrolíticas como proteasas y lipasas que se usan comoaditivos en detergentes. 25